Avaliação da função Microvascular de tecido adiposo humano usando tele-microscopia

O objetivo geral desta técnica de videomicroscopia é examinar as propriedades funcionais de microvasos isolados em resposta a estímulos farmacológicos e fisiológicos, fornecendo informações sobre a fisiopatologia e os mecanismos moleculares que contribuem para a disfunção vascular em humanos. Este método é útil para entender os mecanismos moleculares que contribuem para a disfunção da microvasculatura local dentro da gordura, que tem sido associada a doenças sistêmicas. As principais vantagens desta técnica são que os vasos sanguíneos permanecem funcionais após a remoção do corpo humano por um período de tempo e são facilmente examinados quanto às suas propriedades fisiológicas.

A relevância clínica dessa abordagem experimental é que ela nos permite identificar vias que são alteradas diferencialmente em condições de doença e potencialmente descobrir novos alvos terapêuticos. Sob um microscópio de dissecação de tecidos, use microtesouras e microfórceps para remover cuidadosamente a gordura circundante e o tecido conjuntivo das pequenas artérias dentro da amostra adiposa. É essencial distinguir as artérias das vênulas.

As artérias são tipicamente menores em diâmetro, demonstram um tônus maior e respondem de forma mais robusta do que as vênulas. Quando a artéria estiver isolada, use suturas de náilon ou seda para amarrar quaisquer ramos. Em seguida, use uma seringa de 10 mililitros para encher lentamente o tubo com solução de Krebs fresca.

Em seguida, conecte tubos de borracha aos reservatórios de pressão e pipetas capilares de vidro dentro da câmara. Em seguida, mova a artéria dissecada para a câmara do órgão e canule o vaso para as pipetas capilares de vidro. Prenda cuidadosamente ambas as extremidades da artéria nas pipetas com suturas de náilon.

Quando o recipiente estiver seguro, remova lentamente o tampão Krebs da câmara e adicione dois mililitros de solução fresca de Krebs à câmara. Em seguida, conecte a câmara do órgão ao estágio de um microscópio invertido equipado com uma câmera de vídeo. Ligue o software de detecção de borda a uma taxa de amostragem de um kilohertz.

Conecte a tubulação pressurizada restante ao segundo reservatório de pressão cheio de solução Krebs e, em seguida, conecte os reservatórios de pressão ao transdutor de pressão. Quando toda a tubulação estiver conectada, ajuste o bloco de aquecimento para 37 graus Celsius. Em seguida, use a unidade de controle de pressão para aumentar gradualmente a pressão intraluminal para cinco mililitros de mercúrio a cada cinco minutos para atingir a pressão experimental apropriada dentro do lúmen do vaso sanguíneo isolado.

Deixe o vaso se equilibrar por 20 a 30 minutos quando a pressão atingir 60 mililitros de mercúrio e registre o diâmetro da artéria adiposa em repouso. No final do período de equilíbrio, pré-contraia o vaso sanguíneo a aproximadamente 55% do diâmetro basal em repouso, adicionando um microlitro de endotelina 1 diretamente ao banho a cada cinco minutos até que o diâmetro do vaso tenha sido adequadamente contraído. Para vasodilatação dependente endotelial induzida por fluxo, induza o fluxo contínuo para o espaço intraluminal da artéria em direções iguais e opostas, de modo que uma diferença de pressão possa ser desenvolvida através do vaso sem alterar a pressão intraluminal média de 60 milímetros de mercúrio.

Após três a cinco minutos, meça a dilatação mediada por fluxo. Aumente cada incremento de gradiente de pressão em 10 centímetros de troca de água a cada cinco a seis minutos até um máximo de 100 centímetros de água. Depois de avaliar a dilatação do vaso mediada por fluxo, retorne os reservatórios de pressão à mesma altura para interromper a indução do fluxo.

Em seguida, imediatamente, mas com cuidado, substitua a solução da câmara por solução de Krebs fresca sem perturbar a artéria suspensa e permita que o vaso comece a retornar ao diâmetro basal por 20 a 30 minutos. Uma vez que a artéria tenha retornado ao diâmetro basal de repouso, uma vasodilatação dependente endotelial mediada por colina sutil pode ser avaliada. Isso começa com a pré-constrição do vaso a aproximadamente 55% de seu diâmetro de repouso com endotelina 1, conforme demonstrado anteriormente.

Uma vez alcançada a pré-constrição, adicione dois microlitros de doses crescentes de acetilcolina diretamente ao banho. Registre a alteração no diâmetro arterial cinco minutos após a administração de cada dose. Após a conclusão da resposta à dose de acetilcolina, avalie a vasodilatação independente do endotélio e a viabilidade do vaso pela administração sequencial de papaverina e vasodilatador independente do endotélio diretamente no banho.

As respostas de vasodilatação dependentes do endotélio ao aumento do fluxo e estresse absoluto ou acetilcolina são significativamente embotadas nas artérias adiposas viscerais versus subcutâneas na obesidade humana. A vasodilatação independente do endotélio em resposta à papaverina, no entanto, não é alterada diferencialmente entre os dois diposes, sugerindo que a disfunção vascular nos domínios viscerais é em grande parte resultado da disfunção no nível do endotélio, pelo menos nos estágios iniciais da doença. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em três a cinco horas, se executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de levar o seu tempo e ser diligente, pois mesmo pequenos danos aos vasos sanguíneos podem distorcer os resultados. Após este procedimento, outros métodos, como a transfecção de siRNA dos vasos sanguíneos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o impacto de genes específicos na função vasomotora em doenças humanas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do tecido adiposo e microcirculação explorarem o impacto do microambiente do tecido adiposo na saúde vascular local na obesidade humana.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sondar diretamente a fisiopatologia de segmentos inteiros intactos de vasos sanguíneos humanos, que são removidos de indivíduos vivos, um processo que não pode ser replicado por imagens não invasivas.