Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Biologia do Tecido Adiposo, como a forma como diferentes componentes do Tecido Adiposo interagem em um tecido inteiro. A principal vantagem desta técnica é que ela remove totalmente o excesso de lipídios armazenados no tecido adiposo, mantendo sua arquitetura tridimensional. Embora este método possa fornecer informações sobre a organização tridimensional do tecido adiposo, ele também pode ser aplicado a outros tecidos com alto teor de lipídios, como glândula de memória e linfonodo.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de delipidação e limpeza requerem tempos de incubação suficientes, o que pode ser difícil de determinar. Comece usando uma pinça de ponta romba para dissecar a almofada de gordura de interesse de um modelo animal recém-perfundido. Remova cuidadosamente toda a almofada da moda sem beliscar ou apertar o tecido ou contaminar o tecido dissecado com pelos.

Coloque a almofada de gordura em aproximadamente 10 mililitros de solução de fixação em um tubo cônico de 15 mililitros e pós-fixação a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, após lavar a amostra com PBS, remova cuidadosamente quaisquer detritos da amostra sob um microscópio de dissecação. Cabelos, fiapos ou outros detritos presos à amostra causarão sombras durante a geração de imagens.

Transfira a amostra limpa para um tubo de polipropileno contendo tampão B1N a 20% de metanol gelado. Coloque o tubo contendo a amostra horizontalmente em um agitador orbital, ajuste-o para 100 RPM e agite por 30 minutos a 1 hora, dependendo do tamanho da amostra. Certifique-se de que as amostras possam se mover livremente dentro do tubo.

Continue desidratando as amostras por meio de uma série graduada de 40%, 60% e 80% de metanol em tampão B1N, seguido de 100% de metanol. Minimize a solução de transferência. Após a desidratação, substitua a solução 100% metanol por 100% de diclorometano ou DCM para deslipidar a amostra.

Repita a lavagem duas vezes seguindo os tempos de incubação listados na tabela 2. A amostra deve afundar no fundo do tubo no final da segunda e terceira lavagens do DCM. Caso contrário, estenda o tempo de incubação para garantir a delipidação total.

Após a delipidação, lave duas vezes com metanol a 100% pelo tempo indicado na tabela 2. Reidrate a amostra em uma série de tampão B1N de metanol invertido pelos tempos indicados na tabela 2. Após a reidratação, lave a amostra com tampão PTXWH por 2 horas em temperatura ambiente.

A amostra agora está pronta para imunocoloração ou pode ser armazenada em tampão PTXWH a 4 graus Celsius por até 1 ano. Primeiro, dilua o anticorpo primário em tampão PTXWH até a concentração recomendada. Em seguida, centrifugue a solução diluída de anticorpos a 20 mil g durante 10 minutos para evitar a introdução de precipitados ou agregações de anticorpos.

É importante escolher anticorpos primários adequados que sejam compatíveis com o tratamento com metanol e DCM. Novos anticorpos devem ser validados com pequenos pedaços de tecido ou com seções de tecido tratadas com metanol. Incubar a amostra deslipidada com a solução primária de anticorpos durante 3 a 5 dias, dependendo do tamanho da amostra.

Após a incubação primária, lave a amostra com várias trocas de tampão PTXWH. No dia seguinte, dilua o anticorpo secundário em tampão PTXWH até a concentração recomendada. Centrifugue a solução diluída de anticorpos como antes.

Incubar a amostra com a solução de anticorpos secundários durante 3 a 5 dias, dependendo do tamanho da amostra. Novamente, lave a amostra com tampão PTXWH em uma série de etapas de incubação como antes. No dia seguinte, lave a amostra com 1XPBS por 5 minutos, 10 minutos e depois 30 minutos.

Incorpore o tecido adiposo em agarose para facilitar a montagem da amostra para microscopia de folha de luz. Primeiro, prepare a solução de incorporação com 1% de agarose em 1XPBS. Resfrie a solução de incorporação a cerca de 40 graus Celsius para evitar expor a amostra ao calor excessivo.

Evitando o transporte de líquidos, coloque a amostra de tecido limpo em um molde e arrume-a na posição desejada. Em seguida, despeje suavemente a solução de incorporação sobre a amostra, evitando bolhas de ar. Quaisquer bolhas de ar devem ser movidas para a periferia antes que a agarose se solidifique.

Quando a agarose estiver totalmente solidificada, corte um bloco contendo a amostra. Transfira a amostra para 25% de metanol em água, proteja da luz e incube com agitação pelo tempo mostrado na tabela 2. Continue desidratando a amostra através de um gradiente de metanol.

Incube a amostra em 100% DCM por 1 hora com agitação. DCM As amostras lavadas secam facilmente ao ar, o que afetaria a clareza da amostra e resultaria em imagens borradas. É importante transferir amostras rapidamente para uma solução nova para evitar a dessecação.

A amostra deve afundar no fundo do tubo no final de cada lavagem DCM. Incubar a amostra em éter dibenzílico ou DBE durante a noite com agitação suave para obter correspondência do índice de refração. A amostra acabará se tornando luz transparente e invisível.

No dia seguinte, após incubar a amostra com DBE fresco com agitação suave por 2 horas, armazene a amostra em temperatura ambiente no escuro ou prossiga diretamente para a imagem. Para obter imagens da amostra com um microscópio de folha de luz compatível com DBE, monte a amostra incorporada de agarose em um suporte que possa impedir o movimento durante a imagem. Para obter a imagem da amostra com um microscópio confocal invertido ou de dois fótons, coloque a amostra embebida em agarose em uma lâmina de câmara com fundo de vidro.

A varredura de uma almofada de gordura subcutânea posterior usando um microscópio de folha de luz com baixa ampliação mostra a organização lobular dos adipócitos. Informações mais detalhadas, como o tamanho dos adipócitos, podem ser reveladas ampliando as regiões de interesse com maior ampliação. Uma almofada de gordura subcutânea posterior corada com tirosina hidroxilase, um marcador para o sistema nervoso simpático, foi visualizada por microscopia de florescência de folha de luz.

A coloração TH revelou estruturas que aparecem como grandes feixes nervosos, conforme indicado pela seta aqui. A inervação dos vasos sanguíneos, bem como a arborização terminal densa no parênquima tecidual, também são reveladas pela coloração HT. Usando a molécula de adesão de células endoteliais plaquetárias ou PCAM1, também conhecida como CD31, como um marcador para marcar os vasos sanguíneos, observa-se que todos os adipócitos estão em contato com os capilares em todo o tecido, suportando a alta demanda por troca eficiente de nutrientes e oxigênio no tecido adiposo.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da Biologia Adiposa explorarem questões adicionais, como morfogênese tecidual precoce e mapeamento do destino de progenitores de adipócitos. Também pode ser aplicado para estudar a histologia do tecido adiposo humano. Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído, metanol, diclorometano e éter dibenzílico pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de capela e equipamento de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.