Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר מונוקולטורות כמו אסטרוציטים בשיטה פשוטה, מהירה וחסכונית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האסטרוגליביולוגיה, כגון מהי הכלכלה של שחרור או קליטה פיזית של אסטרוציטים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתאים המתקבלים דומים מאוד לאסטרוציטים in vivo על ידי מורפולוגיה, ביטוי mRNA וחלבון, ותנודות סידן בין-תאיות.

כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את אזור הדיסקציה על ידי הנחת שתי צלחות פטרי בגודל 10 ס"מ מלאות במדיום דיסקציה על קרח במכסה מנוע למינארי. עבור כל אזור במוח שיש לבודד, הכינו צינור של 15 מ"ל מלא ב-14 מ"ל של מדיום דיסקציה והמשיכו על קרח. לאחר מכן, רססו את כלי החיתוך באתנול 70% והניחו אותם ליד מיקרוסקופ הדיסקציה במכסה המנוע.

אם עובדים עם רקמה עוברית, הוציאו תחילה את העוברים מהרחם ופתחו את השקים העובריים. מיד חותכים את הראשים במספריים. כאשר כל הראשים מנותקים, העבירו אותם למדיום חיתוך מקורר מראש.

לאחר שהראשים שקועים במדיום, פתחו את העור והגולגולת בעזרת מלקחיים וצבטו את המוח הקטן. לאחר מכן מנף בזהירות את שאר המוח למעלה והחוצה מהגולגולת. לאחר מכן, הפרד את קליפת המוח מהמבנה הבסיסי של המוח האמצעי.

הנח את המלקחיים בתוך הסדק האורכי בין ההמיספרות והעבר אותם בין מבני קליפת המוח והמוח האמצעי של חצי כדור אחד כדי לצבוט כל חצי כדור חופשי. לאחר מכן, הסר את כל קרומי המוח מכל חצי כדור והפריד את ההיפוקמפוס. אם נדרשים אסטרוציטים בהיפוקמפוס, העבירו כל היפוקמפוס לצינור של 15 מ"ל מלא ב-14 מ"ל של מדיום דיסקציה על קרח.

לאחר מכן, חותכים כל רקמה בקליפת המוח שתשמש לייצור אסטרוציטים לחתיכות שאינן גדולות ממיליליטר מעוקב אחד. לאחר מכן אוספים את כל חלקי הרקמה בקליפת המוח בצינור נפרד של 15 מ"ל מלא במדיום דיסקציה על קרח. לאחר איסוף כל חלקי הרקמה, המתן עד שהם יתייצבו בתחתית הצינור.

לאחר מכן שאפו כמה שיותר מדיום. לאחר מכן, הוסיפו 2-3 מ"ל של 0.05% טריפסן EDTA ודגרו את הדגימות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך עשרים דקות. לאחר מכן, שאפו בזהירות את ה-EDTA של הטריפסן והשאירו חתיכות רקמה בכמות מינימלית של נוזל בתחתית הצינור.

לאחר מכן, הוסף 5 מ"ל של מדיום דיסקציה מקורר מראש כדי לשטוף את שארית ה-EDTA והפיפטה לצד הצינור העליון כדי להשיג ערבוב של חלקי הרקמה. לאחר מכן, שאפו את מדיום הדיסקציה והשאירו את חתיכות הרקמה בכמה שפחות נוזלים. חזור על שלב כביסה זה עם מדיום חיתוך מקורר מראש פעמיים.

לאחר שלב הכביסה האחרון, הוסיפו 1 מ"ל של D-Mem Plus בטמפרטורת החדר, וטריטו את הרקמה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מבלי להכניס בועות. אסטרוציטים רגישים למדי ל-pH, ולכן חשוב להימנע מיצירת בועות מכיוון שהדבר עלול לשנות את ה-pH של התמיסה. לאחר מכן, הנח מסננת תאים של 100 מיקרון בפתח צינור של 50 מ"ל והרטיב מראש את המסנן ב-4.5 מ"ל עם D-Mem Plus מקורר מראש.

פיפטה 1 מ"ל של תרחיף הרקמה המנותקת על מסננת התאים והוסף עוד 4.5 מ"ל של D-Mem Plus מקורר מראש כדי לשטוף את התאים דרכו. ביום במבחנה שבע לאחר הדיסקציה, הניחו את הכלים בגודל 10 ס"מ עם תאים ב-D-Mem Plus על שייקר בחממה ונערו את הכלים ב-110 סל"ד למשך 6 שעות. 20 עד 30 דקות לפני תום שש שעות הרעידות, יש לחמם מראש 1 XPBS, D-Mem Plus, NB+H ו-0.25% טריפסן EDTA ל-37 מעלות באמבט המים.

לאחר 6 שעות של טלטול, הסר את כלי התרבות מהשייקר והחלף מיד את המדיום ב -10 מ"ל של 1 XPBS מחומם מראש למנה. לאחר מכן, הסר PBS והוסף 3 מ"ל של טריפסן EDTA מחומם מראש למנה. לאחר מכן דגרו את הדגימות למשך ארבע דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

אם מכינים דגימות לריצוף Western Blot או RNA, אל תוסיפו Tripsen EDTA. במקום זאת, החלף את ה-PBS ב-12 מ"ל של NB+H מחומם מראש, ולאחר מכן ניתן להחזיר תרביות לחממה. לאחר מכן, הוסיפו 5 מ"ל של D-Mem Plus מחומם מראש ל-3 מ"ל של טריפסן EDTA בכל מנה.

שלפו את התאים מהצלחת ואספו את תרחיף התאים בצינור של 50 מ"ל. לאחר מכן, צנטריפוגה את מתלה התאים ב -3220 פעמים G ב -20 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את חיך התא ב-1 מ"ל של NB+H מחומם מראש.

תמונות אלה מראות שאסטרוציטים של אוסאם שעברו התמרת G-camp מציגים אירועי יוני סידן ספונטניים בכל רשתות האסטרוציטים, כולל בתהליכים הדקים. כאן, גל יוני סידן עובר דרך כמה אסטרוציטים משמאל לימין בתמונות של נקודות זמן שונות, כאשר צבע בהיר מתאר אזורים עם ריכוזי יוני סידן גבוהים ואזורים שחורים מייצגים אזורים תאיים נוספים. בגרף הזה, ריכוז יוני הסידן משתנה באזורים המקודדים בצבע לאורך זמן, שמוצגים כעקבות עוצמה פלואורסצנטית של G-camp, מה שממחיש כיצד גל איתות של יוני סידן מתפשט על פני כמה אסטרוציטים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה וחמש עשרה דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית תאי חיים בשילוב עם טרנספקציה או ניסויי התמרה ויראליים כדי לענות על שאלות נוספות כמו אילו אירועים מתרחשים בממברנות אסטרוציטים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להתכונן in vivo כמו תרבויות מוטוריות אסטרוציטים בצורה פשוטה, מהירה וחסכונית.