Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

O objetivo geral desta análise de RNASeq em amostras de larvas de peixe-zebra é identificar perfis de expressão gênica para embriões e larvas de peixe-zebra e fazer declarações comparativas quantitativas sobre mudanças na expressão gênica entre amostras. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em qualquer campo para o qual os embriões ou larvas de peixe-zebra são informativos, como a supressão de um gene alvo resulta em alterações na expressão gênica ou na interrupção de certas vias em relação a outras condições. A principal vantagem dessa técnica é que o peixe-zebra é passível de produção de um grande número de animais, e os dados do transcriptoma de animais inteiros podem ser facilmente obtidos.

Além disso, o isolamento de tipos específicos de células pode ser alcançado com facilidade usando a classificação de animais transgênicos. Demonstrando os procedimentos estarão Lain Hostelley, um estudante de pós-graduação, e Jessica Nesmith, uma pós-doutoranda do meu laboratório. Para começar, cultive embriões até os três meses de idade, que é a maturidade reprodutiva.

Separe dois machos adultos e três fêmeas da cepa desejada em tanques de acasalamento divididos de água doce do sistema na noite anterior à coleta de embriões. Na manhã seguinte, depois que as luzes se acenderem, remova a divisória e deixe os peixes acasalarem naturalmente até que os embriões sejam observados no fundo do tanque. Coletar embriões em intervalos de 30 minutos em placas de Petri separadas de meio embrionário até que o número desejado seja coletado.

Para estadiar os embriões, cultive-os em grupos de 50 a 75 por placa de Petri de 10 centímetros para promover um tempo de desenvolvimento consistente de todos os embriões. Em seguida, mantenha as placas a 28,5 graus Celsius. Meça a idade do embrião usando o número de somito após a segmentação até aproximadamente 24 horas após a fertilização, ou HPF, e separe os embriões com base na idade de desenvolvimento.

Após a eutanásia dos embriões no estágio desejado de acordo com o protocolo de texto, transfira um pool de 20 embriões para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulado. Em seguida, remova qualquer excesso de meio embrionário do tubo de microcentrífuga. Adicione 200 microlitros de reagente de lise ao tubo.

E use um pilão para homogeneizar mecanicamente os embriões. Em seguida, adicione mais 800 microlitros de reagente de lise para elevar o volume total para um mililitro. Para extrair o RNA, adicione reagente de lise à amostra coletada e incube-a em temperatura ambiente por 5 minutos.

Adicione 0,2 mililitros de clorofórmio para cada 1 mililitro de reagente de lise usado e inverta os tubos manualmente por 15 segundos. Depois de incubar as amostras à temperatura ambiente durante dois a três minutos, centrifugar as amostras a 12 000 vezes G e a 4 graus Celsius durante 15 minutos. Transfira a fase aquosa separada para um tubo novo e adicione 0,5 mililitros de isopropanol para cada 1 mililitro de reagente de lise usado.

Depois de incubar os tubos à temperatura ambiente por 10 minutos, centrifugue as amostras por 10 minutos. Em seguida, adicione 75% de etanol ao RNA e centrifugue os tubos a 7.500 vezes G e 4 graus Celsius por 5 minutos. Remover completamente o sobrenadante e deixar a amostra secar ao ar à temperatura ambiente.

Em seguida, ressuspenda o RNA em 15 a 30 microlitros de água tratada com DEPC. Para purificar o RNA de alta qualidade após extrair o pellet e lavar a amostra de acordo com o protocolo de texto, use um espectrofotômetro de absorção para testar o RNA extraído quanto à concentração e pureza. Certifique-se de que o valor de 260 sobre 230 seja cerca de 2,0 antes de enviar as amostras de RNA a um fornecedor ou corpo para análise de alteração de expressão gênica e RNASeq com base na quantificação de leituras de sequenciamento.

Para comparar uma única condição experimental com um controle, abra os dados de genes diferencialmente expressos em um software de gerenciamento de planilhas. Selecione a seta suspensa ao lado do botão de classificação e selecione a classificação personalizada na planilha. Na janela que aparece, selecione a caixa em coluna e escolha classificar pela coluna LFC.

Na coluna classificar em, verifique se os valores estão selecionados. Na coluna de ordem, selecione para classificar do maior para o menor e clique em OK. Para determinar genes diferencialmente expressos encontrados em duas condições experimentais, na planilha experimental versus controle, selecione a primeira célula em uma coluna vazia.

Em seguida, digite a seguinte equação na célula. Pressione enter ou return para executar a equação. Selecione a célula que contém a equação e clique na caixa no canto inferior direito da célula.

Mantenha o mouse clicado e arraste a área selecionada até o fim da coluna até selecionar o último ID de feição para copiar a equação em cada célula da coluna. Selecione a classificação personalizada novamente e adicione um segundo nível de classificação clicando no ícone de adição no canto inferior esquerdo. No primeiro nível, classifique por, na coluna, selecione duplicar.

Em classificar em, selecione valores e, em ordem, selecione Z para A.In o segundo nível e, em seguida, em coluna, selecione LFC. Em classificar em, selecione valores e, em ordem, selecione do maior para o menor e selecione ok. Para remover os parênteses da coluna de símbolos de genes antes de continuar, selecione toda a coluna que contém os símbolos de genes.

Selecione editar e substitua no menu suspenso do arquivo. Digite parênteses abertos, estrela, parênteses fechados, na barra localizar qual da janela de substituição e alugue a barra de substituição com vazia. Selecione Substituir tudo para remover todas as instâncias de parênteses.

Para determinar as vias enriquecidas, copie os símbolos de genes desejados para a área de transferência. Vá para ConsensusPathDB e selecione a análise do conjunto de genes na barra lateral esquerda da página da web, seguida pela análise de super-representação. Na caixa colar uma lista de identificadores de genes e proteínas, cole a lista de genes.

Selecione o símbolo do gene na caixa de tipo de identificador de gene/proteína e clique em continuar. Na seção conjuntos baseados em caminhos, marque a caixa ao lado de caminhos conforme definido pelos bancos de dados de caminhos. Selecione localizar conjuntos enriquecidos para obter a lista de vias que contêm genes na lista de entrada.

Selecione todos os caminhos enriquecidos para visualizar em uma rede de caminhos selecionando cada caixa ao lado dos nomes dos caminhos ou, em selecionar no cabeçalho da coluna acima das caixas de seleção, clique em todos. Em seguida, selecione visualizar conjuntos selecionados. Ajuste os filtros de sobreposição relativa e candidatos compartilhados marcando uma das caixas na parte superior central da página e inserindo a porcentagem desejada, a sobreposição relativa ou o número de candidatos compartilhados e selecione aplicar.

Para determinar as ontologias de genes enriquecidos, copie os símbolos de genes do respectivo grupo para a área de transferência. Vá para a ferramenta de análise de enriquecimento GO no Gene Ontology Consortium. No lado esquerdo da página, abaixo de seus IDs de genes, cole a lista de símbolos de genes na caixa.

Abaixo da caixa de IDs de genes, selecione o termo go, processo biológico. Em seguida, selecione danio rerio abaixo da caixa go terms e clique em enviar. Realize o QRT PCR e compare com o RNASeq, de acordo com o protocolo de texto.

O sequenciamento do RNA extraído de larvas injetadas com Morpholinos contra alms1 ou bbs1 revelou os genes que foram regulados exclusivamente para cima e para baixo nos modelos Alstrom e BBS, bem como os genes que foram significativamente alterados em ambos os modelos. Para elucidar mais claramente o perfil molecular do modelo de Alstrom, foram identificadas as vias e ontologias gênicas enriquecidas nos genes diferencialmente expressos. Como mostrado aqui, 31 vias totais foram reguladas positivamente.

Além do amplo agrupamento de metabolismo, as vias mais afetadas foram o sistema imunológico inato e adaptativo, com 32 e 20 genes, respectivamente. Os eventos de sinalização do receptor de células B a jusante também foram enriquecidos. Várias vias de sinalização também foram enriquecidas entre os genes regulados positivamente, consistentes com a associação da Síndrome de Alstrom com a disfunção primária do cílio.

Além disso, três vias associadas à secreção de insulina foram reguladas positivamente, ácidos graxos ligados ao GPR40, ácidos graxos livres e acetilcolina. Finalmente, seis termos GO foram enriquecidos entre os genes regulados positivamente no modelo de Alstrom, incluindo diferenciação de eritrócitos, homeostase de eritrócitos, homeostase de células mielóides e processos homeostáticos. Uma vez dominada, a análise do caminho e do termo GO pode ser feita em menos de uma hora.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a seleção de parâmetros de via e valores de corte são as considerações mais importantes na interpretação dos resultados das comparações de expressão de RNASeq. Após este procedimento, outros métodos, como aplicação com linhagens mutantes e análise de transcriptoma de tipos de células únicas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como perfil de transcriptoma de tipos de células e alterações na expressão gênica sob o controle de genes específicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar os dados transcriptômicos do peixe-zebra gerados pelo RNASeq para identificação de alterações significativas na expressão gênica entre amostras experimentais.