Name: Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a preparar amostras e analisar dados de expressão gênica por RNASeq em embriões e larvas de zebrafish. Este método permite identificar perfis transcriptômicos e comparar mudanças quantitativas entre condições experimentais.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A abordagem descrita no presente protocolo oferece uma estratégia relativamente rápida e econômica para a análise do transcriptoma-nível de animais inteiros ou populações de célula específica classificada. O peixe-zebra fornece um modelo de vantajoso para este tipo de estudo devido a facilidade e a rapidez na geração de grandes quantidades de começar o material, a facilidade de aplicação genética ou ambientais condições experimentais e a disponibilidade de um grande espectro de linhas transgénicas repórter permitindo iso...

Análise comparativa da expressão gênica global é uma ferramenta valiosa para identificar novos genes, contribuindo para fenótipos observados. Tais análises normalmente contam com avaliação quantitativa da abundância de transcrição em comparação entre experimental e amostras de controlo. Abordagens específicas, tais como qRT-PCR são relativamente rápida e exata para investigação de alterações de expressão de gene único. A sequenciação do ARN (RNASeq) oferece uma abordagem ampla, livre de hipótese para identificar alterações significativas na expressão gênica entre as amostras, tornando-se agora o padrão para tais investigações através de sistemas experimentais.
Zebrafish têm emergido como um modelo de destaque em várias áreas da doença. Originalmente desenvolvido para sua utilidade em estudos de biologia do desenvolvimento, devido a sua alta fecundidade e relativamente baixo custo de manutenção, utilização experimental de zebrafish evoluiu para incluir uma ampla gama de fenótipos de embrionárias para estágios adultos, bem como um ampla gama de molecular ensaios1,2,3. Com efeito, estas vantagens fazem estudos moleculares mecanicistas rápida e econômica, devido à facilidade de adquirir grandes quantidades de material combinado com a facilidade de manipulação genética e ambiental em todas as fases da vida. Além disso, a natureza transparente de zebrafish embriões e larvas tornam ideal para a geração de linhas de transgénicos repórter células e tecidos específicos permitindo visualização na vivo de populações de células discretas4. Exploração de tais linhas permite a análise da expressão de gene global em tipos específicos de célula isolada baseados na expressão do gene repórter.
Aqui nós apresentamos um protocolo completo para análise de expressão do gene global usando o RNASeq após a cultura de embriões de peixe-zebra. Manipulações genéticas experimentais, incluindo Morpholinos (MO)-knockdown com base transitória do gene ou genoma mediada por CRISPR edição, foram apresentadas em outro lugar5,6,7. Nós, portanto, concentrar-se em um protocolo detalhado para isolamento de RNA de embriões todo ou classificados células transgénicas repórter-expressando seguidas por simples análise computacional de RNASeq resultados usando ferramentas de caminho e gene ontology (GO) termos. Finalmente, nós incluímos uma estratégia para a validação das alterações de expressão do gene por transcriptase reversa quantitativo PCR (qRT-PCR). Estes protocolos são aplicáveis aos embriões de zebrafish, sujeitados a uma ampla gama de condições experimentais, incluindo comparação de mutantes genéticos ou condições ambientais.

<table><tbody><tr><td>Reagentes comerciais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriZol</td><td>Reagente de lise</td><td>de 15596026</td><td>Thermo Scientific</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>tampão de dissociação 1</td></tr><tr><td>FACSMax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>tampão de dissociação 2</td></tr><tr><td>Água tratada com DEPC</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Kit de conversão de cDNA FirstStrand</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1621</td><td>cDNA</td></tr><tr><td>2X SYBR Green Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>qRT-PCR Master Mix</td></tr><tr><td>FACS buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-105-9042</td><td></td></tr><tr><td>clorofórmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>acetato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td> Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Linhagens de Peixe-Zebra</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuebingen</td><td>ZIRC</td><td>ZL57</td><td></td></tr><tr><td>ins2a:mCherry</td><td>ZIRC</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 filtro de células de mícron</td><td>Sigma</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>tubo FACS</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>hemocitômetro</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tanques de acasalamento 1.0L Conjunto de tanques de cruzamento</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>tubo FACS 5 mL tubo de polipropileno</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consensus Path DB</td><td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GO Análise de Enriquecimento</td><td>http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação da amostra e análise de dados da expressão do gene rnaseq-baseado de zebrafish

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

A análise das alterações de expressão do gene global é uma ferramenta valiosa para identificar novos caminhos subjacentes fenótipos observados. O peixe-zebra é um excelente modelo para avaliação rápida do transcriptoma toda de populações de células individuais ou todo animal devido à facilidade de isolamento do RNA de um grande número de animais. Aqui apresenta-se um protocolo para análise de expressão de gene global em embriões de peixe-zebra usando a sequenciação do ARN (RNASeq). Descrevemos a preparação do RNA de embriões de todo ou de populações de células obtidas usando célula de triagem em animais transgénicos. Também descrevemos uma abordagem para análise de dados RNASeq para identificar caminhos enriquecidos e termos de Gene Ontology (GO) em conjuntos de dados de expressão de gene global. Finalmente, nós fornecemos um protocolo para a validação das alterações de expressão do gene usando transcriptase reversa quantitativo PCR (qRT-PCR). Esses protocolos podem ser usados para análise comparativa de controle e experimental de moda de zebrafish para identificar alterações de expressão do gene de romance e fornecem a introspecção molecular de fenótipos de interesse.

Classificação de diferencialmente expressos Genes:
Para identificar genes diferencialmente expressos na fase larval de zebrafish modelos de síndrome de Alström e síndrome de Bardet-Biedl (BBS), escolhemos a qualquer alms1 ou bbs1 transcrições injetando validados anteriormente da tala-MOs em bloqueio zebrafish do selvagem-tipo embriões16,17. Em 5 dias pós f...

Este protocolo apresenta uma abordagem para a análise do transcriptoma toda de zebrafish embriões, larvas, ou células de classificados. Nós incluímos o isolamento do RNA, análise de caminho de dados de RNASeq e validação de qRT-PCR-baseados de mudanças de expressão do gene.

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

O objetivo geral desta análise de RNASeq em amostras de larvas de peixe-zebra é identificar perfis de expressão gênica em embriões e larvas de peixe-zebra e fazer afirmações quantitativas comparativas sobre as alterações na expressão gênica entre amostras. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em qualquer área em que embriões ou larvas de peixe-zebra sejam informativos, como a forma pela qual a supressão de um gene alvo específico resulta em alterações na expressão gênica ou na interrupção de certas vias em relação a outras condições. A principal vantagem desta técnica é que o peixe-zebra é adequado para a produção de um grande número de animais, e dados do transcriptoma de organismos inteiros podem ser facilmente obtidos.Além disso, o isolamento de tipos celulares específicos pode ser realizado facilmente por meio da triagem de animais transgênicos. Demonstrando os procedimentos estarão Lain Hostelley, uma estudante de pós-graduação, e Jessica Nesmith, uma pesquisadora pós-doutora do meu laboratório. Para começar, cultive embriões até a idade de três meses, que corresponde à maturidade reprodutiva.Sequestre dois machos adultos e três fêmeas do linhagem desejad

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Genética

O isolamento de alta qualidade, RNA intacto é um passo essencial para muitos protocolos laboratoriais. Aqui, demonstramos extração de RNA a partir de embriões zebrafish todo e síntese de cDNA para posterior aplicação em vários procedimentos experimentais, incluindo análise de microarray gene de expressão.

Isolamento de RNA Síntese Zebrafish e cDNA embrionárias para Análise de Expressão Gênica

Gene microarrays são ferramentas poderosas no perfil de expressão gênica ao nível do genoma. Esta tecnologia tem aplicação em uma variedade de disciplinas biológicas, incluindo biologia do desenvolvimento e toxicologia. Neste vídeo, detalhamos um protocolo para análise global de expressão gênica utilizando uma plataforma de microarray abrangente de oligonucleotídeos para o peixe-zebra.

Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide

O artigo descreve um protocolo para gerar embriões de peixe-zebra por meio de acasalamento natural e classificação de seus estágios de desenvolvimento. O protocolo é usado ainda para análise de células β pancreáticas usando peixes transgênicos.

Acasalamento e estadiamento de ovos: um método para gerar embriões e classificá-los por estágio de desenvolvimento

Para analisar os perfis de expressão de genes cardíacos durante o desenvolvimento do coração de peixe-zebra, o RNA total foi de ser extraído do coração isolado. Aqui, apresentamos um protocolo para a coleta / corações batendo funcionais por um rápido esvaziamento manual a partir de embriões de peixes-zebra para obter mRNA específico cardíaca.

Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional

Este protocolo descreve um método para isolar células únicas de embriões de peixe-zebra, enriquecendo para células de interesse, capturando células de peixe-zebra em sistemas multiplex de célula única baseados em microfluídica e avaliando a expressão gênica de células únicas.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

Zebrafish recentemente foram usados como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação do ADN durante o desenvolvimento. Aqui está detalhado os protocolos para o uso de embriões de peixe-zebra para sincronismo de replicação de perfil. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tempo de replicação em mutantes, tipos de células individuais, modelos de doença e outras espécies.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

Apresentamos um protocolo para isolar os neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros sob condições fisiológicas e patológicas. Após o isolamento, RNA é extraído dessas células para analisar seu perfil de expressão do gene. Este protocolo permite para a coleção de RNA de alta qualidade para a realização de análise a jusante como qPCR e transcriptomics.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

Aqui, apresentamos um protocolo para tuberculose humana de modelo em um adulto zebrafish usando seu patógeno natural Mycobacterium marinum. Extraído DNA e RNA de órgãos internos de zebrafish infectado podem ser usado para revelar que o total micobacteriana carrega no peixe e as respostas de imune do hospedeiro com qPCR.

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

Zebrafish visando eletrófilos reativos e oxidantes (Z-REX) é um método baseado em biologia química para a investigação da sinalização de pequenas moléculas reativas. Esta técnica pode ser aplicada a peixes vivos de diferentes estágios de desenvolvimento. Aqui, acoplamos ensaios padrão em zebrafish com Z-REX para análise de vias de sinalização.

Monitoramento de respostas de sinalização no alvo em larvas de peixe-zebra - Z-REX desmascara mecanismos precisos de drogas eletrofílicas e metabólitos

Aqui, apresentamos um protocolo para marcar proteínas com uma etiqueta de proteína de fluorescência em larvas de peixe-zebra, um sistema in vivo recém-desenvolvido e modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baixa abundância em peixe-zebra.

Marcação de fluorescência para visualizar proteínas de baixa expressão em peixe-zebra

Aprenda a preparar amostras e analisar dados de expressão gênica por RNASeq em embriões e larvas de zebrafish. Este método permite identificar perfis transcriptômicos e comparar mudanças quantitativas entre condições experimentais.

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

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