Ensaio de captação de cálcio mitocondrial: um método baseado em leitor de placas para medir a captação de cálcio em mitocôndrias isoladas

As mitocôndrias absorvem cálcio citosólico, pois é essencial para seu bom funcionamento.

O influxo excessivo de cálcio na matriz mitocondrial - sobrecarga de cálcio mitocondrial - desencadeia a abertura de um canal interno da membrana, o poro de transição de permeabilidade mitocondrial, ou MPTP. O poro aberto permite o aumento do efluxo de cálcio das mitocôndrias, causando disfunção mitocondrial.

Para medir a absorção de cálcio mitocondrial, comece com uma placa de vários poços contendo mitocôndrias isoladas suspensas em um tampão adequado. Suplementar o poço com piruvato e malato, que são substratos produtores de ATP. Misture o conteúdo do poço e incuba.

Durante a incubação, o piruvato e o malato são convertidos em ATPs, energizando as mitocôndrias. Adicione uma solução contendo moléculas de corante fluorescente sensíveis ao cálcio e impermeáveis à membrana mitocondrial. Dispense o tampão contendo cálcio para as mitocôndrias energizadas.

Monitore a fluorescência de cálcio do corante à medida que as moléculas do corante se ligam ao cálcio livre no tampão.

Adicione mais íons de cálcio para iniciar o influxo de cálcio mitocondrial. O aumento gradual do cálcio mitocondrial diminui os íons de cálcio no tampão, reduzindo a fluorescência do cálcio do corante.

Uma vez que as mitocôndrias atingem sua capacidade máxima de transporte de cálcio, a adição adicional de íons de cálcio abre os canais MPTP e importa cálcio para o tampão. O tampão cálcio se liga às moléculas do corante, causando aumento da fluorescência do cálcio do corante.

Plote a fluorescência do corante em diferentes pontos de adição de cálcio para monitorar a cinética da absorção de cálcio mitocondrial.

Para iniciar a medição da captação de cálcio mitocondrial usando um leitor de placas, programe o leitor para realizar uma leitura cinética da fluorescência verde de cálcio-5N a cada segundo, por um tempo total de 1.000 segundos.

Programe os injetores de reagente para dispensar 5 microlitros de solução de cloreto de cálcio em vários momentos. Em seguida, prepare os injetores com a solução de cloreto de cálcio que será usada.

Em seguida, adicione 200 microgramas de mitocôndrias isoladas a um poço de uma placa de 96 poços e adicione o volume apropriado de tampão cloreto de potássio para atingir um volume total de 197 microlitros. Em seguida, adicione 1 microlitro de piruvato 1 molar, 1 microlitro de malato 500 milimolar e 1 microlitro de caldo verde de cálcio 1 milimolar-5N e misture delicadamente pipetando.

Incubar protegido da luz à temperatura ambiente por 2 minutos, para que as mitocôndrias fiquem energizadas. Por fim, inicie o protocolo cinético pré-programado e monitore a fluorescência verde de cálcio-5N.