Ensaio de captação de cálcio mitocondrial: um método baseado em leitor de placas para medir a captação de cálcio em mitocôndrias isoladas

As mitocôndrias absorvem cálcio citosólico, pois é essencial para seu bom funcionamento.

O influxo excessivo de cálcio na matriz mitocondrial - sobrecarga de cálcio mitocondrial - desencadeia a abertura de um canal interno da membrana, o poro de transição de permeabilidade mitocondrial, ou MPTP. O poro aberto permite o aumento do efluxo de cálcio das mitocôndrias, causando disfunção mitocondrial.

Para medir a absorção de cálcio mitocondrial, comece com uma placa de vários poços contendo mitocôndrias isoladas suspensas em um tampão adequado. Suplementar o poço com piruvato e malato, que são substratos produtores de ATP. Misture o conteúdo do poço e incuba.

Durante a incubação, o piruvato e o malato são convertidos em ATPs, energizando as mitocôndrias. Adicione uma solução contendo moléculas de corante fluorescente sensíveis ao cálcio e impermeáveis à membrana mitocondrial. Dispense o tampão contendo cálcio para as mitocôndrias energizadas.

Monitore a fluorescência de cálcio do corante à medida que as moléculas do corante se ligam ao cálcio livre no tampão.

Adicione mais íons de cálcio para iniciar o influxo de cálcio mitocondrial. O aumento gradual do cálcio mitocondrial diminui os