Name: G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a identificar regiões de replicação tardia do genoma usando citometria de fluxo e sequenciamento de alto rendimento em células de levedura. Esta técnica simples revela dinâmicas da replicação do DNA e vulnerabilidades genômicas.

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Este trabalho foi apoiado por grant GM117446 NIH de A.B.

1. preparação de células para Flow Cytometry classificação
<ol><li>Inocular tubos de ensaio de 15 mL contendo 8 mL de caldo YEPD tal que as culturas atingem uma densidade de 5 x 106 a 1,5 x 107 células / mL após crescimento durante a noite (ver discussão Nota 1).</li>
	<li>Spin para baixo de células de levedura (1.400 x g, à temperatura ambiente ou 4 ° C) em um tubo de centrifugação de tampa de rosca 15 mL por 5 min, Ressuspender as células em 1,5 mL de etanol a 70% e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,6 mL, deixando este sentar-se por 1h à temperatura ambiente ou pelo menos 3 h no gelo ( podem ser armazenados indefinidamente a 4 ° C) (ver ponto de discussão (2)).</li>
	<li>Spin para baixo de células de levedura na microcentrífuga (14.000 x g, 4 ° C) por 1 min, resuspenda em citrato de sódio 1 mL 50 mM, pH 7,2, spin-down (14.000 x g, 4 ° C) por 1 min, aspirar o sobrenadante, resuspenda em citrato de sódio 1 mL 50 mM, pH 7,2 , contendo 0,25 mg/mL solução de RNAse h 1 a 50 ° C, ou durante a noite a 37 ° C em banho de água ou bloco térmico.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l solução de proteinase K (20 mg/mL resuspended em pH de Tris 10 mM 7,5, 2 mM CaCl2, peso de 50% de glicerol de volume) e incubar durante 1 h a 50 ° C.</li>
	<li>Spin para baixo de células (14.000 x g, 4 ° C), Ressuspender as células em 1 mL citrato de sódio 50 mM, pH 7,2, spin para baixo (14.000 x g, 4 ° C), aspirar o sobrenadante com vácuo, resuspenda em 1 mL 1 µM verde ácido nucleico estirpe resuspended em citrato de sódio 50 mM , pH 7,2 e incubar no escuro por 1h à temperatura ambiente, proceda à sonicação 2x para 2 s cada (2 watts de potência de saída).</li>
</ol>2. célula de triagem
<ol><li>Usando um classificador de célula, tipo de células de acordo com o conteúdo de DNA em fases G1, S, "G2 precoce" e "tarde G2", recolha de pelo menos 1,6 milhões células haploides de cada fase do ciclo celular como na Figura 1 (ver ponto de discussão (3)).</li>
	<li>Células de transferência para tubos de microcentrífuga e spin para baixo de células por 20 min a 14.000 x g a 4 ° C, na microcentrífuga e aspire o sobrenadante com vácuo (a pelota pode ser armazenada congelado a-20 ° C indefinidamente; ver discussão ponto (4)).</li>
</ol>3. DNA extração e preparação de sequenciamento de bibliotecas
Nota: As etapas a seguir são baseadas em "protocolo" na extração de DNA genômico de levedura Kit (veja a Tabela de materiais).
<ol><li>Adicione 120 µ l de "Buffer de digestão," um buffer patenteado que permite que a enzima lítica de levedura digerir a parede celular e 5 µ l da enzima lítica de levedura, resuspenda vortexing e incubar a 37 ° C por 40-60 min.</li>
	<li>Adicione 120 µ l de "Lise," uma reserva proprietária que contém detergente e difícil para 10-20 s de vórtice.</li>
	<li>Adicionar 250 clorofórmio µ l - homogeneizar por 1 min.</li>
	<li>Girar na velocidade máxima em uma microcentrífuga por 2 min.</li>
	<li>Carrega o sobrenadante para a coluna de ligação de DNA e centrifugar a velocidade máxima em uma microcentrífuga por 1 min.</li>
	<li>Adicione 300 µ l de "DNA lavagem Buffer," uma reserva proprietária que contém etanol e centrifugar por 1 min na velocidade máxima em uma microcentrífuga. Descartar o fluxo através de, adicionar 300 µ l de tampão de lavagem do DNA e repita o processo de lavagem.</li>
	<li>Transferir a coluna de rotação para um tubo de microcentrífuga fresco, Adicionar 60 µ l de água (não TE) - Espere 3 min - 1 e em seguida centrifugar durante 10 s para Eluir o DNA.</li>
	<li>Medir a concentração pela adição de 5 µ l de DNA para 195 µ l de reagente de alta sensibilidade de dsDNA que foi diluído 1: 200 em dsDNA buffer de alta sensibilidade e, em seguida, a medida de fluorescência em um dados, usando 10 µ l de fornecidos padrões para calibração; Espero que entre 10 e 50 ng do rendimento total do ADN.</li>
	<li>Proceda à sonicação (pico incidente poder 450, Factor de serviço de 30%, ciclos por 200 Burst, tratamento tempo 60 s, nível de água 6) para separar o DNA em fragmentos de bp 250-350.</li>
	<li>Preparar uma biblioteca usando o kit de preparação de amostra de DNA e sequência-(leituras de pelo menos 10 milhões 50 bp único-extremidade) do instrumento de sequenciamento de DNA no modo rápido (ver nota de discussão (5)).</li>
</ol>4. análise de dados e geração de replicação de sequenciamento perfis
<ol><li>Alinhar sequências de Saccharomyces cerevisiae sacCer3 genoma usando Gsnap12 (ver nota de discussão (6)).</li>
	<li>Determine por-base par ler profundidades usando "genomeCoverageBed" software13 dos Bedtools.</li>
	<li>Remover artefactual picos nas profundezas de leitura, se presente (ver nota de discussão (7)).</li>
	<li>Liso ler profundezas por cromossoma usando medianas em um 20KB deslizante janela usando a função "runMean" em R pacote "caTools" (ver nota de discussão (8)).</li>
	<li>Trama ler profundezas em S fase precoce G2 e G2 atrasado como uma porcentagem de profundidades de leitura completamente replicadas (ver nota de discussão (9)).</li>
</ol>

<ol><li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li>
<li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replication+fork+barrier+at+the+3%27+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li>
<li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li>
<li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li>
<li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li>
<li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li>
<li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+fragile+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li>
<li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li>
<li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li>
<li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li>
<li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment%3A+Enhancements+to+Speed%2C+Accuracy%2C+and+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Enquanto esta técnica é robusta e relativamente direta, deve ser prestada especial atenção ao seguinte:
(1) recomendamos que culturas crescem pelo menos 12 h antes que eles atinjam a fase de registo, desde que diferenças se manifestar no ciclo celular distribuições se culturas são colhidas após ter alcançado a densidade desejada apenas 4 h após a inoculação. Nossa suposição é que uma distribuição de ciclo celular que atingiu um equilíbrio relativamente estável melhor representa uma distribuiçã...

Replicação do genoma eucariótico é iniciada em vários locais discretos, chamados origens de replicação, de que a replicação garfos procedem em ambas as direções (revistas em Fragkos et al, 20151). Origens variam em seu tempo e a eficiência de queima, e várias técnicas foram desenvolvidas para monitorar a atividade de origem de replicação e elucidar as causas desta variação. A atividade de origens individuais pode ser inferida níveis de single-stranded DNA2, que se forma em torno de origens ativas, ou por meio de eletroforese em gel 2D para monitorar a replicação específico intermediários3, ambos os quais podem ser detectados com sondas radioactivas. Ambas estas técnicas são mais facilmente aplicadas em S. cerevisiae do que em células de mamíferos, porque origens limitam-se a sequências específicas de conhecido na antiga. Com o advento dos microarrays, tornou-se possível avaliar globalmente a disparar de origem. Isto foi feito primeiro pela rotulagem DNA com isótopos pesados, liberando as células de um bloco de G1 no médios contendo isótopos leves e monitoramento em seguida a formação de pesados-luz híbrido DNA através do genoma4. A introdução de sequenciamento de alto throughput permitiu semelhante genoma-monitoração de atividade de origem, sem a exigência de marcação isotópica caro. As células foram classificadas em um citômetro de fluxo de acordo com o conteúdo de DNA e seu DNA submetido ao sequenciamento profundo. Porque a cobertura de sequência procede de 1x a 2x ao longo da fase S, sincronismo de replicação relativo pode ser avaliado comparando leitura profundidades de células em fase S àqueles em G1 ou G25,6. Estas técnicas, particularmente aplicadas à levedura, levaram a uma compreensão mais profunda de como sequência de DNA, estrutura da cromatina e DNA replicação proteínas regulam eficiência e sincronismo de origem.
Transmissão fiel da informação genética durante a proliferação celular requer não só sucesso iniciação da replicação do DNA, que se realiza às origens, mas também a conclusão bem sucedida da replicação, que ocorre onde encontram forquilhas de replicação. Como iniciação da replicação, o momento da conclusão da replicação varia consoante o genoma com certas regiões restantes replicadas no mesmo final do ciclo celular. Tais regiões podem ser particularmente distantes origens de replicação ativa ou podem conter sequências ou estruturas de cromatina que impedem as polimerases de DNA. Tarde, replicar as regiões pode se manifestar como sítios frágeis, que são associados com quebras cromossômicas e maiores taxas de mutação e têm sido implicados no cancro e o envelhecimento7,8,9. No entanto, apesar da importância da adequada conclusão da replicação do DNA na manutenção da estabilidade do genoma, nossa compreensão de onde e como isso ocorre tem lag muito atrás da iniciação da replicação. E enquanto os genes individuais cuja replicação final tem sido associada com doença têm sido estudados com, por exemplo, qPCR10, globais estudos dirigidos a elucidar as localizações e ultimamente tem faltado replicação de causas subjacentes. Aqui nós descrevemos uma técnica que chamamos como "G2 seq", no qual combinamos citometria de fluxo com sequenciamento de alto throughput para lançar luz sobre a conclusão da replicação do genoma em fermento11. Com pequenas alterações, este protocolo pode ser adaptado a qualquer uma das células que pode ser de fluxo-classificados de acordo com o conteúdo de DNA.

<table><tbody><tr><td>Kit de DNA Genômico YeaStar</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &micro; M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>ressuspender em 50 mM de citrato de sódio, pH 7,2</td></tr><tr><td>50 mM de citrato de sódio, pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de RNase (0,25 mg / mL)</td> <td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0,25 mg / mL RNaseA ressuspenso em 50 mM de citrato de sódio, pH 7,2, ferver a solução de RNase por 10 minutos antes do primeiro uso apenas, e a partir daí armazenar a -20&deg;</td></tr><tr><td>solução de proteinase K (20 mg / mL)</td> <td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>ressuspende em 10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl2, 50% de glicerol, armazenar a -20&deg; C</td></tr><tr><td>Modelo 50 Desmembrador Sônico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Colunas Zymo-spin III</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit de Ensaio HS</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorômetro</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Modelo LE220 Ultrasonicator Focado</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT Kit de Preparação de Amostras</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500</td><td>instrumento Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; Software de alinhamento 2501</td><td></td></tr><tr><td>gsnap</td><td>software de código aberto / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Inúmeras técnicas têm sido desenvolvidas para acompanhar o progresso da replicação do DNA através da fase S do ciclo celular. A maioria destas técnicas tem sido direcionada para elucidação do local e hora de início da duplicação do genoma, ao invés de sua conclusão. No entanto, é fundamental que nós entendemos de regiões do genoma que são última para concluir a replicação, porque essas regiões sofrem níveis elevados de quebra cromossômica e mutação, e eles têm sido associados com doenças e envelhecimento. Aqui descrevemos como nós estendemos uma técnica que tem sido usada para monitorar a iniciação de replicação para em vez disso, identificar as regiões do genoma última a replicação completa. Esta abordagem é baseada em uma combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto rendimento. Embora este relatório centra-se sobre a aplicação desta técnica a levedura, a abordagem pode ser usada com qualquer uma das células que pode ser classificada em um citômetro de fluxo de acordo com o conteúdo de DNA.

Temos utilizado o procedimento descrito acima para identificar sites replicação finais no fermento de brotamento. Esta abordagem usando uma região de replicação final conhecida em um cromossomo artificial de teste provou a técnica para ser precisa e confiável. Nossos resultados também demonstraram a importância biológica da conclusão atempada da replicação, mostrando que uma tarde região replicam no cromossomo 7, que identificamos como replicação final com base nos nossos resultados de G2...

Nós descrevemos uma técnica de combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto throughput para identificar regiões de replicação finais do genoma.

G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

O objetivo geral deste procedimento para sequenciamento profundo de DNA de células que foram separadas por citometria de fluxo de acordo com a fase do ciclo celular é identificar regiões do genoma que se replicam extremamente tarde no ciclo celular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de replicação do DNA, como quais regiões do genoma têm dificuldade em concluir a replicação do DNA e, portanto, são particularmente vulneráveis a rearranjos genômicos. A principal vantagem desta técnica é que, embora seja muito simples do ponto de vista experimental, ela fornece uma visão surpreendentemente detalhada da dinâmica da replicação genômica.Para começar, inocular tubos de ensaio de 15 mililitros contendo oito mililitros de YEPD com células de levedura de interesse. Pode-se utilizar meio sintético ou rico. Cultivar as células durante a noite por pelo menos 12 horas para coletá-las durante sua distribuição na fase logarítmica real.No dia seguinte, quando as culturas atingirem uma densidade de cinco a 15 milhões de células por mililitro, centrifugue as células e re-suspenda-as em 1,5 mililitro de etanol 70%. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo de micro

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Genética

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G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

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