G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma
22 de março de 2018
Nós descrevemos uma técnica de combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto throughput para identificar regiões de replicação finais do genoma.
O objetivo geral deste procedimento para sequenciamento profundo de DNA de células que foram classificadas por fluxo de acordo com a fase do ciclo celular é identificar regiões do genoma que se replicam extremamente tarde no ciclo celular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da replicação do DNA, como quais regiões do genoma têm problemas para completar a replicação do DNA e, portanto, são particularmente vulneráveis a rearranjos do genoma. A principal vantagem dessa técnica é que, embora seja muito simples do ponto de vista experimental, ela fornece uma visão surpreendentemente rica da dinâmica da replicação genômica.
Para começar, inocule tubos de ensaio de 15 mililitros contendo oito mililitros de YEPD com células de levedura de interesse. Meio sintético ou rico é aceitável. Cultive as células durante a noite por pelo menos 12 horas para coletá-las durante sua distribuição real da fase logarítmica.
No dia seguinte, quando as culturas estiverem com uma densidade de cinco a 15 milhões de células por mililitro, gire as células e ressuspenda-as em 1,5 mililitros de etanol a 70%. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitro e deixe as células incubarem em temperatura ambiente por uma hora ou por pelo menos três horas no gelo. Após a inoculação, gire as células e ressuspenda-as em um mililitro de citrato de sódio.
Finalmente, sonice brevemente as células duas vezes. Em seguida, repita o ciclo de centrifugação e ressuspenda a levedura em um mililitro de citrato de sódio contendo RNase. Deixe a RNase reagir com o fermento a 50 graus Celsius por uma hora ou durante a noite a 37 graus Celsius em um bloco de calor ou banho-maria.
Após o tratamento com RNase, adicione 50 microlitros de solução de proteinase K à mistura e continue a reação por uma hora a 50 graus Celsius. Em seguida, gire as células e ressuspenda as células em um mililitro de citrato de sódio. Em seguida, centrifugue as células e aspire o sobrenadante usando um vácuo.
Em seguida, com pouca luz, ressuspenda as células em um mililitro de citrato de sódio com coloração verde de ácido nucléico. Agora incube no fermento no escuro por uma hora em temperatura ambiente. Para prosseguir, conte as células usando um classificador de células usando dados de emissão de 530 nanômetros.
Classifique-os de acordo com seu conteúdo de DNA em suas fases do ciclo celular, G1 S, G2 inicial e G2 tardio. Colete pelo menos 1,6 milhão de células haplóides de cada fase. Imediatamente após classificar as células, gire-as por 20 minutos. Aspirar o sobrenadante e congelar o sedimento a 20 graus Celsius negativos para armazenamento.
Descobrimos que a etapa mais crítica para este procedimento é simplesmente girar as células imediatamente após coletá-las, uma hora no máximo após a classificação. Esta extração é baseada em um kit de extração de DNA genômico de levedura. Comece adicionando 120 microlitros de tampão de digestão e cinco microlitros de enzima lítica de levedura.
Em seguida, misture as células na mistura de reação usando um vórtice e incube a mistura a 37 graus Celsius por 40 a 60 minutos. Em seguida, adicione 120 microlitros de tampão de lise e vortex a mistura em alta velocidade por 10 a 20 segundos. Em seguida, adicione 250 microlitros de clorofórmio e misture bem o conteúdo do tubo por um minuto.
Em seguida, gire o tubo na velocidade máxima por dois minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para a coluna de ligação ao DNA. Girar o sobrenadante através da coluna utilizando um ciclo de centrifugação de velocidade máxima de um minuto.
Para lavar o DNA na membrana da coluna, transfira a coluna para um novo tubo de coleta e aplique 300 microlitros de tampão de lavagem de DNA. Em seguida, repita a centrifugação na velocidade máxima por um minuto. Repita esta etapa de lavagem mais uma vez.
Para coletar o DNA, transfira a coluna de rotação para um novo tubo. Adicione 60 microlitros de água e aguarde de um a três minutos. Em seguida, centrifugue a coluna à velocidade máxima durante 10 segundos para isolar a água que contém o ADN eluído.
Agora adicione entre cinco e 195 microlitros de tampão de alta sensibilidade de DNA de fita dupla contendo reagente em uma concentração de um a 200. Em seguida, meça a fluorescência da amostra para calcular o rendimento. Espere coletar entre 10 e 50 nanogramas de DNA.
Agora use a sonicação para quebrar o DNA em fragmentos que estão entre 250 e 350 pares de bases. Em seguida, use um kit padrão para preparar uma biblioteca de DNA e sequenciá-la usando pelo menos 10 milhões de leituras de extremidade única de 50 pares de bases. O procedimento descrito foi utilizado para identificar sítios de replicação tardia em leveduras em brotamento.
As células normais foram comparadas com aquelas sem Sir2, uma proteína desacetilase. Os dados brutos continham grandes picos principalmente devido à presença de elementos TY. Esses picos foram removidos limitando as profundidades de leitura a 2,5 vezes a profundidade vermelha média para cada amostra.
Os dados eliminados foram então suavizados com uma janela deslizante de 20 kb. Por fim, os dados foram normalizados e plotados como razões para os níveis em G1. Uma célula completamente não replicada apareceria em 0,5 e uma célula completamente replicada apareceria em um. Nestes dados do cromossomo sete, houve evidência de uma região de replicação tardia conhecida no mutante Sir2.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar as regiões do genoma que são as últimas a completar a replicação do DNA e que, portanto, são particularmente vulneráveis a quebras de DNA e outros problemas associados à replicação tardia.
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Visão Geral
Este artigo descreve uma técnica que combina citometria de fluxo e sequenciamento de alto rendimento para identificar regiões de replicação tardia do genoma. Este método fornece insights sobre a dinâmica da replicação genômica e ajuda a responder questões-chave no campo da replicação do DNA.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genômica
- Análise do Ciclo Celular
- Replicação do DNA
Fundamento
- Entender as regiões de replicação tardia do genoma é crucial para estudar a replicação do DNA.
- Essas regiões podem ser vulneráveis a rearranjos genômicos.
- A triagem por fluxo permite o isolamento de células com base na fase do ciclo celular.
- O sequenciamento de alto rendimento fornece uma visão abrangente da dinâmica genômica.
Propósito do Estudo
- Identificar regiões do genoma que se replicam tardiamente no ciclo celular.
- Explorar as implicações da replicação incompleta do DNA.
- Melhorar a compreensão da estabilidade genômica e dos rearranjos.
Métodos Utilizados
- Citometria de fluxo para triagem de células com base na fase do ciclo celular.
- Sequenciamento profundo de DNA de células classificadas.
- Cultivo de células de levedura em meio YEPD.
- Incubação noturna para alcançar distribuição em fase log.
Principais Resultados
- A técnica revela uma rica visão da dinâmica da replicação genômica.
- Regiões de replicação tardia identificadas podem indicar áreas propensas à instabilidade.
- O design experimental simples gera insights significativos.
- Fornece uma estrutura para pesquisas adicionais na replicação do DNA.
Conclusões
- Este método é eficaz para estudar a replicação tardia no genoma.
- Pode ajudar a identificar vulnerabilidades na replicação do DNA.
- A abordagem é acessível e informativa para pesquisadores no campo.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Identifying late-replicating genomic regions provides critical insights into chromosomal instability, a key factor in oncogenesis and aging-related pathologies. This technique enables early detection of genomic regions prone to breakage and mutation, supporting target validation in DNA damage response pathways. By linking replication timing to functional vulnerability, it enhances predictive confidence in preclinical models of genome maintenance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of replication timing as a biomarker for genomic instability in disease models.
- Operational Value: Combines flow cytometry with sequencing to isolate and analyze phase-specific DNA populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, genome-wide replication timing profiles for comparative screening.
- Operational Value: Standardized workflow using DNA content sorting and library preparation supports assay reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals regions with elevated breakage and mutation rates, informing mechanistic de-risking of genome stability targets.
- Operational Value: Enables comparison between wild-type and mutant backgrounds (e.g., Sir2) to assess genetic modifiers of replication timing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery by providing functional genomic data that informs target selection and pathway analysis prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of replication timing effects on genomic stability and chromosomal integrity.
- Screening: Delivers normalized, spiking-corrected sequencing data enabling quantitative comparison of replication completion across conditions.
- Analytics: Uses sliding window smoothing and G1-normalized ratios to produce interpretable replication timing maps.
- Translational Research: Connects late replication to phenotypic outcomes like breakage and mutation, supporting translational biomarker relevance.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any flow-sortable cell type, enabling cross-project application in mammalian or yeast systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in identifying mechanistically vulnerable genomic loci.
- Operational Value: Standardized, scalable workflow from cell sorting to sequencing library preparation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by highlighting targets associated with replication stress and instability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genome maintenance targets based on replication timing vulnerability.
Implementation Considerations
- Expertise in flow cytometry, nucleic acid extraction, and next-generation sequencing library preparation.
- Instrumentation for cell sorting, sonication, and high-throughput sequencing platforms.
- Standardization of spike removal (capping read depth) and smoothing parameters across samples.
- Adaptation considerations for varying genome sizes and cell types beyond yeast.
- Practical limitation: Requires sufficient cell numbers (1.6M per phase) and careful timing post-sort to prevent degradation.
