G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma
22 de março de 2018
Nós descrevemos uma técnica de combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto throughput para identificar regiões de replicação finais do genoma.
O objetivo geral deste procedimento para sequenciamento profundo de DNA de células que foram separadas por citometria de fluxo de acordo com a fase do ciclo celular é identificar regiões do genoma que se replicam extremamente tarde no ciclo celular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de replicação do DNA, como quais regiões do genoma têm dificuldade em concluir a replicação do DNA e, portanto, são particularmente vulneráveis a rearranjos genômicos. A principal vantagem desta técnica é que, embora seja muito simples do ponto de vista experimental, ela fornece uma visão surpreendentemente detalhada da dinâmica da replicação genômica.
Para começar, inocular tubos de ensaio de 15 mililitros contendo oito mililitros de YEPD com células de levedura de interesse. Pode-se utilizar meio sintético ou rico. Cultivar as células durante a noite por pelo menos 12 horas para coletá-las durante sua distribuição na fase logarítmica real.
No dia seguinte, quando as culturas atingirem uma densidade de cinco a 15 milhões de células por mililitro, centrifugue as células e re-suspenda-as em 1,5 mililitro de etanol 70%. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitro e deixe as células incubarem à temperatura ambiente por uma hora ou por pelo menos três horas no gelo. Após a inoculação, centrifugue as células e re-suspenda-as em um mililitro de citrato de sódio.
Por fim, sonique brevemente as células duas vezes. Em seguida, repita o ciclo de centrifugação e re-suspenda o levedo em um mililitro de citrato de sódio contendo RNase. Deixe a RNase reagir com o levedo a 50 graus Celsius por uma hora ou durante a noite a 37 graus Celsius em um bloco térmico ou banho-maria.
Após o tratamento com RNase, adicione 50 microlitros de solução de proteinase K à mistura e continue a reação por uma hora a 50 graus Celsius. Em seguida, centrifugue as células e reconstitua as células em um mililitro de citrato de sódio. A seguir, centrifugue as células e aspire o sobrenadante utilizando vácuo.
Em seguida, em luz fraca, ressuspenda as células em um mililitro de citrato de sódio com corante verde de ácidos nucleicos. Agora, incube o levedo no escuro por uma hora à temperatura ambiente. Para prosseguir, conte as células utilizando um citômetro de fluxo com dados de emissão de 530 nanômetros.
Sequencie-os de acordo com o seu conteúdo de DNA em suas fases do ciclo celular: G1, S, início de G2 e fim de G2. Colete pelo menos 1,6 milhão de células haploides de cada fase. Imediatamente após a separação das células, centrifugue-as por 20 minutos. Aspire o sobrenadante e congele o pellet a 20 graus Celsius negativos para armazenamento.
Descobrimos que a etapa única mais crítica para este procedimento é simplesmente centrifugar as células imediatamente após coletá-las, no máximo uma hora após a triagem. Esta extração baseia-se em um kit de extração de DNA genômico de levedura. Inicie adicionando 120 microlitros de tampão de digestão e cinco microlitros de enzima lítica de levedura.
Em seguida, homogeneíze as células na mistura reacional usando um vórtex e incube a mistura a 37 graus Celsius por 40 a 60 minutos. A seguir, adicione 120 microlitros de tampão de lise e vorte a mistura em alta velocidade por 10 a 20 segundos. Então, adicione 250 microlitros de clorofórmio e misture completamente o conteúdo do tubo por um minuto.
Em seguida, centrifugue o tubo em velocidade máxima por dois minutos. Então, transfira o sobrenadante para a coluna de ligação ao DNA. Passe o sobrenadante pela coluna utilizando um ciclo de centrifugação de um minuto em velocidade máxima.
Para lavar o DNA na membrana da coluna, transfira a coluna para um novo tubo de coleta e adicione 300 microlitros de tampão de lavagem de DNA. Em seguida, repita a centrifugação em velocidade máxima por um minuto. Repita este passo de lavagem mais uma vez.
Para coletar o DNA, transfira a coluna de centrifugação para um tubo novo. Adicione 60 microlitros de água e aguarde de um a três minutos. Em seguida, centrifugue a coluna em velocidade máxima por 10 segundos para isolar a água contendo o DNA eluído.
Agora, adicione entre cinco e 195 microlitros de tampão de alta sensibilidade para DNA de dupla fita contendo o reagente em uma concentração de um para 200. Em seguida, meça a fluorescência da amostra para calcular o rendimento. Espere coletar entre 10 e 50 nanogramas de DNA.
Agora, utilize a sonicação para fragmentar o DNA em fragmentos de 250 a 350 pares de bases. Em seguida, utilize um kit padrão para preparar uma biblioteca de DNA e sequenciá-la utilizando pelo menos 10 milhões de leituras simples de 50 pares de bases. O procedimento descrito foi utilizado para identificar sítios de replicação tardia em levedura brotante.
Células normais foram comparadas com aquelas que não possuem Sir2, uma proteína desacetilase. Os dados brutos continham grandes picos, principalmente devido à presença de elementos TY. Esses picos foram removidos limitando as profundidades de leitura a 2,5 vezes a profundidade mediana de leitura para cada amostra.
Os dados desespikados foram então suavizados com uma janela deslizante de 20 kb. Por fim, os dados foram normalizados e plotados como razões em relação aos níveis na fase G1. Uma célula completamente não replicada apareceria em 0,5 e uma célula completamente replicada apareceria em um. Nesses dados do cromossomo sete, houve evidência de uma região conhecida de replicação tardia no mutante Sir2.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar as regiões do genoma que são as últimas a concluir a replicação do DNA e que, portanto, são particularmente vulneráveis a quebras de DNA e outros problemas associados à replicação tardia.
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Visão Geral
Este artigo descreve uma técnica que combina citometria de fluxo e sequenciamento de alto rendimento para identificar regiões do genoma com replicação tardia. Este método fornece informações sobre a dinâmica da replicação genômica e ajuda a responder questões fundamentais no campo da replicação do DNA.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Genômica
- Análise do Ciclo Celular
- Replicação do DNA
Antecedentes
- Compreender as regiões de replicação tardia do genoma é essencial para o estudo da replicação do DNA.
- Essas regiões podem ser vulneráveis a rearranjos genômicos.
- A classificação por fluxo permite o isolamento de células com base na fase do ciclo celular.
- O sequenciamento de alto rendimento fornece uma visão abrangente da dinâmica genômica.
Objetivo do Estudo
- Identificar regiões do genoma que se replicam tardiamente no ciclo celular.
- Explorar as implicações da replicação incompleta do DNA.
- Aprimorar a compreensão da estabilidade e rearranjos genômicos.
Métodos Utilizados
- Citometria de fluxo para separar células com base na fase do ciclo celular.
- Sequenciamento profundo de DNA de células separadas.
- Cultivo de células de levedura em meio YEPD.
- Incubação noturna para obter distribuição em fase logarítmica.
Resultados Principais
- A técnica revela uma visão detalhada da dinâmica da replicação genômica.
- As regiões identificadas como replicadas tardiamente podem indicar áreas propensas à instabilidade.
- O desenho experimental simples fornece insights significativos.
- Oferece uma base para pesquisas futuras na replicação do DNA.
Conclusões
- Este método é eficaz para estudar a replicação tardia no genoma.
- Pode ajudar a identificar vulnerabilidades na replicação do DNA.
- A abordagem é acessível e informativa para pesquisadores da área.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação de regiões genômicas de replicação tardia fornece informações essenciais sobre a instabilidade cromossômica, um fator-chave na oncogênese e nas patologias relacionadas ao envelhecimento. Esta técnica permite a detecção precoce de regiões genômicas propensas a quebras e mutações, apoiando a validação de alvos nas vias de resposta ao dano no DNA. Ao associar o cronograma de replicação à vulnerabilidade funcional, ela aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos de manutenção do genoma.
Aplicações Estratégicas na P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite investigar o cronograma de replicação como biomarcador de instabilidade genômica em modelos de doenças.
- Valor Operacional: Combina citometria de fluxo com sequenciamento para isolar e analisar populações de DNA específicas de fase.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera perfis quantitativos e de genoma inteiro de tempo de replicação para triagem comparativa.
- Valor Operacional: Fluxo de trabalho padronizado utilizando separação por conteúdo de DNA e preparação de biblioteca favorece a reprodutibilidade do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Revela regiões com taxas elevadas de quebra e mutação, fornecendo subsídios para a desvinculação mecanicista de alvos de estabilidade genômica.
- Valor Operacional: Permite a comparação entre linhagens selvagens e mutantes (por exemplo, Sir2) para avaliar modificadores genéticos do tempo de replicação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial de descoberta ao fornecer dados genômicos funcionais que orientam a seleção de alvos e a análise de vias metabólicas antes da identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre os efeitos do cronograma de replicação na estabilidade genômica e na integridade cromossômica.
- Triagem: Fornece dados de sequenciamento normalizados e corrigidos quanto à adição de padrões internos, permitindo comparação quantitativa da conclusão da replicação entre diferentes condições.
- Análises: Utiliza suavização por janela móvel e razões normalizadas pela fase G1 para gerar mapas de cronograma de replicação interpretáveis.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a replicação tardia a desfechos fenotípicos como quebras e mutações, apoiando a relevância translacional como biomarcador.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a qualquer tipo celular passível de separação por citometria de fluxo, permitindo aplicação cruzada em projetos com sistemas de mamíferos ou leveduras.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na identificação de loci genômicos mecanicamente vulneráveis.
- Valor Operacional: Fluxo de trabalho padronizado e escalonável, desde a separação celular até a preparação da biblioteca para sequenciamento.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou não ao destacar alvos associados ao estresse e instabilidade de replicação.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos de manutenção do genoma com base na vulnerabilidade do tempo de replicação.
Considerações sobre a Implementação
- Experiência em citometria de fluxo, extração de ácidos nucleicos e preparação de bibliotecas para sequenciamento de nova geração.
- Instrumentação para classificação celular, sonicação e plataformas de sequenciamento de alto rendimento.
- Padronização da remoção de picos (limitação da profundidade de leitura) e parâmetros de suavização entre amostras.
- Considerações de adaptação para tamanhos genômicos e tipos celulares variados além da levedura.
- Limitação prática: Exige número suficiente de células (1,6 milhão por fase) e cronometragem cuidadosa após a classificação para prevenir degradação.
