G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

O objetivo geral deste procedimento para sequenciamento profundo de DNA de células que foram classificadas por fluxo de acordo com a fase do ciclo celular é identificar regiões do genoma que se replicam extremamente tarde no ciclo celular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da replicação do DNA, como quais regiões do genoma têm problemas para completar a replicação do DNA e, portanto, são particularmente vulneráveis a rearranjos do genoma. A principal vantagem dessa técnica é que, embora seja muito simples do ponto de vista experimental, ela fornece uma visão surpreendentemente rica da dinâmica da replicação genômica.

Para começar, inocule tubos de ensaio de 15 mililitros contendo oito mililitros de YEPD com células de levedura de interesse. Meio sintético ou rico é aceitável. Cultive as células durante a noite por pelo menos 12 horas para coletá-las durante sua distribuição real da fase logarítmica.

No dia seguinte, quando as culturas estiverem com uma densidade de cinco a 15 milhões de células por mililitro, gire as células e ressuspenda-as em 1,5 mililitros de etanol a 70%. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitro e deixe as células incubarem em temperatura ambiente por uma hora ou por pelo menos três horas no gelo. Após a inoculação, gire as células e ressuspenda-as em um mililitro de citrato de sódio.

Finalmente, sonice brevemente as células duas vezes. Em seguida, repita o ciclo de centrifugação e ressuspenda a levedura em um mililitro de citrato de sódio contendo RNase. Deixe a RNase reagir com o fermento a 50 graus Celsius por uma hora ou durante a noite a 37 graus Celsius em um bloco de calor ou banho-maria.

Após o tratamento com RNase, adicione 50 microlitros de solução de proteinase K à mistura e continue a reação por uma hora a 50 graus Celsius. Em seguida, gire as células e ressuspenda as células em um mililitro de citrato de sódio. Em seguida, centrifugue as células e aspire o sobrenadante usando um vácuo.

Em seguida, com pouca luz, ressuspenda as células em um mililitro de citrato de sódio com coloração verde de ácido nucléico. Agora incube no fermento no escuro por uma hora em temperatura ambiente. Para prosseguir, conte as células usando um classificador de células usando dados de emissão de 530 nanômetros.

Classifique-os de acordo com seu conteúdo de DNA em suas fases do ciclo celular, G1 S, G2 inicial e G2 tardio. Colete pelo menos 1,6 milhão de células haplóides de cada fase. Imediatamente após classificar as células, gire-as por 20 minutos. Aspirar o sobrenadante e congelar o sedimento a 20 graus Celsius negativos para armazenamento.

Descobrimos que a etapa mais crítica para este procedimento é simplesmente girar as células imediatamente após coletá-las, uma hora no máximo após a classificação. Esta extração é baseada em um kit de extração de DNA genômico de levedura. Comece adicionando 120 microlitros de tampão de digestão e cinco microlitros de enzima lítica de levedura.

Em seguida, misture as células na mistura de reação usando um vórtice e incube a mistura a 37 graus Celsius por 40 a 60 minutos. Em seguida, adicione 120 microlitros de tampão de lise e vortex a mistura em alta velocidade por 10 a 20 segundos. Em seguida, adicione 250 microlitros de clorofórmio e misture bem o conteúdo do tubo por um minuto.

Em seguida, gire o tubo na velocidade máxima por dois minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para a coluna de ligação ao DNA. Girar o sobrenadante através da coluna utilizando um ciclo de centrifugação de velocidade máxima de um minuto.

Para lavar o DNA na membrana da coluna, transfira a coluna para um novo tubo de coleta e aplique 300 microlitros de tampão de lavagem de DNA. Em seguida, repita a centrifugação na velocidade máxima por um minuto. Repita esta etapa de lavagem mais uma vez.

Para coletar o DNA, transfira a coluna de rotação para um novo tubo. Adicione 60 microlitros de água e aguarde de um a três minutos. Em seguida, centrifugue a coluna à velocidade máxima durante 10 segundos para isolar a água que contém o ADN eluído.

Agora adicione entre cinco e 195 microlitros de tampão de alta sensibilidade de DNA de fita dupla contendo reagente em uma concentração de um a 200. Em seguida, meça a fluorescência da amostra para calcular o rendimento. Espere coletar entre 10 e 50 nanogramas de DNA.

Agora use a sonicação para quebrar o DNA em fragmentos que estão entre 250 e 350 pares de bases. Em seguida, use um kit padrão para preparar uma biblioteca de DNA e sequenciá-la usando pelo menos 10 milhões de leituras de extremidade única de 50 pares de bases. O procedimento descrito foi utilizado para identificar sítios de replicação tardia em leveduras em brotamento.

As células normais foram comparadas com aquelas sem Sir2, uma proteína desacetilase. Os dados brutos continham grandes picos principalmente devido à presença de elementos TY. Esses picos foram removidos limitando as profundidades de leitura a 2,5 vezes a profundidade vermelha média para cada amostra.

Os dados eliminados foram então suavizados com uma janela deslizante de 20 kb. Por fim, os dados foram normalizados e plotados como razões para os níveis em G1. Uma célula completamente não replicada apareceria em 0,5 e uma célula completamente replicada apareceria em um. Nestes dados do cromossomo sete, houve evidência de uma região de replicação tardia conhecida no mutante Sir2.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar as regiões do genoma que são as últimas a completar a replicação do DNA e que, portanto, são particularmente vulneráveis a quebras de DNA e outros problemas associados à replicação tardia.