Quantificação de transmigração de monócitos e formação de célula de espuma de indivíduos com doenças inflamatórias crônicas

O objetivo geral deste ensaio é quantificar a capacidade dos monócitos de amostras clínicas humanas de sofrer migração transendotelial e formação de células espumosas. Este método pode ser usado para responder a questões-chave no campo cardiovascular, como o potencial aterogênico das células de indivíduos com risco de doença arterial coronariana aguda. A principal vantagem dessa técnica é que as amostras clínicas podem ser medidas tanto de sangue total fresco quanto de coortes de pacientes armazenadas.

Além disso, a formação de células espumosas pode ser quantificada por microscopia e citometria de fluxo. Primeiro, prepare os géis de colágeno polimerizados a partir de uma suspensão de colágeno fresco. Em um tubo de poliestireno de cinco mililitros, adicione hidróxido de sódio, depois 10 vezes M199, depois ácido ácido e, finalmente, adicione colágeno fibroso.

Misture bem pipetando. Em seguida, alíquota de 50 microlitros nos poços internos de uma placa de cultura de tecidos estéril de fundo plano de 96 poços. Nas bordas externas dos poços, carregue 200 microlitros de uma vez Dulbecco PBS para evitar a dessecação.

Após duas horas de incubação a 37 graus Celsius, o colágeno irá polimerizar. Em seguida, cubra os géis com 150 microlitros de M199 suplementado uma vez e incube-os até que sejam necessários para uso cinco dias depois. Para expandir as células endoteliais da veia umbilical humana armazenadas, prepare um frasco de cultura de 25 centímetros quadrados com um mililitro de solução de fibronectina e incube o prato por 10 minutos em temperatura ambiente.

Enquanto isso, descongele as células armazenadas em banho-maria para ressuspendê-las em M20. Assim que as células forem descongeladas, aspire qualquer solução residual de fibronectina do prato e coloque as células em placas. Em seguida, a cultura para confluir substituindo a mídia após dois a três dias.

Os HUVECs devem ser confluentes no quinto dia de cultivo. Separe-os aspirando o sobrenadante da cultura do frasco e, em seguida, lave o meio contendo soro usando dois a três mililitros de uma vez PBS. Em seguida, adicione cinco mililitros de tripsina diluída e incube as células brevemente à temperatura ambiente, sacudindo as células suavemente até que pareçam separadas.

Em seguida, colete-os rapidamente com cinco mililitros de M20 e transfira a suspensão para um tubo de 10 mililitros e células centrifugadas. Agora, ressuspenda as células em M20 a 200.000 células por mililitro. Em seguida, aspire o M199 da placa de colágeno preparada e adicione 100 microlitros de HUVECs a cada gel.

Continue a cultura por três dias. No oitavo dia de cultivo dos HUVECs, ative as monocamadas antes de adicionar os monócitos. Depois de aspirar o meio sobreposto, adicione 100 microlitros de solução de TNF-alfa humano a cada poço.

Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por quatro horas. Após a incubação, remova o meio e lave os géis duas vezes usando 100 microlitros de M199 por lavagem. Agora, adicione 50.000 monócitos recém-isolados ou subconjuntos de monócitos purificados em 100 microlitros de M20 às monocamadas HUVEC.

Depois de adicionar os monócitos, incube a placa por uma hora para permitir a transmigração das células. Após uma hora, recolher as células não transmigradas em solução de lavagem. Comece agrupando duas lavagens EGTA usando 100 microlitros por poço.

Em seguida, gire as soluções de lavagem combinadas a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 30 microlitros de PBS e conte as células para determinar a porcentagem de células transmigradas para frente. Agora, lave os poços da placa uma vez com M199 e adicione 100 microlitros de M20 fresco aos poços da placa e incube a placa por dois dias.

Após dois dias, repetir o procedimento de recolha das células não transmigradas em solução de lavagem EGTA para recolher as células transmigradas inversamente e proceder à análise fenotípica das células. Para caracterizar fenotipicamente as células ligadas ao gel pela análise FACS, digerir as células adicionando 100 microlitros de colágeno D a 37 graus Celsius e incubando por 20 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, macere os géis usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros e incube-os por mais 20 minutos para digerir completamente os géis.

Depois de totalmente digeridos, filtre e agrupe os géis replicados digeridos através de uma malha de náilon de 35 mícrons em um tubo FACS no gelo. Agora, lave as células filtradas uma vez com a solução de lavagem FACS fria. Centrifugue as células e ressuspenda-as em 100 microlitros de solução de lavagem a frio.

Em seguida, execute a coloração e análise FACS de acordo com o protocolo de texto. Para analisar as células por microscopia, primeiro core as células conforme descrito no protocolo de texto. Para destacar as células coradas, marque os poços usando uma agulha de calibre 21 com o chanfro voltado para fora.

Em seguida, prepare as lâminas para montar os géis. Faça dois pequenos furos em uma tira de fita dupla-face e, em seguida, fixe a fita na lâmina e remova o revestimento protetor. Em seguida, adicione uma gota de água a cada orifício da fita.

Em seguida, usando uma pinça, transfira suavemente dois géis para os dois orifícios e cubra a fita. Por fim, prenda cuidadosamente uma lamínula na fita e prossiga com a visualização das células. Após a transmigração, as células não transmigradas foram contadas conforme descrito.

Um total de 15.000 células não transmigradas foram recuperadas, e a porcentagem de transmigração para frente foi determinada em 95%Após 48 horas de incubação adicional, 36.000 células transmigradas reversas foram recuperadas, o que totalizou 12,6% de transmigração reversa. A coloração dos géis com óleo vermelho O revelou células espumosas apontadas por setas brancas e macrófagos apontados com setas pretas. Esses monócitos foram tratados com LDL oxidado durante a transmigração, uma substância usada para induzir a formação de células espumosas em modelos convencionais de indução de células espumosas.

Os dados agregados de contagem de células de 12 doadores confirmaram que a incubação de monócitos com LDL oxidado induziu mais formação de células espumosas do que quando os monócitos são incubados apenas com LDL nativo ou meio M199. As células transmigradas também foram analisadas por citometria de fluxo. Após a exclusão de células mortas, dublês e HUVECs CD45 negativos, a maior população de células migradas foi selecionada e a intensidade média de fluorescência dos receptores de interesse foi comparada com os dados de fluorescência menos um ou isotipo de controle.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar este ensaio para quantificar a migração transendotelial de monócitos e a formação de células espumosas a partir de amostras clínicas humanas. Não se esqueça de que trabalhar com amostras clínicas humanas pode ser extremamente perigoso e uma boa técnica laboratorial deve sempre ser usada.