Name: Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a medir o tráfego de subpopulações de monócitos sob fluxo in vitro usando marcadores de superfície específicos e microscopia confocal de fluorescência. Este protocolo integrado permite distinguir transmigração e adesão celular.

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Agradecemos o Dr. Paul Bradfield para manuscrito lendo e feedbacks. A.s. recebeu apoio financeiro do senhor Jules Thorn caridade ultramarinos Trust reg.,

Materiais humanos foram usados com o consentimento dos doadores voluntários e de acordo com os suíços comités de ética em pesquisa clínica.
1. isolamento e congelamento do Cordão Umbilical humano veia células endoteliais (HUVEC)
<ol><li>Adicione 5 mL da solução de revestimento para um balão de T75 (0,1 mg/mL colágeno G e gelatina de 0,2% em tampão fosfato salino PBS pH 7,4) por 30 min a 37 ° C antes de iniciar o isolamento HUVEC.</li>
	<li>Limpe o cabo com PBS, limpe-a com compressas estéreis e colocá-lo em uma estéril 20 cm placa de Petri. Corte as extremidades do cabo com uma tesoura esterilizada.</li>
	<li>Identifica a única grande veia e duas artérias pequenas. Suavemente Insira uma cânula com uma torneira de três vias ligada a ele em veia extremidades nas extremidades do cabo.</li>
	<li>Aperte o cabo e a conexão da cânula firmemente com um comprimento de fio.</li>
	<li>Perfundir o cordão duas vezes com 20 mL de meio RPMI contendo 100 penicilina U/mL, de 100 U/mL Estreptomicina e de 250 ng/mL anfotericina B para lavar as veias do fio. Este processo faz a aparência do cordão mais brancos e mais clara. Esvazie a veia antes da adição de colagenase, recolhendo o RPMI com uma seringa em uma extremidade.</li>
	<li>Perfundir a veia com 12 mL de 1 mg/mL colagenase tipo eu (0,22 µm-filtrada).</li>
	<li>Fechar a torneira na medula termina e incubar o cabo a 37 ° C por 12 min.</li>
	<li>Massageie suavemente o cabo para desanexar células endoteliais do lúmen da veia.</li>
	<li>Tomar 30 mL de RPMI contendo 10% de soro fetal bezerro com uma seringa de 50 mL e conectá-lo a uma extremidade do cordão umbilical.</li>
	<li>Conecte uma seringa vazia de 50 mL para a outra extremidade do cordão umbilical</li>
	<li>Abra a torneira e perfundir a veia de uma ponta, enquanto que coletando reciprocamente do outro lado. Nota: A suspensão coletada contém células endoteliais.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 5 min.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células com 10 mL de meio M199 completo (M199 suplementos contendo 20% FCS, crescimento das células endoteliais 15 µ g/mL, sódio de heparina 100 µ g/mL, 0,5 µM de hidrocortisona, 10 µ g/mL de ácido L-ascórbico, 100 penicilina U/mL, 100 U/mL estreptomicina e 250 ng/mL anfotericina B).</li>
	<li>Remover a solução de revestimento de balão T75 e lave uma vez com PBS.</li>
	<li>Sementes das células colhidos passo 1.13 para o balão de T75 e colocá-lo na incubadora a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>No dia seguinte, lave o balão 3 vezes com o meio M199 completo para remover células vermelhas do sangue residuais e depois mudar o médio a cada 2 dias até a confluência.</li>
	<li>Na confluência de 80-90%, enxágue a monocamada HUVEC uma vez com 5 mL de PBS e separar as células com 5 mL de tripsina 0,05% em 1 mM EDTA a 37 ° C por 5 min. Adicione 4 mL de M199 e 1 mL de FCS para parar a ação da tripsina. Lave o balão para desanexar todos HUVEC.</li>
	<li>Recolha uma alíquota de 50 µ l para ser usado para coloração de VE-caderina, PECAM-1 e gp38 e analisar por citometria de fluxo para verificar a pureza HUVEC.</li>
	<li>Colete o restante do HUVEC da etapa 1.18 em um tubo de 15 mL e centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Descartar o sobrenadante da etapa 1.19, Ressuspender as células em congelamento solução (FCS contendo 10% de DMSO) com uma densidade de 5 x 105 células/mL em cryotubes e congelar a-80 ° C ou em nitrogênio líquido até o uso.</li>
	<li>
Para verificar a pureza HUVEC:
	<ol>
<li>Adicione 1 µ l de anticorpo de VE-caderina-FITC anti-humano, 1 µ l de anticorpo de PECAM1-PE anti-humano e 1 µ l de anticorpo de Podoplanin-APC anti-humano a alíquota de 50 µ l de HUVEC coletado na etapa 1.18.</li>
		<li>Incube a temperatura ambiente por 10 min.</li>
		<li>Adicionar 100 µ l de PBS e centrifugar a 400 x g durante 30 s.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender em 100 µ l de PBS. Dados podem agora ser adquiridos por técnicas de citometria de fluxo. Nota: HUVEC são positivas para VE caderina e PECAM-1 e negativo para Podoplanin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. HUVEC descongelação
Nota: Usar HUVEC na passagem baixa para experimentos (máximos 5 passagens).
<ol><li>Revesti um balão T75 com 1 mL da solução de revestimento, a 37 ° C por 30 min.</li>
	<li>Rapidamente HUVEC de descongelar a 37 ° C por 2 min e ressuspender as células em 10 mL de M199 completa.</li>
	<li>Centrifugar as células a 200 x g em temperatura ambiente por 5 min e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 10 mL de M199 completa.</li>
	<li>Transferi a suspensão de eritrócitos no frasco pré-pintados. Coloque o frasco na incubadora a 37 ° C com 5% de CO2. Altere o meio de cultura celular a cada 2 dias.</li>
</ol>3. HUVEC cultura na câmara de 0,4 µ-Slide
<ol><li>Cinco dias antes de iniciar o experimento de fluxo, pre-revesti as câmaras de um 0,4 µ-slide com 30 µ l de PBS contendo colágeno de 0,1 mg/mL G, gelatina de 0,2% a 37 ° C por 30 min.</li>
	<li>Lave as câmaras com 100 µ l de PBS.</li>
	<li>Separe as células de um HUVEC confluente de 80-90% de um balão T75.</li>
	<li>Enxágue HUVEC com 5 mL de PBS e desanexá-los com 5 mL de tripsina 0,05% a 37 ° C por 5 min.</li>
	<li>Lave e coletar a suspensão de eritrócitos em M199 completa e contar as células pelo método mais conveniente. Centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Ressuspender as células em 106 células/mL e 30 µ l (30.000 células) por câmara de distribuir.</li>
	<li>Incube as células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 por 1h.</li>
	<li>Adicionar 150 µ l de M199 completa para cada câmara e cultura das células durante 5 dias na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Altere o meio em 2 dias.</li>
</ol>4. HUVEC mancha para ensaio de recrutamento de monócitos sob fluxo
<ol><li>Prepare o suporte de rotulagem de M199 e 1 µM de CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetato) e aquecê-lo a 37 ° C por 5 min antes de rotulagem de célula.</li>
	<li>HUVEC lavar duas vezes com meio M199 aquecido a 37 ° C.</li>
	<li>Substituir o medium com 30 µ l de aquecido médio rotulagem contendo 1 µM de CMFDA e coloque dentro da incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por 10 min.</li>
	<li>Lave uma vez com M199 completa e incube as celulas com M199 completa na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por 30 min. Nota: É importante remover todos os vestígios de soro antes da adição da solução de etiquetagem, caso contrário ele pode alterar HUVEC coloração.</li>
	<li>Substituir o medium com M199 completa contendo qualquer TNFa humana (500 U/mL) ou uma mistura de TNFa humana (500 U/mL) com a célula humana (1 µ g/mL) para 6 h na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
</ol>5. isolamento de monócitos humanos Pan e coloração de subpopulações
<ol><li>Use um casaco de buffy de concentrado de sangue humano, ou 20 mL de sangue humano fresco isolado, coletado no dia do experimento em tubos vacutainer de EDTA.</li>
	<li>Diluir o sangue em PBS-1 mM EDTA (1:1) e suavemente Pipetar 20 mL do sangue diluído em cima a 20 mL de mídia gradiente de densidade. Centrifugar a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente com aceleração lenta e sem freio.</li>
	<li>Recolher a células mononucleares do sangue periférico (PBMC)-camada de plaquetas (entre mídia de gradiente de densidade e camadas de plasma) em um novo tubo de 50 mL contendo 40 mL de PBS - 1 mM EDTA. Top com PBS - 1 mM EDTA até 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 200 x g em temperatura ambiente por 5 min. descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células com 10 mL de tampão de coloração (PBS - 1 mM EDTA contendo albumina de soro bovino 0,5% BSA).</li>
	<li>Centrifugar a 200 x g em temperatura ambiente por 5 min. descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Repita os passos de 5.5 e 5.6.</li>
	<li>Ressuspender as células com 10 mL de tampão de coloração. Tome uma alíquota de 10 µ l para uma contagem de células.</li>
	<li>Populações de PBMC de verificar e contar as células rapidamente com um citômetro de fluxo. Nota: As populações de linfócitos e monócitos características podem ser observadas (figura 1A). De 50 mL de sangue humano fresco esperar sobre 50-100 x 106 PBMC.</li>
	<li>
Para o recrutamento de CD14 + contra CD14-PBMC sob fluxo:<ol>
<li>Lave o pellet três vezes com buffer de fluxo (M199 contendo 0,5% BSA) e ressuspender as células mononucleares no buffer de fluxo em 6 x 106 células / mL.</li>
		<li>Fazer alíquotas de 200 µ l para cada ensaio. Incube a 37 ° C até 20 min antes do ensaio.</li>
		<li>Adicione 5 µ l de anti-CD14-PE e Hoechst 33342 em uma concentração final de 2 µM para cada alíquota. Misturar e incubar a 37 ° C por 10 min.</li>
		<li>Centrifugue a alíquota a 400 x g durante 30 s.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 200 µ l de buffer de fluxo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para o recrutamento de subpopulações de monócitos sob fluxo:<ol>
<li>Isole os monócitos com um kit de isolamento de monócitos pan de acordo com as instruções do fabricante. Nota: O seguinte protocolo de isolamento é de 50 x 106 células. Pode ser escalado acima ou para baixo, enquanto está dentro as recomendações do fabricante.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de PBMC 200 x g em temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 400 µ l de tampão de coloração.</li>
		<li>Adicione 50 µ l de reagente de bloqueio de receptores Fc e 50 µ l de anticorpo Pan monócito cocktail.</li>
		<li>Incube a temperatura ambiente por 10 min.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de tampão e 100 µ l de conjugado anticorpo de antimagnético biotina grânulos de coloração. Incube a temperatura ambiente por 15 min.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de tampão de coloração e usar uma coluna de MACS LS juntamente com um ímã.</li>
		<li>Coloque a coluna é sobre o ímã e adicionar 1 mL de tampão de coloração. Descarte o escoamento.</li>
		<li>Passar a suspensão PBMC na coluna e coletar o fluxo desobstruído, embora contendo os monócitos pan em um novo tubo de 15 mL.</li>
		<li>Adicione o buffer de coloração para cima até 5 mL.</li>
		<li>Tomar uma alíquota e verificar a qualidade do isolamento de monócitos com um citômetro de fluxo.</li>
		<li>Determine a contagem de monócitos do pan. Nota: População de monócitos só pode ser observada (figura 1B).</li>
		<li>Centrifugue o restante de monócitos da etapa 5.11.11 a 200 x g por 5 min.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células em 5 mL de tampão de fluxo (M199 contendo 0,5% BSA).</li>
		<li>Repeti 5.11.13 para 5.11.14 duas vezes para eliminar qualquer vestígio de EDTA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fazer suspensão de monócitos no fluxo de buffer (M199 com 0,5% BSA) em 6 x 106 células/mL.</li>
	<li>Fazer alíquotas de 200 µ l de monócitos para cada ensaio de recrutamento.</li>
	<li>Manter a alíquota em 37 ° C na incubadora até 20 minutos antes da injeção.</li>
	<li>Adicione 5 µ l de anticorpo anti-CD16-PE e Hoechst 33342 (final de 2 µM) para cada alíquota.</li>
	<li>Misturar e incubar a 37 ° C por 10 min.</li>
	<li>Centrifugue a alíquota a 400 x g durante 30 s.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 250 µ l de buffer de fluxo.</li>
	<li>Adicione 30 µ l de suspensão de monócitos em uma câmara do slide para servir para definir os parâmetros de aquisição em microscópio confocal.</li>
	<li>Manter as alíquotas de suspensão de monócitos da etapa 5.18 a 37 ° C. Nota: Esta suspensão está pronta para ser injetado no sistema de fluxo.</li>
</ol>6. preparação do sistema fluídico
<ol><li>Assegurar que a incubadora de célula para a imagem, defina a 37 ° C. Nota: Um diagrama do sistema de fluxo é mostrado na Figura 2.</li>
	<li>Montar a parte de tubulação i: inserir um macho do conector Luer para uma extremidade de um pedaço de tubo de silicone (8 cm comprimento e 3 mm de espessura) e ligue a outra extremidade a um conjunto de injeção de Luer em linha. Conecte o conector Luer este último para um pedaço de tubo de silicone (40 cm e 3 mm de espessura) em uma extremidade. Nota: Opcionalmente, uma torneira de 3 vias, conectada a uma seringa de 5 mL pode ser inserida entre o conjunto de injeção de Luer em linha e o silicone tubulação para remoção de bolha de ar eventual.</li>
	<li>Montar a parte do tubo II: conectar uma extremidade de um comprimento de tubo de silicone (1 m de comprimento e 3 mm de espessura) com uma seringa de 20 mL. Inserir um macho do conector Luer para a outra extremidade do tubo.</li>
	<li>Conectar parte I e parte de tubulação II, inserindo os machos de conector Luer para um acoplador de trava Luer fêmea (Figura 2A).</li>
	<li>Colocar a extremidade livre do tubo de silicone no reservatório contendo o buffer de fluxo (M199 + 0,5% BSA) aquecido a 37 ° C.</li>
	<li>Puxe o êmbolo da seringa de 20 mL para encher o tubo com buffer de fluxo.</li>
	<li>Coloque a seringa na bomba e fixá-lo.</li>
	<li>Conjunto da bomba em retirar o modo (em oposição para infundir) e especificar a taxa de fluxo.</li>
	<li>Determine a taxa de fluxo de acordo com o slide IBIDI usado, usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58509/58509eq1.jpg"> Nota: O fator de slide é dependente o slide IBIDI usado para o experimento. Para o µ-slide eu0.4 Luer-lock usada neste exemplo, o fator de slide é 131,6. Para fatores de slide específico, consulte o site de empresa14. A viscosidade de buffer de fluxo é 0.0072 dyn.s/cm2. Tensão de cisalhamento nas vênulas pós-capilares é cerca de 0.5 dyn/cm2.</li>
	<li>
Conecte o slide (Figura 2B):
	<ol>
<li>Prenda o tubo de silicone ao redor o acoplador-fêmea Luer Lock e desconecte os dois machos de conector Luer o acoplador.</li>
		<li>Conectá-los para os reservatórios do slide contendo estimulada HUVEC e encha-o com o meio. Evite bolhas de ar durante esta etapa.</li>
		<li>Tire os grampos e certifique-se de que a conexão não está vazando.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque a lâmina ao microscópio para a imagem latente de lapso de tempo e comece a bomba.</li>
</ol>7. imagem lapso de tempo de recrutamento de monócitos sob fluxo por microscopia Confocal
<ol><li>Use um objectivo de 40x (ver Tabela de materiais) para a imagem latente.</li>
	<li>Ativar a 405 nm (núcleo de monócitos azul) 488 nm (células endoteliais verdes) e 561 lasers de nm (subconjunto CD16 + vermelho).</li>
	<li>Use a câmara que contém os monócitos para definir os parâmetros de aquisição. Nota: Para detectar tanto não-transmigra e transmigra monócitos, a pinhole e intensidade de laser 405 nm são definidas altas. Assim, não transmigra os monócitos são ligeiramente visíveis no plano basal. Entretanto somente transmigra monócitos apresentam uma área imaculada ao redor do núcleo correspondente para o novo espaço ocupado por baixo de células endoteliais.</li>
	<li>Coloque a câmara para ser adquirida sob o microscópio.</li>
	<li>Escolha 3 campos de pontos de vista num raio de 1 cm para a imagem latente confocal multi-posição.</li>
	<li>Definir o basal e os lados apicais das células endoteliais</li>
	<li>Defina um z-pilha ao intervalo 10 – 12 µm (passo de 0,5 µm). Execute uma aquisição de lapso de tempo cada 1 min.</li>
	<li>Após 3 min da imagem latente, injete 200 µ l de suspensão de monócitos (6 x 106 células/mL) através do orifício de injecção de Luer em linha. Nota: Rapidamente os monócitos aparecem no plano focal apical, aderir e começar a transmigração (trânsito do apical ao plano basal).</li>
	<li>Imagem pelo menos 30 min. Uma vez terminado, parar a imagem e parar o fluxo. Fixe o tubo para desconectá-los a partir do slide.</li>
	<li>Fixe o slide com paraformaldeído 4%, a 4 ° C por 10 min.</li>
	<li>Lave o slide com PBS e armazenar o slide a 4 ° C para posterior análise, se necessário.</li>
</ol>8. analisar os dados com ImageJ
<ol><li>Conte o número de monócitos aderentes totais em cada campo. Determine a contagem de células por mm2.</li>
	<li>Contagem de monócitos transmigra que estão presentes no plano basal por baixo de células endoteliais e identificados pela presença de um buraco negro (no canal verde) ao redor do núcleo.</li>
	<li>Divida a contagem de leucócitos transmigra pelo número total de leucócitos aderentes. A taxa de transmigração é apresentada como uma porcentagem de monócitos aderentes.</li>
	<li>Para ilustração, o apical e basais laterais podem ser mostradas simultaneamente para ilustrar os eventos que ocorrem em cada um desses compartimentos endoteliais.</li>
</ol>

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<li>Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1%2C+VCAM-1%2C+and+IL-8+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).</li>
<li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li>
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</ol>

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

Aqui, nós relatamos um método detalhando um estudo de como subpopulações de monócitos transmigrar através da monocamada endotelial inflamada. O método discutido usado microscopia confocal em vez de microscopia de contraste de fase, que também é usada para estudar o recrutamento de monócitos sob fluxo de11,3,19. Uma das principais vantagens do uso de microscopia confocal para a imagem latente de lapso de tempo é a capacidade de d...

Os monócitos constituem um componente fagocítica da imunidade inata que é essencial para o combate de patógenos, limpeza de tecidos danificados, angiogênese e a fisiopatologia de muitas doenças, incluindo câncer,1,2,3 . Os monócitos são células derivadas da medula óssea, compostas de subpopulações heterogêneas que circulam no sangue, mas podem ser recrutadas para o local da inflamação no tecido periférico, através de mecanismos moleculares específicos. As cascatas de recrutamento de monócitos, quanto aos leucócitos em geral, implica diferentes etapas, incluindo captura, rolando, rastejando, prisão, migração de transendothelial (transmigração) e migração através da parede do vaso (membrana basal e mural células)4. Estes passos envolvem principalmente moléculas induzida por inflamação na superfície luminal endotelial como selectinas, ligantes de glicoproteína, quimiocinas, moléculas de adesão intercelular e juncional e seus receptores em leucócitos como selectina ligantes e integrinas. Vias de tráfico através das junções de célula endotelial (paracellular) ou através do corpo de célula endotelial (transcellular) podem ser usadas por leucócitos de atravessar a barreira endotelial5. Enquanto os monócitos historicamente foram documentados a transmigrar através da rota de transcellular, potenciais divergências no seu percurso migratório têm sido propostas como os monócitos já não são considerados uma população celular homogênea. Agora está se tornando claro que a diversidade de monócitos podem ser definidos por cada uma das suas diferenças e semelhanças, com relação a sua distintivo extravasamento cascatas de3,6. Portanto, para inequivocamente discriminar entre subpopulações de monócitos, é crucial Visualizar e processar o fenótipo o comportamento de cada uma dessas subpopulações diferentes durante o recrutamento.
Monócitos do humano, porco, rato e rato foram subdivididos em subpopulações fenotípicas com determinadas funções anexam e comportamentos migratórios específicos7,8,9. Por exemplo, em humanos, monócitos podem ser divididos em três subgrupos com base em sua expressão de superfície de CD14, um co-receptor para lipopolissacarídeo bacteriano e CD16, o receptor de Fc-gama III. Subpopulações de monócitos humanos incluem CD14 clássica+CD16-, intermediário CD14+CD16+ e não-clássica CD14dimCD16 células de+ 6,9. O CD14 clássica+CD16– monócitos foram mostrados para ser inflamatória principalmente considerando que a piscina de CD16+ monócitos coletivamente foram encontrados para apresentar TIE2 expressão e proangiogenic função10. Consistentemente, estimulação de células endoteliais com citocinas inflamatórias, tais como necrose de tumor humano fator α (TNF) ou interleucina (IL-1) beta (inflamação convencional) é suficiente para desencadear o recrutamento completo de CD14 clássica+CD16 monócitos – . No entanto, ações simultâneas de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) A e TNFa (angiogênico orientada por fatores inflamação) são necessárias para provocar a transmigração do CD16+ proangiogenic piscina de monócitos3. Historicamente, o sistema tradicional de Transwell sob condições estáticas, a câmara de fluxo paralelo placa e câmaras de fluxo de µ-slide têm sido utilizados para analisar quantitativamente o recrutamento da população de leucócitos de um em um tempo em vitro11 ,12,13. Enquanto estes protocolos validados, um método mais robusto que permitiu a análise simultânea de várias subpopulações de monócitos seria considerado mais perspicaz. Tais metodologias devem contabilizar várias interações e as diferentes frequências de cada respectiva população e também fornecer uma compreensão mecanicista das semelhanças e especificidades para as cascatas de recrutamento que definem cada monócito subconjunto.
Aqui, apresentamos um método baseado sobre a lapso de tempo por imagens do recrutamento de monócitos sob fluxo que permite que o cascades migratórias de subpopulações diferentes monócitos para ser estudado simultaneamente usando microscopia confocal. Este método integra determinados recursos críticos que imitam a inflamação da célula endotelial, bem como a hemodinâmica de monócitos em vênulas pós-capilares, que circula o principal local de recrutamento de leucócitos em vivo. O método proposto utiliza células endoteliais veia umbilical humana (HUVEC), que são geradas através de um protocolo bem estabelecido de isolamento de cabos de cordão umbilical humanos. Este recurso clínico tem a vantagem de ser facilmente disponível como um subproduto biológico, e também proporcionar um rendimento razoável de células endoteliais, que podem ser isolados da veia umbilical. Também usamos corantes fluorescentes e imunofluorescência para distinguir entre os diferentes componentes celulares e microscopia confocal para definir inequivocamente monócito posicionamento (luminal vs abluminal) ao longo do tempo. O protocolo aqui apresentado foi desenvolvido a medida simultaneamente os níveis de transmigração de subpopulações de monócitos. Além disso, deve notar-se que esta metodologia pode ser estendida para estudar outras subpopulações de leucócitos e processos de recrutamento, pelo uso de diferentes biomarcadores e rotulagem.

<table><tbody><tr><td>Frascos de cultura de tecidos 75 cm2</td><td>TPP</td><td>90076</td><td>Cultura de rotina de HUVEC&</td></tr><tr><td>micro;-Slide VI isolado 0,4</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 15 mL</td><td>TPP</td><td>191015</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 mL</td><td>TPP</td><td>191050</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno G</td><td>Biochrom</td><td>L 7213</td><td>Para revestimento de cultura de células frascos</td></tr><tr><td>de gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1393</td><td>Para revestimento de frascos de cultura de células</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (sem MgCl2 e CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (com MgCl2 e CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Médio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>torneiras de 3 vias</td><td>BIO-RAD</td><td>7328103</td><td></td></tr><tr><td>penicilina 10.000 &mu;/mL estreptomicina 10.000 &mu; g/mL fungizone 25 &mu;/mL</td><td>AMIMED</td><td>4-02F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo 1</td><td>Worthington</td><td>LS004216</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 1x avec Sais de Earle, L-Glutamina, 25 mM Hepes</td><td>GIBCO</td><td>22340020</td><td></td></tr><tr><td>Fração de Albumina Bovina V</td><td>ThermoFisher</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de Crescimento de Células Endoteliais, 150 mg</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149RT</td><td></td></tr><tr><td>hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6909</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A 4544</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sal dissódico di-hidratado C10H14N2Na2O8 &middot; 2H2O</td><td>APPLICHEM</td><td>A2937.0500</td><td></td></tr><tr><td>CD144 (VE-Cadherin), clone recombinante humano: REA199, FITC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-100-713</td><td>AB_2655150</td></tr><tr><td>anticorpo CD31-PE, clone recombinante humano: REA730, PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-110-807</td><td>AB_2657280</td></tr><tr><td>Anti-Podoplanina-APC, clone recombinante humano: REA446, APC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-107-016</td><td>AB_2653263</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Plus</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide I Luer</td><td>IBIDI</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>CMFDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceína)</td> <td>ThermoFisher</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>TNF humano recombinante e alfa;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr> Bomba de Seringa Programável <tr><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NE-1000</td> Recombinante humana <td>KF Technology</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp; Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>CD14-PE anti-humano, clone recombinante humano: REA599, PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-110-519</td><td>AB_2655051</td></tr><tr><td>Kit de isolamento de monócitos Pan, humano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-537</td><td></td></tr><tr><td>CD16-PE anti-humano, clone recombinante humano: REA423, PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-106-762</td><td>AB_2655403</td></tr><tr><td>colunas LS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separador QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Tricloridrato, Trihidrato</td><td>ThermoFisher</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone</td><td>IBIDI</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>Cotovelo Luer Conector</td><td>IBIDI</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Fêmea Luer Lock Acoplador</td><td>IBIDI</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Conector Luer Lock Fêmea</td><td>IBIDI</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>In-line Luer Injection Port</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ar1 microscópio confocal</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x objetiva</td><td>Nikon</td><td>40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correção 0-2mm</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo in vitro

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

O recrutamento de monócitos do sangue para os tecidos periféricos alvo é fundamental para o processo inflamatório durante a lesão tecidual, desenvolvimento de tumor e doenças auto-imunes. Isto é facilitado através de um processo de captura de fluxo livre para a superfície luminal das células endoteliais ativadas, seguido de sua migração de adesão e transendothelial (transmigração) no tecido afetado subjacente. No entanto, os mecanismos que suportam o recrutamento preferencial e contexto-dependente de subpopulações de monócitos são ainda não são totalmente conhecidos. Portanto, nós desenvolvemos um método que permite o recrutamento de subpopulações diferentes monócitos para ser visualizado e medido sob fluxo simultaneamente. Este método, baseado na imagem latente confocal lapso de tempo, permite a distinção inequívoca entre monócitos aderentes e transmigra. Aqui, descrevemos como esse método pode ser usado para estudar simultaneamente a cascata de recrutamento de monócitos pro-angiogênico e não-angiogênico in-vitro. Além disso, este método pode ser estendido para estudar as diversas etapas do recrutamento de até três populações de monócitos.

Determinando o estado de ativação HUVEC induzida por TNFa
A bio-atividade das citocinas inflamatórias TNFa pode ser variam de acordo com o lote e o repletion do ciclo de congelamento-descongelamento. É importante verificar o status de ativação de HUVEC com tratamento de TNFa. Isso poderia ser realizada pela coloração em paralelo algumas amostras de HUVEC confluente para a indução inflamatória de selectinas, ICAM-1 e VCAM-1<sup clas...

Aqui, apresentamos um protocolo integrado que mede subpopulação de monócitos tráfico sob fluxo in vitro pelo uso de marcadores de superfície específicas e microscopia de fluorescência confocal. Este protocolo pode ser usado para explorar etapas sequenciais de recrutamento, bem como perfil de outros subtipos de leucócitos usando outros marcadores de superfície específicos.

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Pois este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da inflamação e imunologia. Por exemplo, quais são os mecanismos moleculares de adesão leucócito e migração trans-endotelial. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a discriminação de uso ilimitado entre transmigração e forte adição de monócitos à monocamadas endotelial.Embora este método forneça informações sobre o recrutamento de monócitos no fluxo, ele também pode ser adaptado a outras células dos sistemas hematopoiéticos, como células T, células B ou derivados da subpopulação. Após a lavagem, rotule as células endoteliais da veia umbilical humana ou HUVEC com 30 microliters de 37 graus Celsius M199 médio suplementado com um CMFDA micromolar por 10 minutos a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono. Ao final da incubação, lave as células com 150 microliters de meio M199 completo e incuba a cultura em 150 microliters de meio M199 completo fresco por mais 30 minutos.Em seguida, substitua o supernascer por 150 microliters de meio M199 completo contendo os suplementos experimentais apropriados e devolva a cultura da câmara de slides à incubadora por seis horas. Para o isolamento monócito PAN humano, diluir uma amostra de sangue recém-coletada em PBS suplementada com um EDTA mililitro em uma razão de um para um e cuidadosamente camada 20 ml da solução sanguínea em 20 ml de média gradiente de densidade para separação gradiente de densidade por centrifugação. Colete a camada de plaquetas de células mononucleares de sangue médio em um novo tubo de 50 ml contendo 40 ml de PBS complementado com 1 mililitro EDTA e leve o volume final a 50 ml com PBS-EDTA adicional Após a contagem, isole os monócitos com o kit de isolamento de monócito PAN de acordo com a instrução do fabricante.E lave as células três vezes em m199 médio suplementado com 0,5% Bovine Serum Albumin, ou BSA, para eliminar quaisquer traços de EDTA. A qualidade do isolamento monócito é fundamental para garantir uma transmigração robusta e resultado de adesão. Assim, é importante seguir rigorosamente a recomendação do fabricante para o isolamento.Resuspenque a pelota a uma concentração de 6 vezes 10 a 6 monócitos por ml em m199 médio fresco complementado com 0,5% BSA e divida as células em uma alíquota de 200 microliter por tubo de microcentrifuagem por ensaio de recrutamento. Em seguida, coloque as células a 37 graus Celsius por 20 minutos antes de sua injeção na câmara de fluxo. Para preparar o sistema fluido para a análise, insira primeiro um conector luer masculino em uma extremidade de uma tubulação de silicone de 3 mm de comprimento e conecte a outra extremidade a um conjunto de injeção de luer inline.Em seguida, conecte o conector luer a uma extremidade de uma tubulação de silicone de 3 mm de comprimento de 40 cm de comprimento. Em seguida, a seringa de 20 mm para uma extremidade de um pedaço de tubo de silicone de 3mm de comprimento e 1 m de espessura e inserir um conector luer masculino para a outra extremidade. Em seguida, insira ambos os conectores luer machos em um acoalador de travas luer fêmea e coloque a extremidade livre da tubulação de silicone em um reservatório de 37 graus Celsius M199 médio suplementado com 0,5%BSA.Retire o êmbolo para encher a tubulação com tampão de fluxo e fixe a seringa na bomba de seringa. Em seguida, ajuste a bomba para o modo de retirada e especifique a taxa de fluxo. Para conectar a câmara de slides, fixar a tubulação de silicone ao redor do acotrador de luer feminino e desconectar os dois machos conectores luer do acotraente para permitir que eles sejam conectados ao reservatório do slide.As bolhas de ar não só perturbam a qualidade da imagem, mas também induzem o estresse capilar às células, levando à morte celular. Para evitar bolhas de ar, confirme a fixação correta da tubulação antes de inserir o luer no reservatório. Em seguida, remova os grampos para confirmar que a conexão não está vazando e coloque o slide sob o microscópio.Para a imagem do recrutamento de monócitos sob fluxo, adicione 5 microlitadores de farinha conjugada anticorpo anti CD16 e um corante nuclear apropriado a cada monócito aliquoed para uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente e colete as células com uma breve centrifugação. Resuspenque a pelota em 250 microliters de tampão de fluxo e inicie a bomba de seringa. Adicione 30 microlitros de uma suspensão monocito a uma câmara do slide e selecione o objetivo de 40X no microscópio confocal.Ative os lasers fluorescentes apropriados e use a câmara com o monócito rotulado para definir os parâmetros de aquisição do microscópio confocal Next, selecione três campos de visão dentro de um raio de meio centímetro para imagens confocal de posição multi-posição, e defina uma pilha Z para a faixa de 10 a 12 micrômetros e a aquisição de lapso de tempo para ser executada a cada um minuto. Após três minutos de imagem, injete 200 microliters de monócitos através da porta de injeção de luer inline e comece a fotografar a interação celular. Após pelo menos 30 minutos, pare a imagem e o fluxo e aperte a tubulação para permitir que ela seja desconectada do slide.Para determinar a taxa de transmigração das células através dos HUVECs estimulados, abra a imagem J e conte o número total de monócitos aderentes em cada campo para determinar a contagem de células por milímetro quadrado. Em seguida, conte o número de monócitos transmigrados que estão presentes no plano basal sob as células endoteliais, conforme identificado pela presença de uma zona de buraco negro ao redor do núcleo. Uma maneira simples de verificar o estado de ativação dos HUVECs após a estimulação é visualizar seu alongamento sob estresse inflamatório.A imagem confocal de lapso de tempo permite a visualização dos monócitos no plano apical onde seu fenótipo pode ser avaliado. As células migratórias submetidas à transmigração movem-se para a junção intercelular célula-celular antes que elas desapareçam do plano apical e reapareçam no plano basal. A quantitação do recrutamento de monócitos ao longo do tempo confirma que a adesão monócito é seguida pela transmigração.A taxa de transmigração do monócito positivo CD16 é baixa quando a célula endotelial é estimulada apenas com TNF alfa, mas aumenta quando as células endoteliais são estimuladas com fator de crescimento endotelial TNF e vascular ou VEGFA. A estimulação HUVEC com TNF alfa e TNF alfa mais VEGFA induz um aumento na adesão às células T, B e NK negativas cd14, em comparação com monócitos positivos CD14. Além disso, a estimulação huvec induz a transmigração apenas da população monócito, já que as células T, B e NK não transmigram sob as condições estimulatórias TNF alfa ou TNF alpha mais VEGFA.Para realizar um ótimo ensaio de recrutamento de monócitos, é importante que você planeje seu experimento com antecedência e faça-o no mesmo dia. E quando você purificar as células, certifique-se de que seu microscópio está a 37 graus para que você não transfira as células para uma temperatura diferente durante o experimento. Para aprender esse procedimento, todos os métodos como o perfil da expressão de citocina huvec e quimiocina, bem como estudos de quimiotaxis podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o mecanismo molecular que sustenta a transmigração e a adesão da população específica de monócitos.

simultaneous-study-recruitment-monocyte-subpopulations-under-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para explorar a influência imunomoduladora das células-tronco mesenquimais (MSCs) na proliferação de células T efetoras. O ensaio inclui a co-cultura de MSCs com PBMCs para induzir a população de monócitos a adquirir um fenótipo imunomodulador, levando à secreção de interleucina-10 (IL-10). Após a incubação com células T CD4+ ativadas, os monócitos induzidos suprimem efetivamente a proliferação de células T.

Um ensaio in vitro para avaliar o impacto imunomodulador dos monócitos na proliferação de leucócitos

O vídeo demonstra um método para investigar o impacto das células estromais no recrutamento de leucócitos. Em um modelo de câmara de fluxo de placas paralelas, citocinas pró-inflamatórias induzem a expressão de receptores de adesão pelas células endoteliais, facilitando o recrutamento e a migração de neutrófilos. A conversa cruzada entre células estromais e células endoteliais diminui o recrutamento de neutrófilos para as células endoteliais.

Uma investigação de fluxo in vitro do efeito das células estromais no recrutamento de leucócitos

Recrutamento de leucócitos para o fígado ocorre dentro dos canais especializados dos sinusóides hepáticos, que são revestidas por células endoteliais sinusoidais hepáticas únicas. Microscopia de contraste de fase de recrutamento de leucócitos através do endotélio sinusoidal hepática humana em condições de tensão de cisalhamento fisiológico pode facilitar a elucidação dos mecanismos moleculares que estão na base deste processo.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Aqui, nós apresentamos um protocolo que permite ao investigador para avaliar a dinâmica de recrutamento de leucócitos ex vivo, ligando uma câmara revestida com moléculas de adesão endoteliais derivados de para o sistema circulatório de um rato. Este método oferece vantagens significativas, uma vez que permite a avaliação de leucócitos em condições biológicas relativos.

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um Ex Vivo Autoperfused Microflow Câmara Assay

A capacidade do endotélio inflamado para recrutar leucócitos do fluxo é regulado por células estromais mesenquimais. Descrevemos dois modelos in vitro que incorporam as células humanas primárias que podem ser utilizadas para avaliar o recrutamento de neutrófilos a partir do caudal e examinar o papel que as células estromais mesenquimatosas jogar na regulação neste processo.

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Os monócitos são componentes integrais do sistema imunológico inato humano que dependem do metabolismo glicolítico quando ativados. Descrevemos um protocolo de citometria de fluxo para medir a expressão do transportador de glicose e a captação de glicose por monócitos totais e subpopulações de monócitos em sangue total fresco.

A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Descreveremos um protocolo para medir transmigração por monócitos em monocamadas endoteliais humanas e sua maturação subsequente em células de espuma. Isso fornece um método versátil para avaliar as propriedades aterogênico de monócitos isoladas de pessoas com doenças diferentes condições e avaliar fatores no sangue que pode melhorar esta propensão.

Quantificação de transmigração de monócitos e formação de célula de espuma de indivíduos com doenças inflamatórias crônicas

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Aqui nós apresentamos um protocolo para caracterizar subconjuntos de monócitos por citometria de fluxo de sangue total. Isso inclui como portão os subconjuntos e avaliar sua expressão de marcadores de superfície de estrutura de tópicos e dando um exemplo da avaliação da expressão de marcadores M2 (anti-inflamatório) e M1 (inflamatória).

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Aqui nós apresentamos um protocolo para quantificar a atividade Quimiotáticos de monócitos do sangue em modelos do rato, para avaliar os efeitos de intervenções nutritivas, farmacológicas e genéticas no monocyte do sangue e para caracterizar os macrófagos derivados do sangue dos monócitos em modelos de mouse usando o monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-carregado porão membrana-derivado gel plugs.

Quantificação da atividade quimiotática de monócitos in vivo e caracterização de macrófagos derivados de monócitos sanguíneos

Aprenda a medir o tráfego de subpopulações de monócitos sob fluxo in vitro usando marcadores de superfície específicos e microscopia confocal de fluorescência. Este protocolo integrado permite distinguir transmigração e adesão celular.

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

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