Quantificação de microrganismos em baixas concentrações, utilizando microscopia holográfica Digital (DHM)

O objetivo geral deste experimento é demonstrar a detecção de microrganismos em níveis muito baixos usando microscopia holográfica digital. Essa técnica é mais sensível do que a microscopia de luz tradicional e fornece informações em tempo real sobre o comportamento bacteriano. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos biológico e cosmológico, como a busca de organismos patogênicos na água ou vida em nosso sistema solar em luas geladas.

A principal vantagem dessa técnica é que o DHM é uma técnica volumétrica, o que significa que podemos capturar informações tridimensionais em nossa amostra instantaneamente, sem a necessidade de reorientar fisicamente. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de infecções da corrente sanguínea ou do líquido cefalorraquidiano devido à capacidade de detectar baixas concentrações bacterianas. Para iniciar este procedimento, no dia do experimento, faça uma leitura espectrofotométrica da cultura principal bacteriana, que deve estar na faixa de 0,6 a 0,7.

Em seguida, pegue uma amostra da cultura mestre e conte as células diretamente usando uma câmara de contagem de Petroff-Hausser para enumerar as células vivas e mortas. Transferir uma amostra de 10 microlitros da cultura não diluída com uma micropipeta para a câmara. Visualize-o sob um microscópio de objetiva altamente seco usando contraste de fase.

Posteriormente, conte as bactérias em pelo menos 20 quadrados e calcule a média. Calcular a concentração como a média de 20 quadrados vezes o factor de diluição. Para enumerar apenas células vivas, faça uma diluição seriada de cada uma das amostras bacterianas selecionadas com solução salina estéril a 0,9%, transferindo 20 microlitros da solução bacteriana para outro poço e diluindo-a com 180 microlitros de solução salina.

Repita o procedimento até que a concentração mais baixa seja de aproximadamente 10 a três células por mililitro. Em seguida, pegue 100 microlitros das amostras de pelo menos duas diluições e coloque-as nas placas de mídia sólida apropriadas. Espalhe-os com um espalhador estéril e faça pelo menos três réplicas de cada diluição.

Depois disso, incube-os a uma temperatura adequada durante a noite ou até que as colônias cresçam. Em seguida, conte as colônias. Calcule as unidades formadoras de colônias e calcule a média das réplicas.

Neste procedimento, fazer diluições seriadas da cultura mestra para DHM e contagem pós-DHM de UFC em placas de meio de caldo de lisogenia. Dilua as bactérias em 25 mililitros de um meio mínimo que estimule a motilidade, mas iniba a divisão celular para que a concentração de células não mude sensivelmente durante o experimento. Para gravar vídeos DHM, usando uma seringa estéril, aspire cerca de 10 mililitros da diluição de interesse.

Em seguida, conecte a seringa à câmara de amostra DHM usando conexões e tubos estéreis. Flua a amostra da seringa através da câmara de amostra continuamente usando uma bomba de seringa. À medida que a amostra flui pela câmara de amostra, adquira hologramas consecutivamente em uma taxa de quadros apropriada.

Aguarde tempo suficiente para que todos os 10 mililitros de amostra fluam através do DHM. Para garantir que as bactérias não estejam crescendo ou morrendo durante os experimentos, inocule as placas de mídia enriquecida com 100 microlitros da captura de imagem pós-DHM da mídia gasta, espalhando-a com um espalhador estéril. Em seguida, incube-os na temperatura apropriada por 24 horas antes de contar as colônias.

Ter contagens de células precisas é essencial para determinar quantitativamente os limites de detecção. É importante fazer todas as diluições com muito cuidado usando micropipetas calibradas e confirmar todas as contagens por densidade óptica, plaqueamento e contagem direta na câmara de Petroff-Hausser. Para analisar os dados de presença bacteriana nos vídeos de holograma adquiridos, conduza a filtragem subtraída por meio primeiro convertendo as imagens para um formato de 32 bits.

Em seguida, calcule o valor médio do pixel. Por fim, subtraia esse valor mediano de cada pixel respectivo para eliminar artefatos estacionários no holograma. Depois disso, conte o número de anéis de área visíveis e células em foco manualmente.

Cada série de hologramas será acompanhada por um arquivo de carimbo de data/hora. Use o arquivo de carimbo de data/hora para calcular a quantidade total de amostra bombeada no momento em que a imagem foi capturada. Em seguida, calcule a densidade celular dividindo o número total de células detectadas pelo volume total da amostra fotografada.

Média de cinco a 10 quadros para estatísticas precisas. Este gráfico mostra as células previstas por campo de visão com base em um volume de amostra de 365 micrômetros por 365 micrômetros por um milímetro. Para concentrações em que o número de células por campo de visão cai abaixo de um, várias imagens são necessárias para obter a detecção.

Esta é uma sequência de holograma DHM de uma cultura de Serratia marcescens a 2.100 células por mililitro medida pela contagem de placas. A sequência mostra uma célula aproximadamente a cada um ou dois segundos, o que é um excelente ajuste para a previsão. E esta é outra sequência de holograma DHM de uma cultura de Serratia marcescens a 620 células por mililitro medida pela contagem de placas.

Esta sequência mostra uma célula aproximadamente a cada seis a sete segundos. Ao usar microscopia holográfica digital para células de imagem, lembre-se de usar técnicas de esterilização por filtro na preparação de todas as soluções. Isso evitará a introdução de material particulado no instrumento.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar culturas de células saudáveis e ter meio de crescimento extra, placas e meio de motilidade à mão. Após este procedimento, outros métodos, como coloração fluorescente, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a porcentagem de células vivas versus mortas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da microbiologia explorarem a motilidade tridimensional em células cultivadas e amostras ambientais.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como enumerar bactérias usando microscopia holográfica e validar os resultados usando outras técnicas de contagem. Não se esqueça de que trabalhar com culturas bacterianas pode ser extremamente perigoso. Precauções apropriadas de biossegurança devem sempre ser tomadas ao cultivar e manusear organismos vivos.