Multimodal Quantitative Fase de imagem com o Digital Holographic Microscopia com precisão Avalia Cura inflamação intestinal e epitelial de Feridas
13 de setembro de 2016
A avaliação precisa dos efeitos anti-inflamatórios é de extrema importância para a avaliação de novos medicamentos potenciais para o tratamento da doença inflamatória intestinal. A microscopia holográfica digital fornece avaliação da inflamação em amostras de tecido colônico murino e humano, bem como avaliação multimodal automatizada da cicatrização de feridas epiteliais in vitro.
O objetivo geral deste estudo é usar microscopia holográfica digital ou DHM para fornecer imagens de contraste de fase quantitativas automatizadas e sem manchas de amostras de tecido colônico de inflamação intestinal para a avaliação multimodal da cicatrização de feridas epiteliais in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da inflamação gastrointestinal e cicatrização de feridas sobre a atividade da doença inflamada humana e marinha A principal vantagem desta técnica é que ela permite a detecção e quantificação de células e tecidos por parâmetros físicos de forma objetiva e sem manchas. Demonstrando os procedimentos estará Fittest Ketelhut, um técnico, do Centro de Tecnologia Biomédica.
Configure a cultura de células, incube quatro vezes dez elevado ao quinto, Caco duas células por centímetro quadrado em placas de Petri de 35 milímetros equipadas com inserções de alta cultura em meio RPMI suplementado com FBS e antibióticos a 37 graus Celsius em 95% de umidade e cinco por cento de dióxido de carbono. Após dois dias, trate as células com o agente de interesse e devolva as culturas à incubadora por mais 24 horas. No dia seguinte, aspire o sobrenadante e use uma pinça para remover as inserções.
Lave a cultura uma a duas vezes com um mililitro de meio de cultura de células tamponadas HEPES para remover quaisquer células mortas e quaisquer componentes celulares remanescentes da área da ferida. Em seguida, adicione dois mililitros de HEPES fresco tamponado e feche o prato. Agora coloque a placa de Petri no microscópio holográfico digital e selecione a objetiva de 10 x.
Abra o software de aquisição de imagem e selecione o modo de imagem de campo claro. Defina a câmara de aquecimento para 37 graus Celsius e coloque a cultura na câmara de aquecimento. Em seguida, mova o campo de visualização até que uma ferida adequada com uma única camada de células enormes e bordas retas em ambos os lados sem células mortas ou soro possa ser visualizada na janela de monitoramento ao vivo.
Capture uma imagem de luz branca da área inicial da ferida. Em seguida, desligue a iluminação de luz branca e selecione o modo de microscopia holográfica digital. Ligue a iluminação do laser e selecione um tempo de exposição inferior a três milissegundos para a gravação do holograma.
Se as franjas de interferência holográficas fora do acesso aparecerem com um contraste adequado, capture um holograma de amostra e reconstrua uma imagem de fase quantitativa com o software de reconstrução para verificar a qualidade da imagem. Em seguida, inicie uma observação DHM com lapso de tempo da ferida, interrompendo a gravação no ponto final apropriado e obtenha uma imagem final da amostra sob iluminação de luz branca. Para indução aguda de sulfato de sódio dextrano, ou indução de colite DSS, forneça três gramas de DSS dissolvidos em 100 mililitros de água autoclavada para camundongos ablibidim.
Após sete dias, obter sete micrômetros de espessura de amostras de cólon enrolado suíço dos animais controle e tratados. Mergulhe cada seção em 50 a 100 micro litros de PBS e cubra as amostras com lamínulas de vidro individuais. Confirme se o fundo das lâminas está livre de poeira e outras contaminações.
Em seguida, coloque a primeira lâmina no microscópio stage e ajuste o campo de view até que a área de interesse do tecido esteja visível. Traga a amostra para um foco nítido e capture uma imagem de campo claro no software de aquisição de imagem. Em seguida, selecione o modo de imagem DHM e mude para a iluminação da luz laser.
Defina um tempo de exposição inferior a três milissegundos e confirme se as franjas holográficas de interferência de acesso desligado aparecem com um contraste adequado na janela de imagem ao vivo. Em seguida, capture um holograma digital do tecido. Endoscopicamente, a evidência de colite moderada a grave inclui espessamento da parede colônica, alterações do padrão vascular, alterações das fibras e granularidade da superfície da mucosa.
A avaliação histológica convencional dos cortes colônicos revela um edema acentuado na parede colônica dos animais tratados com SDS versus os animais controle predominantemente localizados na submucosa. As imagens quantitativas correspondentes de contraste de fase DHM e os mapas de índice de refração relacionados também demonstram que essas alterações teciduais sem diferenças visíveis nas densidades do menstroma epitelial são especialmente aparentes nas amostras de tecido nativo não corado. O índice de refração é significativamente reduzido no epitélio, submucosa e estroma dos camundongos colíticos em comparação com os controles saudáveis, com uma correlação significativa entre a perda relativa de peso corporal e o índice de refração nos animais experimentais.
Aqui é mostrado o monitoramento contínuo representativo de um ensaio de cicatrização de feridas por microscopia holográfica digital durante 45 horas. Permitindo os cálculos da área de superfície coberta pela célula, espessura celular média e massa seca celular ao longo do processo de cicatrização. Mostramos que o DHM permite o monitoramento contínuo da cicatrização de feridas epiteliais e, ao mesmo tempo, fornece informações bioessenciais sobre as alterações celulares induzidas por citocinas.
Além disso, demonstramos a avaliação precisa do dano histológico em modelos de colite e amostras de tecido colônico humano por DHM por meio da medição de alterações no índice de refração. Como o DHM é baseado na detecção do atraso dos comprimentos do caminho óptico, os parâmetros biofísicos absolutos, como densidade do tecido, massa seca ou espessura celular, podem ser analisados por imagens quantitativas de contraste de fase sem manchas. O ponto culminante do DHM com microscópios de pesquisa comuns e a robustez da técnica abrem caminho para aplicações rotineiras desse método em biologia celular e patologia digital.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como usar a microscopia holográfica digital para a análise de tecidos de culturas de células vivas no ambiente de laboratório biomédico. Em conclusão, o DHM cria uma ferramenta valiosa, nova e quantitativa para avaliação dos parâmetros absolutos da inflamação, bem como para a quantificação simplificada de epitélio voluntário in vitro com alto potencial para uso em diagnóstico translacional.
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Visão Geral
Este estudo utiliza microscopia holográfica digital (DHM) para a imagem quantitativa automatizada e livre de corantes da inflamação intestinal em amostras de tecido colônico. O método tem como objetivo aprimorar a avaliação da cicatrização de feridas epiteliais in vitro, fornecendo informações sobre a inflamação gastrointestinal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Gastroenterologia
Contexto
- A doença inflamatória intestinal requer uma avaliação precisa dos efeitos anti-inflamatórios.
- O DHM permite imagens objetivas sem necessidade de coloração.
- A técnica pode quantificar parâmetros celulares e teciduais de forma eficaz.
- Compreender a inflamação e a cicatrização de feridas é essencial na pesquisa gastrointestinal.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a inflamação intestinal em amostras de tecido colônico.
- Avaliar a cicatrização de feridas epiteliais in vitro utilizando DHM.
- Fornecer uma abordagem multmodal para o estudo da inflamação gastrointestinal.
Métodos Utilizados
- Microscopia holográfica digital para imageamento.
- Cultivo celular de células Caco-2 em ambiente controlado.
- Tratamento das células com agentes de interesse após incubação.
- Análise automatizada de inflamação e cicatrização de feridas.
Resultados Principais
- DHM quantifica eficazmente a inflamação em tecidos murinos e humanos.
- A imagem automatizada fornece dados objetivos sobre a cicatrização de feridas epiteliais.
- O método demonstra potencial para avaliação de fármacos na doença inflamatória intestinal.
- Os resultados apoiam o uso de DHM na pesquisa gastrointestinal.
Conclusões
- A microscopia holográfica digital é uma ferramenta valiosa para avaliar a inflamação intestinal.
- A técnica aprimora a compreensão da cicatrização de feridas epiteliais.
- A MHD pode auxiliar no desenvolvimento de novos tratamentos para doenças inflamatórias intestinais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia holográfica digital (DHM) fornece imagem de contraste de fase quantitativa e livre de corantes, que permite a avaliação objetiva da inflamação intestinal e da cicatrização de feridas epiteliais sem alterar a integridade da amostra. Essa capacidade apoia a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos para doenças inflamatórias intestinais (DII), fornecendo parâmetros biofísicos absolutos, como densidade tecidual, massa seca e espessura da camada. O método aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao reduzir a variabilidade associada à coloração e à interpretação histológica subjetiva, melhorando assim a continuidade translacional do estágio de descoberta ao desenvolvimento pré-clínico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de alterações no índice de refração como correlato direto de mudanças na densidade tecidual em tecido colônico inflamado.
- Valor Operacional: Oferece quantificação objetiva e livre de marcadores das alterações inflamatórias ao longo das camadas do tecido, reduzindo a dependência de escores histológicos baseados na avaliação de especialistas.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança preditiva na validação de alvos por meio da correlação significativa entre alterações no índice de refração e marcadores de atividade da doença, como perda de peso corporal em modelos de colite.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Facilita a preparação de sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes, permitindo o monitoramento contínuo e automatizado da cicatrização de feridas epiteliais in vitro.
- Valor Operacional: Permite a determinação simultânea da área lesionada, da massa seca celular e da espessura da camada, fornecendo leituras multiparamétricas para triagem de compostos.
- Prontidão do Ensaio: Permite a quantificação escalonável e reprodutível da dinâmica de cicatrização ao longo do tempo, apoiando a reutilização da plataforma na avaliação de compostos anti-inflamatórios e de reparação tecidual.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Demonstra aplicabilidade tanto para amostras de tecido colônico murino quanto humano, reforçando a relevância para a fisiopatologia humana.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Quantifica alterações estromais e epiteliais em modelos de colite sem coloração, permitindo compreensão mecanicista dos efeitos do fármaco no nível tecidual.
- Alinhamento Pré-clínico: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao fornecer desfechos quantitativos e reprodutíveis para os processos de dano histológico e reparação de feridas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A MHID integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos promissores e a avaliação pré-clínica, particularmente para vias de inflamação gastrointestinal e reparo da mucosa.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao quantificar alterações biofísicas sem marcação na densidade tecidual e na morfologia celular durante a inflamação e a cicatrização.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de imagens automatizadas com intervalos de tempo definidos do fechamento de feridas e medição simultânea de massa seca e espessura, permitindo avaliação confiável de compostos.
- Análises: Gera resultados quantitativos, incluindo mapas de índice de refração, densidade tecidual, massa seca e espessura de camadas, facilitando comparações objetivas entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica por meio de aplicabilidade comprovada em modelos de colite em camundongos e espécimes de tecido humano.
- Reutilização Empresarial: Posiciona a DHM como uma capacidade reutilizável e compatível com plataformas para imagem quantitativa sem marcação em múltiplos modelos de doenças e tipos celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva por meio da quantificação absoluta e livre de corantes de parâmetros biofísicos, reduzindo a ambiguidade mecanicista em ensaios de inflamação e cicatrização de feridas.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio da aquisição e análise automatizadas de imagens, minimizando a variabilidade dependente do usuário.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao fornecer dados objetivos e multiparamétricos que reduzem o risco biológico em estágios avançados no desenvolvimento de terapias para doenças inflamatórias intestinais (IBD).
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em desfechos histológicos e funcionais quantitativos de cicatrização de feridas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em imagem de fase quantitativa e reconstrução digital holográfica para interpretação precisa dos dados.
- Depende de instrumentação capaz de captura de hologramas a laser e software de reconstrução de fase com controle ambiental (por exemplo, câmara aquecida).
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de imagem e dos fluxos de análise para garantir consistência entre equipes de descoberta e pré-clínicas.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar a técnica em diferentes sistemas modelo (por exemplo, monocamadas 2D versus secções de tecido 3D), mantendo a fidelidade quantitativa.
- Limitado pelo campo de visão e restrições de resolução ao avaliar grandes áreas de tecido, embora seja adequado para análise histológica e celular direcionada, conforme demonstrado em tecido colônico e ensaios de cicatrização de feridas.
