Name: Multimodal Quantitative Fase de imagem com o Digital Holographic Microscopia com precisão Avalia Cura inflamação intestinal e epitelial de Feridas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda a usar microscopia holográfica digital para avaliar inflamação intestinal e cicatrização epitelial sem coloração. Este método quantitativo oferece dados objetivos para pesquisa em gastroenterologia.

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Agradecemos a Faekah Gohar pela revisão do manuscrito. Agradecemos a Sonja Dufentester e Elke Weber pela assistência técnica especializada.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comité regional de ética (o Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Alemanha) de acordo com a Lei de Protecção dos Animais alemã. O comitê de ética local da Universidade de Münster aprovou o uso de tecidos humanos para análise histológica e microscópio. 1. Os animais e Materiais <ol><li> Use mulher ou ratos machos da estirpe DSS-suscetíveis exigia que pesam de 20 a 25 g, e casa de acordo com a legislação local cuidados com os animais. Forneça ração especial para roedores e autoclavado beber água ad libitum. </li><li> Induzir a colite DSS aguda por administração de 3% w / v de sulfato de dextrano de sio (DSS, peso molecular: 36,000-50,000 Da) em água da torneira tratada em autoclave durante 5 dias. NOTA: A potência de DSS é altamente variável dependendo do fabricante e lote. Teste o seu DSS fornecidos pelo fornecedor primeira para a indução da atividade da doença, para a qual daily peso corporal é um indicador confiável e objetiva. </li><li> Para a avaliação histológica de amostras de tecido do cólon, eutanásia ratos por insuflação de CO 2 (ou, conforme especificado pelas normas nacionais e institucionais) no final da experiência. </li></ol> 2. Configuração experimental para DSS-colite e In-vitro Wound Healing &#39;Ensaios <ol><li> Cultura de células e ensaio de estabelecimento de cicatrização de feridas. <ol><li> Crescer as células Caco-2 em uma humidade relativa de 95% e 5% de CO 2 ambiente a 37 ° C. Use meio RPMI com soro a 10% de bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Semente células Caco-2 a uma densidade de 4 x 10 5 células / cm2 em 35 mm pratos Petri com alta-cultura de inserção (ver Figura 4A). NOTA: O inserto gera duas áreas de células cobertas que são separados por um espaço livre de células definida que representa a área de ferida a ser analisado. </li><li> Alterar meio de dois dias após seeding. Realizar por aspiração primeiro meio residual com restos de células, usando uma pipeta automática, lave com 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicionar meio fresco ou meio RPMI privadas de soro. </li><li> células de cultura durante 24 horas em meio privado de soro (0,1% FBS) suplementado com 20 ng de EGF / ml de soro ou 2 mg de mitomicina c / ml de soro para detectar alterações no comportamento cicatrização das feridas. Adicionar meio normal RPMI com células de controlo, durante 24 h. </li><li> Após 24 h de cultura, remover e descartar inserções de cultura tal como descrito no passo 3.4 e executar DHM. </li></ol></li><li> A indução de colite DSS aguda <ol><li> Dissolve-se 3 g de DSS em 100 ml de água autoclavada para obter um 3% (w / v) de solução de DSS. Fornecer esta solução no lugar de água potável para ratos ad libitum durante 7 dias. Calcule 5 ml de DSS-solução por rato / dia. Fornecer água autoclavada sem DSS para os ratos de controlo ad libitum. </li></ol></li><li> Preparação de secções de criostato de murino e humano do cólon<ol><li> Eutanásia ratos por insuflação de CO 2 no final da experiência. </li><li> Dissecar abdómen dos animais, de laparotomia 23. Remover todo o cólon cuidadosamente usando uma pinça e cortar o final ileal e rectal utilizando uma tesoura cirúrgica. Cortar o cólon com uma tesoura longitudinalmente a partir do ceco ao fim rectal e abrir o cólon. Remover todas as fezes a partir do espécime usando uma pinça seguido de lavagem com PBS 24. </li><li> Prepare rolos suíços rolando acima de todo o cólon com um cotonete longitudinalmente a partir do ceco até o fim rectal com a mucosa curvado para dentro. Incorporar amostras de cólon em temperatura de corte óptima composto (OCT) e manter-se congeladas a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Incorporar tecido do cólon humano da peça cirúrgica, em corte temperatura outubro composto ideal e manter congeladas a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Os cortes histológicos de 7 um de espessura dos espécimes embebidos em OCT-compostos com a ajuda de um cryoto-me apenas antes do exame. NOTA: A espessura da amostra óptima depende da persistência e as propriedades de dispersão do tipo de tecido sob investigação. Para os experimentos descritos utilizando tecido do cólon, espessura de corte&gt; 10 mm causa aumento significativo de ruído devido à dispersão da luz em imagens quantitativos de contraste de fase DHM, enquanto as amostras de espessura &lt;5 mm mostrar um maior risco de danos induzidos artefatos do processo de corte de crio. </li><li> Transferir seções para um slide transportadora objeto de vidro. </li></ol></li></ol> 3. Equipamento Técnico, Software e Procedimentos de Aquisição e Avaliação de hologramas digitais <ol><li> microscópio holográfico digital para celular quantitativa e tecidual <ol><li> Usar um sistema de microscopia de fora do eixo de Mach-Zehnder, holográfico digitais para imagens de células vivas 25, como mostrado na Figura 1. Assegurar que o microscópio é equipado com uma10X lente do microscópio, um estágio de microscópio com um suporte para slides transportador de objectos de vidro e placas de Petri com um diâmetro de 35 mm, com uma câmara de aquecimento para preservar temperatura fisiológica a 37 ° C e software para imagiologia quantitativa de fase 25. NOTA: Por exemplo, tal como descrito em Kemper et al 26 e 27 de Langehanenberg et ai... NOTA: Como alternativa, use um sistema semelhante, que é capaz de realizar microscopia de campo brilhante e imagiologia fase quantitativa de células vivas e lâminas de tecidos dissecados. </li><li> Lente de microscópio limpa e condensador com papel de limpeza de lentes e um agente de limpeza (por exemplo, etanol), como recomendado pelo fabricante do microscópio para remover a poeira ou outras contaminações. </li><li> Inicie o software de aquisição de imagem do microscópio DHM, selecione o modo &quot;brilhante campo&quot; imaging and switch &quot;on&quot; iluminação de luz branca. Certifique-se de Köhler-iluminção da amostra, tal como recomendado pelo fabricante microscópio, enquanto observando a amostra na janela de imagem ao vivo do software de aquisição de imagem (em alternativa, um software de aquisição de imagem padrão pode ser utilizado neste passo). NOTA: A intensidade da imagem devem ser homogeneamente distribuído no campo de visão e a posição da amostra não devem mover-se durante a reorientação óptico com a unidade de focagem do microscópio. </li><li> Selecione o modo &quot;DHM&quot; imaging, vire &quot;off&quot; iluminação de luz branca e interruptor &quot;on&quot; a luz do laser. Verificar que a iluminação com luz laser é homogénea (isto é, que a intensidade da luz é homogeneamente distribuída na janela de imagem ao vivo do software de aquisição de imagens do microscópio DHM) e observa-se que o transportador padrão de interferência franja fora do eixo aparece com contraste adequado na imagens capturadas (hologramas digitais). </li></ol></li><li> Preparação de secções de criostato para imagiologiacom DHM <ol><li> Aqui o (secção criostato num transportador objeto de vidro, espessura: 7 ^ M, tal como descrito em 2.3) da amostra para fora do congelador. Descongelar a amostra para cerca de 5 min a RT e atmosfera normal. </li><li> Adicionar 50 - 100 ul de fosfato salina tamponada (PBS) como meio para incorporação da secção de tecido, utilizando uma pipeta até que esteja completamente coberto com tampão. Cobrir a amostra com uma lamela de vidro limpo (espessura de vidro de 170 mm). NOTA: Over-secagem pode induzir alterações significativas do índice de refracção e propriedades dispersivas da amostra. </li><li> Certifique-se de que a parte inferior do suporte de vidro e a lamela de cobertura são limpos da poeira e outros contaminantes, que podem induzir a dispersão de luz. A amostra está pronta para a investigação com microscopia de campo brilhante e DHM. </li></ol></li><li> imaging fase quantitativa das secções de tecido com DHM <ol><li> Ligue o microscópio holográfico digitais, escolha a lente do microscópio 10X para a imagem latente. Inicie o isoftware de aquisição de mago do microscópio DHM e selecione o modo de imagem de arquivo brilhante. </li><li> Coloque o slide tecido como descrito em 2) no suporte da lâmina de microscópio, com a lâmina de cobertura de frente para a objetiva do microscópio. </li><li> Interruptor &quot;on&quot; a iluminação brilhante campo do microscópio DHM. Posicionar a amostra com o microscópio de fase e assegurar que a área de tecido de interesse é visível na janela de monitorização em directo. Melhorar a nitidez da imagem usando a unidade foco do microscópio. NOTA: Como bem como a área de interesse, uma área de corrediça sem tecido também deve estar presente no campo de visão. </li><li> Capturar uma imagem de campo claro da amostra nitidamente focadas utilizando o software de aquisição de imagem. </li><li> Selecione o modo &quot;DHM&quot; imaging, vire &quot;off&quot; a iluminação de luz branca e vire &quot;on&quot; a iluminação de luz laser. Selecione o &quot;tempo de exposição&quot; para a gravação holograma abaixo de 3 ms, observamos que holographic fora do eixo franjas de interferência aparecem com contraste adequado na janela de imagem ao vivo do programa de aquisição de imagens e capturar um holograma digital. </li><li> Repita os passos 3.3.3 - 3.3.5 até que um número suficiente de imagens de campo brilhante e hologramas digitais de diferentes áreas de amostra foram registrados. aquisição holograma está concluída. </li></ol></li><li> Preparação de ensaios de cicatrização de feridas para imagiologia DHM <ol><li> Ligar a câmara de aquecimento placa de Petri com o microscópio sobre DHM 1-3 h antes do início da experiência para assegurar condições de temperatura estáveis ​​durante as medições DHM. </li><li> Prepare bancada com o equipamento necessário (placa de Petri para o ensaio de cicatrização da ferida é descrito em 2.3): pipetas, pinças, tampa de vidro para uma placa de Petri, 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) tamponada com meio de cultura de células com soro fisiológico temperatura (37 ° C) durante a preparação da amostra em ambiente estéril. NOTA: </strong&gt; de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) é composto por 10% de soro de bezerro fetal (FCS), 20 mM de HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico), e 850 mg / L de NaHCO3. </li><li> Remover a tampa de plástico a partir da placa de Petri e remover o meio de cultura de células com uma pipeta. Remova a inserção da parte inferior placa de Petri, usando uma pinça. </li><li> Lava-se a amostra com 1 - 2 vezes com 1 ml de tampão HEPES meio de cultura celular, a fim de remover as células mortas e as restantes componentes celulares (por exemplo, soro) na área da ferida. Adicione 2 ml de HEPES meio de cultura celular tamponado e tampar a placa de Petri com a tampa de vidro. </li><li> Certifique-se de que a tampa de vidro e parte inferior placa de Petri foram limpos de poeira e outra contaminação. A amostra está pronto para observação de lapso de tempo com DHM. </li></ol></li><li> Monitorização contínua multimodal de cicatrização de feridas in vitro com DHM <ol><li> Ligar a câmara de aquecimento placa de Petri com o microscópio sobre DHM 1-3 h antespara o início da experiência para assegurar condições de temperatura estáveis ​​durante as medições DHM. </li><li> Interruptor &quot;on&quot; o microscópio holográfico digital, seleccione a lente 10X microscópio para a imagem latente. Inicie o software de aquisição de imagem do microscópio DHM e selecione o modo de imagem &quot;brilhante campo&quot;. Assegure-se que a câmara de aquecimento para a placa de Petri está a funcionar a uma temperatura fisiológica (37 ° C). </li><li> Colocar a placa de Petri com o ensaio de cicatrização da ferida, preparado como descrito em 4), na câmara de aquecimento do microscópio DHM. </li><li> Selecione o modo de imagem de campo claro e posicionar a amostra com o estágio do microscópio, observando-lo na janela de monitoramento ao vivo do software de aquisição de imagem do microscópio DHM. Observa-se que a área desejada da amostra aparece focalizada nitidamente sob iluminação de luz branca. </li><li> Capturar imagens brilhantes de campo de diferentes áreas da amostra do (área ferida e áreas circundantes com células confluentes) sob brancoiluminação de luz com o software de aquisição de imagem e o aspecto do documento, a densidade celular e a homogeneidade. </li><li> Selecione o modo de imagem &quot;brilhante campo&quot; do microscópio DHM. Escolha uma área ferida adequado sob iluminação de luz branca na janela de monitoramento ao vivo com o software de aquisição de imagem do microscópio DHM. Verifique se a área da ferida está livre de células mortas e sem restos de soro, e garantir que ambos os lados incluem uma camada de células homogénea única, de preferência com bordas retas. </li><li> Capturar uma imagem de luz branca da área da ferida inicial no modo de imagem de campo claro com o software de aquisição de imagem do microscópio DHM. </li><li> Turn &quot;off&quot; iluminação de luz branca, selecione o modo &quot;DHM&quot; e interruptor &quot;on&quot; iluminação laser. Escolha um tempo de exposição de abaixo de 3 ms para gravar holograma (observar que fora do eixo holográfica franjas de interferência aparecem com contraste adequado na janela de imagem ao vivo do software de aquisição de imagens de tele DHM microscópio) e capturar um holograma digital. </li><li> Capturar um holograma exemplo em modo DHM com o software de aquisição de imagem e reconstruir uma imagem quantitativa fase com o software de reconstrução do microscópio DHM, a fim de verificar a qualidade da imagem. </li><li> Seleccionar um intervalo de tempo adequado (por exemplo, 3-5 minutos) para aquisição holograma lapso de tempo com o software de aquisição de imagem do microscópio DHM. </li><li> Selecione o modo de aquisição de lapso de tempo do software de aquisição de imagem em que a amostra só é iluminado com luz laser durante a aquisição de holograma. </li><li> Comece a observação DHM lapso de tempo do ensaio a cicatrização de feridas. </li><li> Parar a aquisição de lapso de tempo após o tempo pretendido, seleccionar o modo de imagem de campo claro e documentar a aparência final da amostra em imagens de luz branca. </li></ol></li><li> Reconstruir hologramas digitais de tecidos dissecados e determinar o índice de refracção médio como um parâmetro para a quantificaçãodensidade do tecido <ol><li> Reconstruir imagens fase quantitativa dos hologramas digitais de tecidos dissecados com o software do microscópio DHM, por exemplo, como descrito em Kemper et al. 26 e Langehanenberg et ai. 27. </li><li> Determinar o contraste média fase Δφ em diferentes camadas de tecidos (epitélio, submucosa, estroma) em regiões adequadamente escolhidos de interesse (ROI) 19. </li><li> Determinação do índice de refracção do meio de fixação por meio de um refractómetro ou, em alternativa, utilizando um valor adequado a partir da literatura. (valores de índice de refracção para a incorporação típica meios: água = 1,334 N 28, N tampão fosfato salino (PBS) 1,337 = 29, n = meio de cultura celular 1,337-1,339 29,30). </li><li> Calcular os índices de refração de diferentes camadas de tecido a partir do contraste de fase média de valores 19 <img alt="equação 1"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54460 / 54460eq1.jpg&quot; /&gt; (1) NOTA: Na Eq. 1 λ é o comprimento de onda da luz do laser (aqui: λ = 532 nm), d a espessura dos tecidos dissecados (aqui: 7 pm) e n forma é o índice de refracção do meio de fixação (aqui: N PBS médio = N = 1.337, determinado por um Abbe-Refractometer). </li></ol></li><li> Reconstruir e avaliar hologramas digitais do lapso de tempo de cicatrização de feridas observação série <ol><li> Reconstruir imagens fase quantitativa da série lapso holograma tempo obtido durante a observação cicatrização de feridas com o software microscópio DHM 26,27. </li><li> Normalizar cada série de imagens fase quantitativa da imagem com contraste de fase máxima. </li><li> Determinar a área S c que é coberta pelas células nas imagens quantitativos fase DHM por segmentação da imagem, que pode ser porformada utilizando o profiler celular software livre (www.cellprofiler.org 31). </li><li> Calcula-se a média de contraste de fase de células a célula Δφ na área S C. </li><li> Recuperar o DM massa seca celular da célula Δφ contraste de fase média na área S c 15 <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq2.jpg" /> (2) NOTA: Na Equação 2 DM indica a massa seca celular, S c apresenta a área que está ocupada pelas células e α = 0,002 m 2 / kg. </li><li> Determinar o integral de refracção celular índice n celular e o índice de refracção do meio de cultura de células médio n. Determinar celular n separadamente experimentalmente a partir de células em suspensão, como descrito no 30 e medir meio de n com um refratômetro. Alternavamente usar os valores da literatura para a célula n 30 e n média 29,30. </li><li> Calcula-se a média de espessura d de células a partir de células λ, Δφ célula, célula N e n forma 26,32 <img alt="equação 3" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq3.jpg" /> (3) NOTA: Na Eq. 3 a célula parâmetro d é a espessura média das células, λ denota o comprimento de onda de luz da luz laser, de células Δφ indica o contraste de fase média, e n celular e n forma são o índice de refracção celular integral e o índice de refracção do meio circundante. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nós demonstramos que DHM fornece uma avaliação precisa dos danos histológico em modelos de colite murina e amostras de tecido do cólon humanos ex vivo. Além disso, temos mostrado DHM pode monitorar continuamente a cicatrização de feridas epiteliais e proporcionar simultaneamente informação multimodal sobre alterações celulares. Em DHM, a reconstrução de hologramas captadas digitalmente é realizada numericamente 32. Portanto, em comparação com a microscopia de campo claro, contraste de fase Zernike e ...

Doença inflamatória do intestino (IBD), isto é, a colite ulcerosa (UC) e doença de Crohn (CD) são desordens inflamatórias idiopáticas do tracto gastrointestinal 1. A investigação sobre a fisiopatologia subjacente de IBD ea avaliação de potenciais novos medicamentos ou novas abordagens de diagnóstico é particularmente importante. Tanto na pesquisa básica e o manejo clínico de pacientes com DII, a mucosa intestinal tornou-se um foco de atenção 2,3. A mucosa representa um contorno anatómico, em que a interacção entre as bactérias comensais, células epiteliais e os vários componentes celulares do sistema imune do intestino intestino orquestrar homeostase 4,5. No entanto, em pacientes com DII, inflamação intestinal descontrolada e persistente conduz a danos da mucosa, detectável como ulcerações ou estenose, o que pode finalmente culminam na degradação da função de barreira epitelial, que se agrava a inflamação local 6. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; epitelial cicatrização de feridas é, portanto, crucial para a regeneração epitelial seguinte inflamação, mas também é um requisito fundamental para a cura de úlceras gastrointestinais ou deiscência de anastomose após a cirurgia gastrointestinal 7. Epitelial a cicatrização de feridas pode ser simulada in vitro Os ensaios de cura de feridas e em modelos de murídeo de inflamação intestinal 8,9. Tanto in vitro como in vivo abordagens apresentam desvantagens, o que limita a precisão da avaliação experimental. Os ensaios in vitro, como ensaios clássicos de raspar, requerem procedimentos de coloração prolongadas ou transfecção com cromóforos fluorescentes. Eles são, muitas vezes limitada pela sua monitorização descontínua da proliferação e migração celular, que não pode ser automatizado 10. Modelos in vivo, tais como o sulfato de dextrano de sio (DSS) de colite induzida, carecem frequentemente robustos read-outs, em parte devido à variação significativa observada em marcadores laboratoriais, marei tais marcadores inadequados para avaliar a gravidade da colite 11,12. A análise histológica da mucosa inflamada ainda está a abordagem mais válida para determinar a gravidade da colite, mas isso, como ensaios in vitro de cicatrização de feridas epiteliais, requer coloração e depende de perícia do investigador 13. Microscopia holográfica recentemente digitais (DHM), uma variante de microscopia de fase quantitativa 14, foi identificada como uma ferramenta útil para a avaliação da cicatrização do epitélio da ferida in vitro e in vivo 15. DHM permite a avaliação da densidade do tecido através da medição de atraso comprimento do trajecto óptico (OPD) , cujo diagnóstico perspectivas romance câncer de 16-18 e quantificação de inflamação relacionada alterações teciduais 19. Além disso, DHM permite o monitoramento da dinâmica da morfologia celular por determinar a espessura das células, células coberta área de superfície e intracelular (proteína) a quantidade de conteúdo <sup&gt; 15,20. Em ensaios in vitro, DHM também permite a análise de processos fisiológicos, por exemplo, permeabilidade à água celular por avaliar alterações no volume celular e espessura 21,22. Além disso, as medições DHM pode ser automatizado que evita viés de amostra associada ao investigador. Aqui, demonstramos a utilização de DHM em um modelo murino de inflamação intestinal, e também se aplicam DHM para análise de amostras de tecidos humanos para monitorização quantitativa de cicatrização de feridas como um ensaio in vitro isento de etiqueta. Em primeiro lugar, avaliar as alterações inflamatórias de diferentes parede camadas do cólon em camundongos colï¿½icos e cortes de tecidos de seres humanos com IBD. Depois de descrever o procedimento de imagiologia quantitativa fase DHM, que fornecem instruções detalhadas para a utilização dos componentes de microscópio, a preparação de secções de tecido e também descrevem a avaliação das imagens de fase quantitativa adquiridos. Em seguida, mostramos que DHM pode ser utilizado para a monitoração contínua de multimodal epitelial cicatrização de feridas in vitro, e descrever a análise das características celulares como a espessura da camada de células, massa seca e volume celular dar dicas sobre as alterações induzidas por drogas e celulares fisiológico.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoximetano (AOM)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemanha</td><td>Frasco de cultura celular A5486</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette</td><td>Corning Inc., Nova York, EUA</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano de sódio (DSS)</td><td>TdB Consulta, Uppsala, Suécia</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>PAA Laboratories - Pasching - Áustria</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemanha</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemanha</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano (2-metilbutano)</td> <td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemanha</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemanha</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>G. Menzel, Braunschweig, Alemanha</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Composto O.C.T. Tissue Tek&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Holanda</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep/Anfotericina B</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Alemanha</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Dieta padrão</td><td>Altromin, Lage, Alemanha</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Holanda</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash; Clud</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Alemanha</td><td>04-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &micro;-Prato 35 mm com inserto de cultura, high</td><td>ibidi GmbH, Munique, Alemanha</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>DIC Tampa para &micro;-pratos, com inserto de vidro</td><td>ibidi GmbH, Munique, Alemanha</td><td>80050</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, EUA</td><td>46320</td><td></td></tr><tr><td><forte>Microscópio holográfico digital</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Componente</forte></td><td><forte>Modelo</forte></td><td><forte>Empresa</forte></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>iMIC</td><td>Till Photonics, Graefelfing, Alemanha</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bússola a laser 315M</td><td>Coherent GmbH, Luebeck, Alemanha</td><td></td></tr><tr><td>Lente de microscópio</td><td>Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>Zeiss, Goettingen, Alemanha</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>DMK 41BF02</td><td>The Imaging Source, Bremen, Alemanha</td><td></td></tr></tbody></table>

multimodal quantitative fase de imagem com o digital holographic microscopia com precisão avalia cura inflamação intestinal e epitelial de feridas

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

A incidência de doença inflamatória intestinal, ou seja, doença de Crohn e colite ulcerosa, aumentou significativamente ao longo da última década. A etiologia de IBD permanece desconhecida e estratégias terapêuticos actuais baseiam-se na supressão não específica do sistema imunitário. O desenvolvimento de tratamentos que visam especificamente a inflamação intestinal e a cicatrização de feridas epiteliais poderia melhorar significativamente a gestão da DII, no entanto, isto exige uma detecção precisa das alterações inflamatórias. Actualmente, os potenciais candidatos a fármacos são geralmente avaliada utilizando modelos animais in vivo ou com técnicas baseadas cultura de células in vitro. O exame histológico geralmente requer as células ou tecidos de interesse a serem manchadas, que podem alterar as características da amostra e, além disso, a interpretação dos resultados podem variar de acordo com especialização investigador. microscopia holográfica digital (DHM), com base na detecção de atraso comprimento do percurso óptico, permitemancha-livre imagem de contraste de fase quantitativa. Isso permite que os resultados sejam directamente correlacionada com parâmetros biofísicos absolutos. Demonstramos como a medição das mudanças na densidade do tecido com DHM, com base na medição do índice de refração, pode quantificar alterações inflamatórias, sem coloração, em diferentes camadas de amostras de tecido do cólon de ratos e seres humanos com colite. Além disso, demonstramos monitoramento livre-label multimodal contínuo de cicatrização de feridas epiteliais in vitro, possível usando DHM através da determinação automatizado simples da área ferida e determinação simultânea de parâmetros morfológicos, tais como a massa seca e espessura da camada de células que migram. Em conclusão, DHM representa um valioso, novos e ferramenta quantitativa para a avaliação da inflamação intestinal com valores absolutos de parâmetros possíveis, quantificação simplificado de cicatrização de feridas epiteliais, in vitro e, por conseguinte, tem um elevado potencial para o retorno de diagnóstico translacionalSE.

Configuração típica para DHM Imaging for Digital Holographic Microscopy (DHM) Para realizar imagem de campo brilhante e as imagens de contraste de fase quantitativa DHM, aplicou-se um microscópio invertido, como representado na Figura 1 B. O sistema foi modificado por fixação de um módulo de DHM, conforme descrito anteriormente 25. Hologramas digita...

A avaliação precisa dos efeitos anti-inflamatórios é de extrema importância para a avaliação de novos medicamentos potenciais para o tratamento da doença inflamatória intestinal. A microscopia holográfica digital fornece avaliação da inflamação em amostras de tecido colônico murino e humano, bem como avaliação multimodal automatizada da cicatrização de feridas epiteliais in vitro.

Multimodal Quantitative Fase de imagem com o Digital Holographic Microscopia com precisão Avalia Cura inflamação intestinal e epitelial de Feridas

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

O objetivo geral deste estudo é usar microscopia holográfica digital ou DHM para fornecer imagens de contraste de fase quantitativas automatizadas e sem manchas de amostras de tecido colônico de inflamação intestinal para a avaliação multimodal da cicatrização de feridas epiteliais in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da inflamação gastrointestinal e cicatrização de feridas sobre a atividade da doença inflamada humana e marinha A principal vantagem desta técnica é que ela permite a detecção e quantificação de células e tecidos por parâmetros físicos de forma objetiva e sem manchas. Demonstrando os procedimentos estará Fittest Ketelhut, um técnico, do Centro de Tecnologia Biomédica.Configure a cultura de células, incube quatro vezes dez elevado ao quinto, Caco duas células por centímetro quadrado em placas de Petri de 35 milímetros equipadas com inserções de alta cultura em meio RPMI suplementado com FBS e antibióticos a 37 graus Celsius em 95% de umidade e cinco por cento de dióxido de carbono. Após dois dias, trate as células com o agente de interesse e devolva as culturas à incubadora por mais 24 horas. No dia seguinte, aspire o sobrenadante e use uma pinça para remover as inserções.Lave a cultura uma a duas vezes com um mililitro de meio de cultura de células tamponadas HEPES para remover quaisquer células mortas e quaisquer componentes celulares remanescentes da área da ferida. Em seguida, adicione dois mililitros de HEPES fresco tamponado e feche o prato. Agora coloque a placa de Petri no microscópio holográfico digital e selecione a objetiva de 10 x.Abra o software de aquisição de imagem e selecione o modo de imagem de campo claro. Defina a câmara de aquecimento para 37 graus Celsius e coloque a cultura na câmara de aquecimento. Em seguida, mova o campo de visualização até que uma ferida adequada com uma única camada de células enormes e bordas retas em ambos os lados sem células mortas ou soro possa ser visualizada na janela de monitoramento ao vivo.Capture uma imagem de luz branca da área inicial da ferida. Em seguida, desligue a iluminação de luz branca e selecione o modo de microscopia holográfica digital. Ligue a iluminação do laser e selecione um tempo de exposição inferior a três milissegundos para a gravação do holograma.Se as franjas de interferência holográficas fora do acesso aparecerem com um contraste adequado, capture um holograma de amostra e reconstrua uma imagem de fase quantitativa com o software de reconstrução para verificar a qualidade da imagem. Em seguida, inicie uma observação DHM com lapso de tempo da ferida, interrompendo a gravação no ponto final apropriado e obtenha uma imagem final da amostra sob iluminação de luz branca. Para indução aguda de sulfato de sódio dextrano, ou indução de colite DSS, forneça três gramas de DSS dissolvidos em 100 mililitros de água autoclavada para camundongos ablibidim.Após sete dias, obter sete micrômetros de espessura de amostras de cólon enrolado suíço dos animais controle e tratados. Mergulhe cada seção em 50 a 100 micro litros de PBS e cubra as amostras com lamínulas de vidro individuais. Confirme se o fundo das lâminas está livre de poeira e outras contaminações.Em seguida, coloque a primeira lâmina no microscópio stage e ajuste o campo de view até que a área de interesse do tecido esteja visível. Traga a amostra para um foco nítido e capture uma imagem de campo claro no software de aquisição de imagem. Em seguida, selecione o modo de imagem DHM e mude para a iluminação da luz laser.Defina um tempo de exposição inferior a três milissegundos e confirme se as franjas holográficas de interferência de acesso desligado aparecem com um contraste adequado na janela de imagem ao vivo. Em seguida, capture um holograma digital do tecido. Endoscopicamente, a evidência de colite moderada a grave inclui espessamento da parede colônica, alterações do padrão vascular, alterações das fibras e granularidade da superfície da mucosa.A avaliação histológica convencional dos cortes colônicos revela um edema acentuado na parede colônica dos animais tratados com SDS versus os animais controle predominantemente localizados na submucosa. As imagens quantitativas correspondentes de contraste de fase DHM e os mapas de índice de refração relacionados também demonstram que essas alterações teciduais sem diferenças visíveis nas densidades do menstroma epitelial são especialmente aparentes nas amostras de tecido nativo não corado. O índice de refração é significativamente reduzido no epitélio, submucosa e estroma dos camundongos colíticos em comparação com os controles saudáveis, com uma correlação significativa entre a perda relativa de peso corporal e o índice de refração nos animais experimentais.Aqui é mostrado o monitoramento contínuo representativo de um ensaio de cicatrização de feridas por microscopia holográfica digital durante 45 horas. Permitindo os cálculos da área de superfície coberta pela célula, espessura celular média e massa seca celular ao longo do processo de cicatrização. Mostramos que o DHM permite o monitoramento contínuo da cicatrização de feridas epiteliais e, ao mesmo tempo, fornece informações bioessenciais sobre as alterações celulares induzidas por citocinas.Além disso, demonstramos a avaliação precisa do dano histológico em modelos de colite e amostras de tecido colônico humano por DHM por meio da medição de alterações no índice de refração. Como o DHM é baseado na detecção do atraso dos comprimentos do caminho óptico, os parâmetros biofísicos absolutos, como densidade do tecido, massa seca ou espessura celular, podem ser analisados por imagens quantitativas de contraste de fase sem manchas. O ponto culminante do DHM com microscópios de pesquisa comuns e a robustez da técnica abrem caminho para aplicações rotineiras desse método em biologia celular e patologia digital.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como usar a microscopia holográfica digital para a análise de tecidos de culturas de células vivas no ambiente de laboratório biomédico. Em conclusão, o DHM cria uma ferramenta valiosa, nova e quantitativa para avaliação dos parâmetros absolutos da inflamação, bem como para a quantificação simplificada de epitélio voluntário in vitro com alto potencial para uso em diagnóstico translacional.

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Medicine

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As localizações tridimensionais dos objectos fracamente espalhamento pode ser identificada exclusivamente com linha digital de microscopia holográfica (Dihm), que envolve uma modificação menor para um microscópio padrão. Nosso software utiliza uma heurística de imagens simples juntamente com Rayleigh-Sommerfeld back-propagação para ceder a posição tridimensional e geometria de um objeto fase microscópica.

Digital em linha Holographic Microscopy (Dihm) de Assuntos Fracamente de dispersão

Descrevemos o uso de um microscópio óptico padrão para realizar medições quantitativas de massa, volume e densidade celular por meio de uma combinação de imagens de contraste de campo claro e interferência diferencial.

Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão

Pequenas técnicas de imagem animais permitem exames de diagnóstico de série e intervenções terapêuticas in vivo. Recentemente, o leque de aplicações tem aumentado significativamente e atualmente inclui avaliação do desenvolvimento de tumor do cólon, cicatrização de feridas e monitoramento da inflamação. Este protocolo ilustra essas aplicações potenciais diferentes de endoscopia murino.

Murino Endoscopia para In Vivo Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

Sondas de destino-específicos representam uma ferramenta inovadora para a análise de mecanismos moleculares, tais como a expressão da proteína em vários tipos de doença (por exemplo, inflamação, infecção e tumorigênese). Neste estudo, descrevemos uma avaliação tomográfica tridimensional quantitativa da infiltração de macrófagos intestinal em um modelo murino de colite usando tomografia computadorizada mediada por fluorescência de F4/80-específicos.

Tomografia computadorizada mediada por fluorescência para a detecção e quantificação de inflamação Intestinal murino macrófago-relacionados

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.

Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

A pontuação sistemática da inflamação intestinal usando um sistema gratuito assistido por computador é uma ferramenta poderosa para comparar quantitativamente alterações histopatológicas em modelos de colite caracterizados pela presença de úlceras e alterações inflamatórias. A avaliação do escore da colite histológica fortalece as observações clínicas e facilita a interpretação dos dados.

Análise sistemática de pontuação para inflamação intestinal em um modelo de colite induzida por sulfato de sódio murine dextran

Apresentamos aqui um método para obter imagens do intestino após ferimento induzido por laser. Ao expor o intestino do camundongo a um laser multifóton, a perda de uma única ou múltiplas criptas é induzida localmente. Ao obter imagens repetidas da área danificada ao longo de meses, a dinâmica em tempo real da recuperação intestinal é capturada.

Ablação a Laser e Microscopia Intravital no Estudo do Remodelamento Intestinal

Apresentamos um protocolo passo a passo para imagens tridimensionais de alta resolução, sem rótulos e tridimensionais usando holotomografia de baixa coerência. Este protocolo detalha a preparação da cultura de organoides, aquisição de imagens e análise computacional de imagens, permitindo a visualização em tempo real da dinâmica estrutural e respostas a medicamentos em organoides vivos.

Imagens 3D de alta resolução e sem rótulos e análise de aprendizado de máquina de organoides intestinais por meio de holotomografia de baixa coerência

Este estudo apresenta um método de imagem 3D usando tecidos intestinais de montagem total e microscopia multifóton para quantificar o muco secretado, permitindo uma análise volumétrica precisa e visualização da dinâmica do muco em resposta a estímulos como o cloreto de carbamoilcolina.

Quantificação tridimensional do muco intestinal usando imagens de tecido de montagem total

Aprenda a usar microscopia holográfica digital para avaliar inflamação intestinal e cicatrização epitelial sem coloração. Este método quantitativo oferece dados objetivos para pesquisa em gastroenterologia.

Multimodal Quantitative Fase de imagem com o Digital Holographic Microscopia com precisão Avalia Cura inflamação intestinal e epitelial de Feridas (Vídeo) | JoVE Journal

Multimodal Quantitative Fase de imagem com o Digital Holographic Microscopia com precisão Avalia Cura inflamação intestinal e epitelial de Feridas

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