Multimodal Quantitative Fase de imagem com o Digital Holographic Microscopia com precisão Avalia Cura inflamação intestinal e epitelial de Feridas

A avaliação precisa dos efeitos anti-inflamatórios é de extrema importância para a avaliação de novos medicamentos potenciais para o tratamento da doença inflamatória intestinal. A microscopia holográfica digital fornece avaliação da inflamação em amostras de tecido colônico murino e humano, bem como avaliação multimodal automatizada da cicatrização de feridas epiteliais in vitro.

O objetivo geral deste estudo é usar microscopia holográfica digital ou DHM para fornecer imagens de contraste de fase quantitativas automatizadas e sem manchas de amostras de tecido colônico de inflamação intestinal para a avaliação multimodal da cicatrização de feridas epiteliais in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da inflamação gastrointestinal e cicatrização de feridas sobre a atividade da doença inflamada humana e marinha A principal vantagem desta técnica é que ela permite a detecção e quantificação de células e tecidos por parâmetros físicos de forma objetiva e sem manchas. Demonstrando os procedimentos estará Fittest Ketelhut, um técnico, do Centro de Tecnologia Biomédica.

Configure a cultura de células, incube quatro vezes dez elevado ao quinto, Caco duas células por centímetro quadrado em placas de Petri de 35 milímetros equipadas com inserções de alta cultura em meio RPMI suplementado com FBS e antibióticos a 37 graus Celsius em 95% de umidade e cinco por cento de dióxido de carbono. Após dois dias, trate as células com o agente de interesse e devolva as culturas à incubadora por mais 24 horas. No dia seguinte, aspire o sobrenadante e use uma pinça para remover as inserções.

Lave a cultura uma a duas vezes com um mililitro de meio de cultura de células tamponadas HEPES para remover quaisquer células mortas e quaisquer componentes celulares remanescentes da área da ferida. Em seguida, adicione dois mililitros de HEPES fresco tamponado e feche o prato. Agora coloque a placa de Petri no microscópio holográfico digital e selecione a objetiva de 10 x.

Abra o software de aquisição de imagem e selecione o modo de imagem de campo claro. Defina a câmara de aquecimento para 37 graus Celsius e coloque a cultura na câmara de aquecimento. Em seguida, mova o campo de visualização até que uma ferida adequada com uma única camada de células enormes e bordas retas em ambos os lados sem células mortas ou soro possa ser visualizada na janela de monitoramento ao vivo.

Capture uma imagem de luz branca da área inicial da ferida. Em seguida, desligue a iluminação de luz branca e selecione o modo de microscopia holográfica digital. Ligue a iluminação do laser e selecione um tempo de exposição inferior a três milissegundos para a gravação do holograma.

Se as franjas de interferência holográficas fora do acesso aparecerem com um contraste adequado, capture um holograma de amostra e reconstrua uma imagem de fase quantitativa com o software de reconstrução para verificar a qualidade da imagem. Em seguida, inicie uma observação DHM com lapso de tempo da ferida, interrompendo a gravação no ponto final apropriado e obtenha uma imagem final da amostra sob iluminação de luz branca. Para indução aguda de sulfato de sódio dextrano, ou indução de colite DSS, forneça três gramas de DSS dissolvidos em 100 mililitros de água autoclavada para camundongos ablibidim.

Após sete dias, obter sete micrômetros de espessura de amostras de cólon enrolado suíço dos animais controle e tratados. Mergulhe cada seção em 50 a 100 micro litros de PBS e cubra as amostras com lamínulas de vidro individuais. Confirme se o fundo das lâminas está livre de poeira e outras contaminações.

Em seguida, coloque a primeira lâmina no microscópio stage e ajuste o campo de view até que a área de interesse do tecido esteja visível. Traga a amostra para um foco nítido e capture uma imagem de campo claro no software de aquisição de imagem. Em seguida, selecione o modo de imagem DHM e mude para a iluminação da luz laser.

Defina um tempo de exposição inferior a três milissegundos e confirme se as franjas holográficas de interferência de acesso desligado aparecem com um contraste adequado na janela de imagem ao vivo. Em seguida, capture um holograma digital do tecido. Endoscopicamente, a evidência de colite moderada a grave inclui espessamento da parede colônica, alterações do padrão vascular, alterações das fibras e granularidade da superfície da mucosa.

A avaliação histológica convencional dos cortes colônicos revela um edema acentuado na parede colônica dos animais tratados com SDS versus os animais controle predominantemente localizados na submucosa. As imagens quantitativas correspondentes de contraste de fase DHM e os mapas de índice de refração relacionados também demonstram que essas alterações teciduais sem diferenças visíveis nas densidades do menstroma epitelial são especialmente aparentes nas amostras de tecido nativo não corado. O índice de refração é significativamente reduzido no epitélio, submucosa e estroma dos camundongos colíticos em comparação com os controles saudáveis, com uma correlação significativa entre a perda relativa de peso corporal e o índice de refração nos animais experimentais.

Aqui é mostrado o monitoramento contínuo representativo de um ensaio de cicatrização de feridas por microscopia holográfica digital durante 45 horas. Permitindo os cálculos da área de superfície coberta pela célula, espessura celular média e massa seca celular ao longo do processo de cicatrização. Mostramos que o DHM permite o monitoramento contínuo da cicatrização de feridas epiteliais e, ao mesmo tempo, fornece informações bioessenciais sobre as alterações celulares induzidas por citocinas.

Além disso, demonstramos a avaliação precisa do dano histológico em modelos de colite e amostras de tecido colônico humano por DHM por meio da medição de alterações no índice de refração. Como o DHM é baseado na detecção do atraso dos comprimentos do caminho óptico, os parâmetros biofísicos absolutos, como densidade do tecido, massa seca ou espessura celular, podem ser analisados por imagens quantitativas de contraste de fase sem manchas. O ponto culminante do DHM com microscópios de pesquisa comuns e a robustez da técnica abrem caminho para aplicações rotineiras desse método em biologia celular e patologia digital.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como usar a microscopia holográfica digital para a análise de tecidos de culturas de células vivas no ambiente de laboratório biomédico. Em conclusão, o DHM cria uma ferramenta valiosa, nova e quantitativa para avaliação dos parâmetros absolutos da inflamação, bem como para a quantificação simplificada de epitélio voluntário in vitro com alto potencial para uso em diagnóstico translacional.