Preparação da amostra e a imagem latente de Exosomes por microscopia eletrônica de transmissão

Este protocolo descreve as várias técnicas necessárias para microscopia eletrônica de transmissão incluindo coloração negativa, seccionamento ultrafinos de estrutura detalhada e imuno-ouro rotulagem para determinar as posições de proteínas específicas em exosomes.

O objetivo geral deste procedimento é observar a morfologia das vesículas extracelulares purificadas e realizar a localização de proteínas específicas dentro das vesículas extracelulares usando microscopia eletrônica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no período de pesquisa de vesículas extracelulares, como a categorização do exossomo e proteínas específicas localizadas dentro dele. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para observar a porção de proteínas específicas localizadas dentro e fora do exossomo.

A implicação dessa técnica é garantir o diagnóstico de várias doenças, incluindo câncer e infecções bacterianas. Embora esse método possa fornecer informações sobre o exossomo, ele também pode ser aplicado a outras amostras biológicas, incubação microcelular e localização de proteínas específicas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à criação de contaminação durante a ligação não específica da partícula de imunoouro.

Usando técnicas padrão, prepare exossomos em cultura. Em seguida, ultracentrifugar o sobrenadante de cultura de células HCT116 para granular os exossomos do meio. Depois de peletizado, remova cuidadosamente o sobrenadante da cultura.

Para fixar o pellet de exossomo purificado, adicione um mililitro de glutaraldeído a 2,5% em uma solução de cacodilato de soldium molar 0,1 a PH 7,0. Incube as vesículas lipídicas por camada por uma hora a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o fixador e enxágue os pellets com um mililitro de uma solução tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar em temperatura ambiente por 10 minutos.

Em seguida, fixe as amostras com um mililitro de tetróxido de ósmio a 2% por uma hora a quatro graus Celsius. Remova o fixador e enxágue o pellet de exossomo três vezes com o tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar, trocando o tampão a cada dez minutos. Em seguida, desidrate a amostra agitando-a por 10 minutos cada em uma série de concentrações graduadas de acetona.

Em seguida, misture uma solução de três partes de acetona e uma parte de mistura de incorporação de baixa viscosidade. Substitua a acetona por esta mistura e incube a amostra por 30 minutos. Continue a aumentar a proporção do meio de inclusão de baixa viscosidade, incubando por 30 minutos a cada etapa.

Finalmente, incube o pellet de exossomo em 100% da mistura de incorporação de baixa viscosidade durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, incorpore a amostra em mistura de incorporação pura de baixa viscosidade usando um molde de incorporação e asse por 24 horas a 65 graus Celsius. Usando um ultramicrótomo, prepare seções com espessura de 60 nanômetros.

Coloque as seções em uma grade de níquel e core duas vezes algumas delas com acetato de uranila a 2% por 20 minutos, seguido de citrato de chumbo por 10 minutos. Em seguida, coloque a seção corada em um microscópio eletrônico de transmissão e visualize a amostra usando 80 quilovolts e siga as configurações automáticas para o tempo de exposição. Com uma imagem de exossomo em vista, adquira e salve a imagem usando o software do microscópio.

Para começar, incube grades contendo seções não coradas de 60 nanômetros de espessura em gotas de 50 microlitros de glicina molar de 0,02 por 10 minutos para extinguir os grupos aldeídos livres. Em seguida, enxágue as seções em 100 microlitros de água destilada três vezes por 10 minutos cada. Após o último enxágue, incube as seções por uma hora em temperatura ambiente em PBS contendo 1% de BSA.

Em seguida, incube as grades em gotas de 50 a 100 microlitros de um anticorpo anti-KRS por uma hora. Em seguida, lave as grades cinco vezes por 10 minutos cada em uma gota de PBS contendo 0,1% BSA. Em seguida, transfira as grades para uma gota de um anticorpo secundário apropriado e incube as seções por uma hora em temperatura ambiente.

Agora, lave as grades cinco vezes por 10 minutos, cada uma com uma gota separada de PBS contendo 0,1% BSA. Coloração dupla das seções com acetato de uranila a 2% por 20 minutos no escuro, seguido de citrato de chumbo de Reynolds por 10 minutos. Coloque a seção corada em um microscópio eletrônico de transmissão e visualize a amostra usando 80 quilovolts e visualize-a como mostrado anteriormente.

Para realizar a coloração negativa, fixe os exossomos purificados após o isolamento com um mililitro de paraformaldeído a 2% por cinco minutos. Trate grades EM de cobre finas, revestidas com formvar/filme de carbono, de 200 mesh, com descarga luminescente por um minuto, depois carregue de cinco a sete microlitros da solução de suspensão de exossomo em uma grade e incube-a por um minuto. Se a concentração de exossomo for muito alta, dilua a concentração para um nível apropriado.

Imediatamente corar os exossomos com cerca de 20 gotas de uma solução filtrada de acetato de uranila a 1% na superfície da grade EM. Remova o excesso de solução de acetato de uranila da grade entrando em contato com a borda da grade com papel de filtro e, em seguida, enxágue rapidamente a grade com uma gota de água. Use uma pinça para colocar a grade sobre a mesa e cubra a grade parcialmente com um prato de cultura.

Deixe a grade secar por 10 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, fotografe a grade ou armazene-a em uma caixa de grade de microscópio eletrônico para observação futura. Comece tratando as grades EM de cobre de 200 mesh revestidas com formvar/filme de carbono fino com descarga luminescente por 30 segundos. Em seguida, carregue de cinco a sete microlitros dos exossomos fixados em solução de paraformaldeído a 2% na grade e incube-os por cinco minutos.

Em seguida, enxágue os exossomos com 100 microlitros de PBS, três vezes cada por 10 minutos. Trate as grades contendo exossomo com 50 microlitros de uma solução de glicina 0,5 molar por 10 minutos para extinguir os grupos aldeídos livres. Em seguida, transfira as grades para uma gota de PBS contendo 1% BSA e bloqueie por 30 minutos.

Agora incube as grades com 50 a 100 microlitros de anticorpo anti-PD-L1 por uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Lave a grade com cinco gotas separadas de PBS contendo 0,1% BSA por 10 minutos cada, depois transfira a grade para uma gota do anticorpo secundário por uma hora. Em seguida, lave a grade com cinco gotas separadas de PBS contendo 0,1% BSA por 10 minutos cada, depois lave a grade com duas gotas separadas de água destilada.

Quando terminar, faça a coloração negativa com acetato de uranila a 2%, conforme mostrado anteriormente, e fotografe as amostras ou armazene-as em uma caixa de grade EM para observação futura. A morfologia do exossomo observada aqui é o produto da coloração negativa. Esses exossomos apresentam uma morfologia típica em forma de xícara, que é um artefato que pode ocorrer durante o processo de secagem.

Informações adicionais podem ser obtidas usando a coloração de imunoouro de montagem inteira, como a localização de proteínas específicas no exossomo. Aqui, as setas brancas indicam a localização do PD-L1. Nas imagens seccionadas, as vesículas mostraram uma estrutura de lúmen que é conhecida como uma característica estrutural dos exossomos.

Estes também podem ser corados com imunoouro para identificar proteínas específicas em todos os exossomos. Uma vez dominada, a técnica de coloração de imunoouro pode ser feita em células fibrosas após uma simples preparação e seccionamento, se for realizada corretamente. Após este procedimento, outro método, como dupla coloração imunológica, pode ser realizado para identificar simultaneamente a localização de duas proteínas diferentes.

Após cada desenvolvimento, essa técnica pode ser usada no campo de vesículas extracelulares para explorar diagnósticos de doenças em biópsias. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar a localização específica de proteínas dentro do exossomo. Não se esqueça de que eles estão trabalhando com soluções fixadoras, como cloridrato, paraformaldeído e tetróxido de ósmio, podem ser extremamente perigosos e precauções como capela ventilada e luvas de látex devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.