Multiplexado imunofluorescência análise e quantificação de Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T células
8 de fevereiro de 2018
Estudar o microambiente do tumor pode identificar biomarcadores prognósticos ou preditivos de resposta clínica à imunoterapia. Apresentado aqui, é um método inovador baseado em situ fluorescência multiespectral de imagens para analisar e contar automaticamente várias subpopulações de CD8+ T células. Esta técnica reprodutível e confiável é apropriada para análises de grandes coorte.
O objetivo geral desta análise de imunofluorescência multiplexada é contar automaticamente as células com base em seu fenótipo. Este método permite a multifluorescência e a contagem automática de células para analisar o fenótipo e a função das células imunes tumorais dentro de um microambiente tumoral. Essa tecnologia facilitou a geração de dois tipos de prognóstico composto para previsto por seus marcadores derivados diretamente do microambiente tumoral.
Geralmente, os indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque o procedimento de fenotipagem é muito longo e os dados brutos resultantes requerem processamento adicional. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando tentamos caracterizar o fenótipo e as interações imunológicas das células annhodge miranty. Após o descongelamento, use uma toalha de papel para secar cuidadosamente as lâminas ao redor das seções de tecido e, em seguida, circule os tecidos com uma caneta barreira hidrofóbica.
Quando a barreira secar, fixe as amostras em acetona a 100% por cinco minutos, seguido de dois minutos de secagem ao ar e, em seguida, lave as lâminas em TBS por 10 minutos. Pré-trate as lâminas com 3 gotas de 0,1% Avidin por 10 minutos no escuro e, em seguida, toque ou mova as lâminas para cobrir o tecido com a solução de Avidin. Adicione 3 gotas de 01% de biotina a cada amostra e, em seguida, toque ou mova a biotina nas amostras, seguida de uma lavagem TBS conforme demonstrado.
Em seguida, bloqueie qualquer ligação inespecífica com 100 microlitros de soro normal a 5% em TBS por 30 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, bata nas lâminas para remover o excesso de soro e incube as lâminas em 100 microlitros do coquetel de anticorpos primários de interesse por uma hora em uma câmara umidificada. Lave as lâminas marcadas com anticorpos em TBST por cinco minutos.
Após a secagem, rotule as células com 100 microlitros do coquetel de anticorpos secundários de interesse por 30 minutos na câmara umidificada, seguidos de uma lavagem de 10 minutos em TBS. Incube as lâminas marcadas com anticorpos secundários secos com 100 microlitros do coquetel de anticorpos terciários de interesse por 30 minutos, seguidos de 10 minutos de lavagem com TBS. No final da lavagem, seque as lâminas e monte os lenços com um meio de montagem suplementado com dapi.
Em seguida, trevo cada lâmina com uma lamínula e deixe o meio de montagem endurecer por pelo menos duas horas. Para digitalizar as lâminas, abra o software do microscópio e carregue o protocolo de digitalização de imagem. Carregue a primeira lâmina na platina do microscópio.
Em seguida, na barra de controle, clique em definir exposição e ajuste o tempo de exposição para cada filtro até obter um sinal suficiente, mas não saturante. Clique em iniciar no painel superior e abra a pasta LabID. Insira o ID do primeiro slide e clique em Avançar.
Para obter a visão geral da lâmina sob luz de campo brilhante com uma ampliação de 4x, clique na imagem monocromática e encontre a amostra. Para selecionar a área de tecido a ser escaneada, pressione a tecla control e use o cursor para selecionar ou desmarcar as regiões de interesse a serem escaneadas com ampliação de 4x. Para obter uma imagem fluorescente vermelha/azul/verde de cada região, clique em imagem de baixa potência.
Para seleção de campo de alta potência, pressione a tecla control e selecione pelo menos cinco regiões de interesse que correspondam às áreas do tecido que serão escaneadas com ampliação de 20x. Em seguida, para obter uma aquisição de imagem multiespectral de cada campo, clique em imagem de alta potência e clique em armazenamento de dados para armazenar as imagens na pasta de ID de laboratório apropriada. Para criar um novo projeto no menu de arquivo, selecione novo projeto, no menu de recursos de localização, selecione segmentação de célula e, no menu de fenotipagem, selecione fenotipagem e clique em configurar.
Em formato de imagem, selecione multiespectral. No formato de amostra, escolha fluorescência. Para integrar as imagens representativas ao projeto, no menu de arquivo, clique em abrir imagem e selecione de 10 a 30 imagens representativas de toda a série.
Para remover a florescência automática, abra o slide não corado e selecione a fonte da biblioteca e os fluoróforos apropriados. Clique em autoflorescence e selecione a área de auto bloomnce no slide em branco. Para gerar uma imagem composta, selecione preparar tudo para integrar a biblioteca de fluorescência e os espectros de fluorescência automática.
Clique no ícone de olho para abrir o painel do editor de visualização e desmarque a opção de fluorescência automática para aparar o sinal de fluorescência automática. Selecione uma cor apropriada para cada marcador. Para segmentar as células, no menu do compartimento, selecione núcleos e membrana.
No menu de núcleos, defina DAPI como a contracoloração nuclear. Clique em segmentar células e verifique a segmentação dos núcleos nas membranas celulares. Para fenotipar as células, no menu fenótipo, clique em adicionar.
Para criar as categorias de fenótipo de célula, selecione mais de cinco representantes para a combinação Fluorophor e Fluorophor e clique em treinar classificador. O classificador está criando um algoritmo que atribui um fenótipo para cada célula com um intervalo de confiança. Amplie e verifique os fenótipos das células.
Em seguida, clique em fenótipo tudo para salvar o algoritmo de fenótipo e o projeto de imagem, no menu de arquivo, selecione salvar projeto. Em seguida, nomeie o projeto e salve-o. Para executar uma análise em lote da série, selecione análise de banho e selecione o projeto salvo.
Selecione uma pasta para armazenar os dados em lote. Adicione as imagens a serem analisadas e clique em executar. Ao final da análise, verifique a qualidade da imagem composta e verifique a fenotipagem de todas as imagens da série.
A análise do tumor infiltrando células T CD8 positivas, em uma amostra clara de carcinoma de células renais por imagem multiespectral de fluorescência, revela que aproximadamente metade das células T CD8 positivas são positivas para PD-1 e cerca de 1/3 são duplamente positivas para PD-1 e Tim-3. Depois de integrar esses vários sinais celulares em uma seção de tecido, a medição da intensidade da florescência de PD-1 em células T positivas para PD-1 positivas para Tim-3 versus células T positivas para CD8 positivas para PD-1 e negativas para Tim-3, revela que o MFI de PD-1 é maior quando Tim-3 é coexpresso, reforçando a relevância funcional da expressão de Tim-3. Neste experimento representativo, 66% dos pacientes com tumor renal também foram positivos para a expressão do ligante PD-1 e 100% foram positivos para o ligante Tim-3 Galactin-9.
A pontuação clínica dos tecidos tumorais de pacientes com carcinoma de células renais também demonstrou a correlação positiva entre o número e a porcentagem de células T positivas para CD-8 infiltrantes tumorais expressando PD-1 e Tim-3 e os parâmetros de pontuação prognóstica, mas não CD-8 positivo para PD-1 não expressando Tim-3. Curiosamente, pacientes com carcinoma de células renais com células T positivas para CD-8 co-expressando PD1 com e Tim 3 acima da porcentagem mediana foram mais propensos a recidiva, enquanto a expressão de PD-1 sem co-expressão de Tim-3 não foi correlacionada com a recidiva do paciente. Embora eu tenha tentado esse procedimento, é importante lembrar de revisar o fenótipo das células com dois investigadores separados, incluindo um patologista, se possível.
Após este procedimento, outros assuntos, como citometria Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do câncer explorarem as respostas imunes em órgãos afetados.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método inovador de análise de imunofluorescência multiplexada para a contagem automática de células imunes tumorais com base em seu fenótipo. A técnica foi desenvolvida para analisar o microambiente tumoral e identificar biomarcadores prognósticos para a resposta à imunoterapia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Oncologia
- Biologia Celular
Contexto
- O microambiente tumoral desempenha um papel crucial na progressão do câncer e na resposta ao tratamento.
- Os linfócitos T CD8+ são importantes para a resposta imune em tumores.
- Os métodos existentes para contagem celular podem ser demorados e exigem processamento extensivo de dados.
- Este estudo tem como objetivo simplificar a análise dos fenótipos de células imunes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para a contagem automática de células imunes em amostras tumorais.
- Facilitar análises de grandes coortes na pesquisa do câncer.
- Melhorar a compreensão das interações imunes no microambiente tumoral.
Métodos Utilizados
- Imunofluorescência multiplexada para análise de fenótipo celular.
- Imagem multiespectral de fluorescência in situ para contagem automática.
- Preparação de cortes de tecido com barreiras hidrofóbicas para imagem.
- Técnicas de processamento de dados para análise de populações celulares.
Resultados Principais
- O método permite a contagem eficiente de subpopulações de células T CD8+.
- Os resultados indicam marcadores prognósticos potenciais derivados do microambiente tumoral.
- A técnica é reprodutível e adequada para estudos em larga escala.
- Melhor compreensão da dinâmica das células imunes em tumores.
Conclusões
- Este método inovador aprimora a análise de células imunes tumorais.
- Oferece uma estrutura para identificar biomarcadores para imunoterapia.
- A abordagem pode ser adaptada para diversas aplicações de pesquisa em oncologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise de imunofluorescência multiplexada permite a quantificação automatizada de fenótipos de células imunes no microambiente tumoral, apoiando a validação de alvos e a descoberta de biomarcadores em imuno-oncologia. Ao medir a coexpressão de receptores inibitórios, como PD-1 e Tim-3, em linfócitos T CD8+, o método fornece confiança preditiva para a estratificação de pacientes e resposta terapêutica. Esta abordagem resolve um desafio-chave na fase de descoberta: traduzir o perfil espacial do sistema imunológico em informações acionáveis para triagem de portfólio e desmistificação mecanicista.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas esclarecendo os padrões de coexpressão de PD-1 e Tim-3 em linfócitos T CD8+ infiltrantes tumorais.
- Valor Operacional: Permite a desmistificação biológica por meio da validação funcional de marcadores de exaustão no carcinoma de células renais.
- Valor Estratégico: Reforça a confiança preditiva e auxilia na triagem de portfólios ao associar a frequência de linfócitos T PD-1+/Tim-3+ a mau prognóstico e risco de recidiva.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores por meio de imagem multiespectral e fenotipagem padronizadas.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade do ensaio e saídas quantitativas por meio de contagem e segmentação celular automatizadas.
- Valor Estratégico: Melhora a prontidão para triagem e a reutilização da plataforma ao integrar a preparação de bibliotecas fluorescentes e a remoção de autofluorescência.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra a relevância da doença por meio da correlação entre linfócitos T CD8+ PD-1+/Tim-3+ e escores prognósticos no carcinoma de células renais.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade translacional, da descoberta à validação pré-clínica, por meio do treinamento de algoritmos de fenotipagem e imagem composta.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ajustadas ao risco ao identificar a coexpressão de Tim-3 como biomarcador funcionalmente relevante, independente do PD-1 isolado.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai da verificação de hipóteses à identificação de compostos líderes, permitindo um perfil imunológico que orienta a confiança no alvo e o alinhamento de biomarcadores translacionais.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao quantificar a coexpressão de PD-1 e Tim-3 em linfócitos T CD8+ no microambiente tumoral.
- Triagem: Garante prontidão e reprodutibilidade do ensaio por meio de imagem multiespectral automatizada e fluxos de trabalho fenotípicos padronizados.
- Análise: Gera medidas quantitativas, como a intensidade média de fluorescência (MFI) de PD-1 e a porcentagem de células duplamente positivas, permitindo comparação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Estabelece ligação com a continuidade pré-clínica por meio da correlação prognóstica em espécimes de carcinoma de células renais, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável para o perfilamento imunológico em diferentes tipos de tumores, reduzindo o desenvolvimento redundante de ensaios.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista nas vias de exaustão de linfócitos T.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da imunofluorescência multiplexada para quantificação de células imunes.
- Valor Estratégico: Decisões de prosseguimento ou interrupção mais precisas, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados mediante identificação precoce de biomarcadores.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em limiares de linfócitos T PD-1+/Tim-3+ associados à recidiva.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em coloração por imunofluorescência, imagem multiespectral e software de análise de imagens para fenotipagem.
- Depende de instrumentação, incluindo microscópios de fluorescência com capacidades multiespectrais e controles ambientais para o preparo de lâminas.
- Necessita padronização entre equipes de painéis de anticorpos, configurações de exposição e algoritmos de fenotipagem em diferentes locais.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tipos de tecidos, métodos de fixação e protocolos de recuperação de antígenos.
- Inclui limitações práticas, como procedimentos demorados de fenotipagem e processamento complexo dos dados brutos, exigindo verificações de qualidade pós-aquisição.
