Multiplexado imunofluorescência análise e quantificação de Intratumoral PD-1^{+ +} Tim-3 CD8⁺ T células

O objetivo geral desta análise de imunofluorescência multiplexada é contar automaticamente as células com base em seu fenótipo. Este método permite a multifluorescência e a contagem automática de células para analisar o fenótipo e a função das células imunes tumorais dentro de um microambiente tumoral. Essa tecnologia facilitou a geração de dois tipos de prognóstico composto para previsto por seus marcadores derivados diretamente do microambiente tumoral.

Geralmente, os indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque o procedimento de fenotipagem é muito longo e os dados brutos resultantes requerem processamento adicional. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando tentamos caracterizar o fenótipo e as interações imunológicas das células annhodge miranty. Após o descongelamento, use uma toalha de papel para secar cuidadosamente as lâminas ao redor das seções de tecido e, em seguida, circule os tecidos com uma caneta barreira hidrofóbica.

Quando a barreira secar, fixe as amostras em acetona a 100% por cinco minutos, seguido de dois minutos de secagem ao ar e, em seguida, lave as lâminas em TBS por 10 minutos. Pré-trate as lâminas com 3 gotas de 0,1% Avidin por 10 minutos no escuro e, em seguida, toque ou mova as lâminas para cobrir o tecido com a solução de Avidin. Adicione 3 gotas de 01% de biotina a cada amostra e, em seguida, toque ou mova a biotina nas amostras, seguida de uma lavagem TBS conforme demonstrado.

Em seguida, bloqueie qualquer ligação inespecífica com 100 microlitros de soro normal a 5% em TBS por 30 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, bata nas lâminas para remover o excesso de soro e incube as lâminas em 100 microlitros do coquetel de anticorpos primários de interesse por uma hora em uma câmara umidificada. Lave as lâminas marcadas com anticorpos em TBST por cinco minutos.

Após a secagem, rotule as células com 100 microlitros do coquetel de anticorpos secundários de interesse por 30 minutos na câmara umidificada, seguidos de uma lavagem de 10 minutos em TBS. Incube as lâminas marcadas com anticorpos secundários secos com 100 microlitros do coquetel de anticorpos terciários de interesse por 30 minutos, seguidos de 10 minutos de lavagem com TBS. No final da lavagem, seque as lâminas e monte os lenços com um meio de montagem suplementado com dapi.

Em seguida, trevo cada lâmina com uma lamínula e deixe o meio de montagem endurecer por pelo menos duas horas. Para digitalizar as lâminas, abra o software do microscópio e carregue o protocolo de digitalização de imagem. Carregue a primeira lâmina na platina do microscópio.

Em seguida, na barra de controle, clique em definir exposição e ajuste o tempo de exposição para cada filtro até obter um sinal suficiente, mas não saturante. Clique em iniciar no painel superior e abra a pasta LabID. Insira o ID do primeiro slide e clique em Avançar.

Para obter a visão geral da lâmina sob luz de campo brilhante com uma ampliação de 4x, clique na imagem monocromática e encontre a amostra. Para selecionar a área de tecido a ser escaneada, pressione a tecla control e use o cursor para selecionar ou desmarcar as regiões de interesse a serem escaneadas com ampliação de 4x. Para obter uma imagem fluorescente vermelha/azul/verde de cada região, clique em imagem de baixa potência.

Para seleção de campo de alta potência, pressione a tecla control e selecione pelo menos cinco regiões de interesse que correspondam às áreas do tecido que serão escaneadas com ampliação de 20x. Em seguida, para obter uma aquisição de imagem multiespectral de cada campo, clique em imagem de alta potência e clique em armazenamento de dados para armazenar as imagens na pasta de ID de laboratório apropriada. Para criar um novo projeto no menu de arquivo, selecione novo projeto, no menu de recursos de localização, selecione segmentação de célula e, no menu de fenotipagem, selecione fenotipagem e clique em configurar.

Em formato de imagem, selecione multiespectral. No formato de amostra, escolha fluorescência. Para integrar as imagens representativas ao projeto, no menu de arquivo, clique em abrir imagem e selecione de 10 a 30 imagens representativas de toda a série.

Para remover a florescência automática, abra o slide não corado e selecione a fonte da biblioteca e os fluoróforos apropriados. Clique em autoflorescence e selecione a área de auto bloomnce no slide em branco. Para gerar uma imagem composta, selecione preparar tudo para integrar a biblioteca de fluorescência e os espectros de fluorescência automática.

Clique no ícone de olho para abrir o painel do editor de visualização e desmarque a opção de fluorescência automática para aparar o sinal de fluorescência automática. Selecione uma cor apropriada para cada marcador. Para segmentar as células, no menu do compartimento, selecione núcleos e membrana.

No menu de núcleos, defina DAPI como a contracoloração nuclear. Clique em segmentar células e verifique a segmentação dos núcleos nas membranas celulares. Para fenotipar as células, no menu fenótipo, clique em adicionar.

Para criar as categorias de fenótipo de célula, selecione mais de cinco representantes para a combinação Fluorophor e Fluorophor e clique em treinar classificador. O classificador está criando um algoritmo que atribui um fenótipo para cada célula com um intervalo de confiança. Amplie e verifique os fenótipos das células.

Em seguida, clique em fenótipo tudo para salvar o algoritmo de fenótipo e o projeto de imagem, no menu de arquivo, selecione salvar projeto. Em seguida, nomeie o projeto e salve-o. Para executar uma análise em lote da série, selecione análise de banho e selecione o projeto salvo.

Selecione uma pasta para armazenar os dados em lote. Adicione as imagens a serem analisadas e clique em executar. Ao final da análise, verifique a qualidade da imagem composta e verifique a fenotipagem de todas as imagens da série.

A análise do tumor infiltrando células T CD8 positivas, em uma amostra clara de carcinoma de células renais por imagem multiespectral de fluorescência, revela que aproximadamente metade das células T CD8 positivas são positivas para PD-1 e cerca de 1/3 são duplamente positivas para PD-1 e Tim-3. Depois de integrar esses vários sinais celulares em uma seção de tecido, a medição da intensidade da florescência de PD-1 em células T positivas para PD-1 positivas para Tim-3 versus células T positivas para CD8 positivas para PD-1 e negativas para Tim-3, revela que o MFI de PD-1 é maior quando Tim-3 é coexpresso, reforçando a relevância funcional da expressão de Tim-3. Neste experimento representativo, 66% dos pacientes com tumor renal também foram positivos para a expressão do ligante PD-1 e 100% foram positivos para o ligante Tim-3 Galactin-9.

A pontuação clínica dos tecidos tumorais de pacientes com carcinoma de células renais também demonstrou a correlação positiva entre o número e a porcentagem de células T positivas para CD-8 infiltrantes tumorais expressando PD-1 e Tim-3 e os parâmetros de pontuação prognóstica, mas não CD-8 positivo para PD-1 não expressando Tim-3. Curiosamente, pacientes com carcinoma de células renais com células T positivas para CD-8 co-expressando PD1 com e Tim 3 acima da porcentagem mediana foram mais propensos a recidiva, enquanto a expressão de PD-1 sem co-expressão de Tim-3 não foi correlacionada com a recidiva do paciente. Embora eu tenha tentado esse procedimento, é importante lembrar de revisar o fenótipo das células com dois investigadores separados, incluindo um patologista, se possível.

Após este procedimento, outros assuntos, como citometria Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do câncer explorarem as respostas imunes em órgãos afetados.