Name: Um ensaio simples baseada em célula imunofluorescência para detectar anticorpos contra o Receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) no sangue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprenda um ensaio de imunofluorescência baseado em células para detectar anticorpos contra o receptor NMDA no sangue, utilizando células HEK293. Este método simples auxilia no diagnóstico de encefalite autoimune.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação médica do Chang Gung (o número de concessão CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 e CMRPG3E0633).

O estudo foi aprovado pelo institucional Review Board de Chang Gung Memorial Hospital em Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3).
1. preparação do plasmídeo de expressão a NR1-GFP
<ol><li>Mix 10 ng de plasmídeo NR1-GFP com 100 µ l de estirpe de células competentes de Escherichia coli DH5α em uma estéril 1,5 mL centrifugar o tubo, pipetar a mistura suavemente até e para baixo 4 - 6 vezes e incubar o tubo no gelo por 20 min.</li>
	<li>Incubar o tubo a 42 ° C por 1 min em um banho de água, retire o tubo do banho, adicionar 1 mL de meio de caldo de carne (LB) lisogenia no tubo e incubar o tubo a 37 ° C numa incubadora com agitação por 1h.</li>
	<li>A propagação de 50 µ l da mistura em uma placa de ágar LB contendo ampicilina (0,1 mg/mL) e incubar a placa de ágar LB a 37 ° C numa incubadora durante a noite.</li>
	<li>Escolher uma única colônia da placa de ágar LB durante a noite usando uma ponteira estéril, e agite a ponta em um em um tubo de cultura bacteriana contendo 5 mL de meio LB e ampicilina (0,1 mg/mL). Incube o tubo a 37 ° C numa incubadora com agitação durante a noite.</li>
	<li>Alíquota 3 mL de cultura bacteriana durante a noite para um balão de 500 mL que contém 250 mL de meio de LB estéril e ampicilina (0,1 mg/mL). Incube o frasco a 37 ° C, com agitação. Verifique regularmente se a densidade óptica (OD) da cultura bacteriana no comprimento de onda de 600 nm, utilizando um espectrômetro até o OD600 atinge 0,6-1,0. Nota: Misture bem 800 µ l de cultura bacteriana durante a noite com 200 glicerol µ l para preparar o estoque de glicerol e armazenar o estoque de glicerol sob a-80 ° C para uso futuro.</li>
	<li>Preparar o plasmídeo de expressão NR1-GFP da cultura bacteriana 250ml<ol>
<li>Coletar as células por centrifugação a 6.000 x g, durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Ressuspender as bactérias em 10 mL de tampão de ressuspensão contendo RNase A; vórtice completamente até que nenhum grupo é visto.</li>
		<li>Adicionar 10 mL de tampão de lise da suspensão bacteriana, delicadamente inverter a mistura 4 - 6 vezes e incubar o lisado em temperatura ambiente (RT) por 5 min.</li>
		<li>Adicionar 10 mL de tampão de precipitação pre-refrigerados para o lisado, inverta suavemente a mistura 4 - 6 vezes.</li>
		<li>Despeje o lisado para o barril de um cartucho de filtro com a tampa Espere por 10 min a RT</li>
		<li>Retire a tampa do bocal de saída do cartucho, insira o cartucho de um atuador e pressione suavemente o êmbolo. Recolher o filtrado lisado em um tubo de 50 mL.</li>
		<li>Adicionar 2,5 mL proprietárias buffer do fabricante para o filtrado lisado, misture a mistura por inversão do tubo cerca de 10 vezes e incubar a mistura no gelo por 30 min.</li>
		<li>Aplique a mistura de lisado filtrada para uma coluna de filtro que foi previamente incubada com 10 mL de tampão de equilibração. Permita que a coluna de drenagem por gravidade.</li>
		<li>Lavar a coluna com 30 mL de tampão de lavagem duas vezes e, em seguida, Eluir o DNA da coluna usando 15 mL de tampão de eluição.</li>
		<li>Adicionar o isopropanol 10,5 mL (0,7 volumes) para o buffer de DNA eluted, misture bem e centrifugar a mistura a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Decante o sobrenadante cuidadosamente, lavar o sedimento de DNA com 5 mL de etanol a 70% livre de endotoxina, uma vez e centrifugar a 20.000 x g durante 10 minutos.</li>
		<li>Decante o sobrenadante, secar a pelota por 5-10 min numa vizinhança de química e dissolva a pelota em 300-500 µ l de buffer livre de endotoxinas.</li>
		<li>Determine a concentração de plasmídeo medindo-se a absorção da solução no UV 260/280 nm, utilizando um espectrofotômetro. Nota: Prepare o plasmídeo de expressão usando o mesmo protocolo GFP.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. transfecção de células HEK293 com plasmídeo de expressão NR1-GFP
<ol><li>Alíquota 200 µ l de solução de 2% de gelatina para cada um bem de uma placa de cultura de 48-bem e incubar a placa a 37 ° C durante pelo menos 30 min.</li>
	<li>Aspire a solução de gelatina das células de 5 x 104 HEK293 bem e sementes em 200 µ l de meio de cultura celular contendo 10% soro bovino fetal (FBS) em cada poço. Incube a placa a 37 ° C numa incubadora umidificado fornecido com 5% CO2 durante a noite. Nota: As células foram contadas usando um hemocytometer.</li>
	<li>No dia seguinte, substituir o gasto médio de cultura com 200 µ l de meio de cultura fresco contendo 10% FBS por bem.</li>
	<li>Para cada único bem, preparar solução A misturando 100 ng do plasmídeo NR1-tGFP com 20 µ l meio de cultura e a solução B pelo reagente de transfeccao 0,8 µ l de mistura com meio de cultura 20 µ l. Multiplique o número de poços necessários para preparar o volume total para cada experimento.</li>
	<li>Preparar a solução C, misturando a solução A e a solução B e incubar a mistura a RT para 20-30 min.</li>
	<li>Alíquota 40 μL de solução C para cada bem que contém as células HEK293, agitar suavemente o frasco a placa e incubar a placa a 37 ° C numa incubadora umidificado fornecido com 5% CO2 durante a noite.</li>
	<li>Verifique a expressão da proteína recombinante de NR1-GFP nas células hospedeiras microscópio fluorescente com ampliação de X-200 X 40 (excitação/emissão: 482/502 nm) e proceder ao ensaio de imunofluorescência baseada em célula. Nota: Transfect o plasmídeo de expressão GFP nas células HEK293 usando o mesmo protocolo.</li>
</ol>3. ensaio de imunofluorescência cell-based
<ol><li>Aspire o gasto médio dos poços, Então lave cada poço com 200 µ l de fosfato tamponado salino (PBS), três vezes.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de solução de paraformaldeído 4% a cada poço; incube a placa na RT por 15 min.</li>
	<li>Aspirar a solução de paraformaldeído dos poços e cada um Lave bem com 200 µ l de PBS três vezes.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de 10% de leite desnatado em PBST (0.1% Tween-20 em PBS) solução para cada bem e incube a placa na RT para 1 h com agitação suave.</li>
	<li>Aspirar o leite desnatado de 10% em solução PBST do poço e, em seguida, lavar os poços com 200 µ l de PBST uma vez.</li>
	<li>Incube os poços com plasma diluído (1: 100 em PBST) como o anticorpo primário com agitação suave em RT por 1h. Nota: O Plasma é obtido de sangue de doentes com suspeita de ter encefalite auto-imune.</li>
	<li>Aspire o plasma diluído dos poços e lavar cada bem com 200 µ l de PBST três vezes.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de anti-humana de cabra IgG conjugada com Alexa Fluor 594 (1:1, 000 diluição em PBST) a cada poço e incubar a placa de cultura em RT com agitação suave por 1h.</li>
	<li>Aspire o anti-humano de cabra IgG conjugada com Alexa Fluor 594 solução e cada um lavar bem com 200 µ l de PBST três vezes.</li>
	<li>Adicione solução de glicerol 100 µ l (50% de glicerol em PBS e de 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1: 100.000) para cada poço.</li>
	<li>Observar e as células sob um microscópio fluorescente usando um 10 X ocular e 4x, 10x e 20 X objetivos da imagem. Nota: Utilize o filtro correto para cada tintura: para NR1-GFP (excitação/emissão = 482/502 nm), para Alexa Fluor 594 (excitação/emissão = 561/594 nm), para DAPI (excitação/emissão = 358/461 nm). Realizar o controle negativo usando as células HEK expressando GFP, da mesma forma.</li>
</ol>

<ol><li>Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+surface+antibody-mediated+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis.</a> Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).</li>
<li>Lancaster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+and+treatment+of+autoimmune+Encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis.</a> J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Pruss, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+analysis+of+NMDA+receptor+antibodies+in+encephalitis+of+unknown+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin.</a> Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).</li>
<li>Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Autoimmune encephalopathies.</a> Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).</li>
<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).</li>
<li>Chapman, M. R., Vause, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+diagnosis%2C+psychiatric+presentation%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment.</a> Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).</li>
<li>Gable, M., Glaser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+encephalitis+appearing+as+a+new-onset+psychosis%3A+disease+course+in+children+and+adolescents+within+the+california+encephalitis+project%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project.</a> Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).</li>
<li>Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+experience+and+laboratory+investigations+in+patients+with+anti-NMDAR+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis.</a> Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate+antibody+encephalitis%3A+temporal+progression+of+clinical+and+paraclinical+observations+in+a+predominantly+non-paraneoplastic+disorder+of+both+sexes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes.</a> Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).</li>
<li>Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+antibody+encephalitis%3A+performance+evaluation+and+laboratory+experience+with+the+anti-NMDA-receptor+IgG+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay.</a> Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).</li>
<li>Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+glutamate+receptor+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes.</a> Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).</li>
<li>Ramberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+diagnostic+accuracy+of+microscopy+and+flow+cytometry+in+evaluating+n-methyl-d-aspartate+receptor+antibodies+in+serum+using+a+live+cell-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay.</a> PLoS One. 10 (3), e0122037(2015).</li>
<li>Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+a+severe%2C+multistage%2C+treatable+disorder+presenting+with+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis.</a> J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).</li>
<li>Dahm, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+autoantibodies+against+brain+antigens+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease.</a> Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).</li>
<li>Jézéquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+single+molecule-based+methods+to+detect+anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+autoantibodies+in+patients+with+first-episode+psychosis+from+the+OPTiMiSE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project.</a> Biol Psychiatry. , (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Existem vários ensaios imunológicos cell-based para a tela a presença de auto-anticorpos contra o receptor NMDA relatados na literatura, incluindo imunofluorescência baseada em célula viva do ensaio11, fixada ensaio imunofluorescência baseada em célula9 , e baseados em citometria de fluxo do ensaio14. O ensaio de imunofluorescência baseada em célula ao vivo deve ser realizado logo após a preparação de células ectopically, expressando a proteína NR1, ...

Anti-NMDA receptor auto-imune encefalite é uma entidade de doença recentemente reconhecidas que pode ocorrer em pacientes de todas as idades e afeta predominantemente feminino pacientes1,2. É um da encefalite mais frequentemente diagnosticada entre os pacientes com etiologia desconhecida inicial de encefalite3. Pacientes afetados com encefalite do receptor NMDA anti geralmente têm sintomas prodrômicos de uma dor de cabeça ou febre, seguida pelo rápido desenvolvimento de mudança de nível de consciência e de uma variedade de sintomas neuropsiquiátricos agudas, incluindo agitação, irritabilidade , ansiedade, insônia, alucinações, delírios, agressividade, comportamentos bizarros, anormalidades do movimento, desregulação autonômica e apreensão ataca4,5. Reconhecimento precoce desta condição e tratamento atempado com imunoterapia são importantes para um resultado melhor e até completa recuperação em doentes afectados6. Portanto, sugere-se que a encefalite auto-imune do anti-NMDA receptor deve ser considerada como um importante diagnóstico diferencial de pacientes que apresentam com características psicóticas agudas ou novo-início7,8.
Além de características clínicas, a detecção de auto-anticorpos contra os receptores NMDA no sangue ou CSF é essencial para o diagnóstico preciso de anti-NMDA receptor encefalite auto-imune9. A maioria dos testes imunológicos para detectar os auto-anticorpos de receptor NMDA anti estão disponíveis em algumas pesquisa laboratórios10,11, e há apenas um ensaio de imunofluorescência baseada em célula comercialmente disponível para rastreio do anti-NMDA receptor auto-anticorpos12. O objetivo deste estudo é desenvolver um ensaio imunofluorescência de baseada em célula interna simples que pode ser convenientemente usado em laboratório para a tela a presença de auto-anticorpos de receptor NMDA anti para facilitar a pesquisa clínica do receptor NMDA anti encefalite auto-imune. O receptor NMDA é um heterotetramer íon canaleta complexo proteico especificamente expressado no cérebro. É feito de duas subunidades de NR1 obrigatórias e a combinação de uma ou duas subunidades de NR2A e NR2B, NR2C, NR2D13. Um estudo anterior relatou que o principal epítopo alvejado de anticorpos estava no domínio N-terminal extracelular do NR1 subunidade5. Daí, neste protocolo, podemos expressar a proteína NR1-subunidade recombinante humana do receptor NMDA com proteína verde fluorescente (GFP) na linha de células epiteliais de rim embrionário humano (HEK293) e desenvolver um ensaio imunofluorescência baseados em células para detectar a classe IgG de auto-anticorpos de receptor NMDA anti no sangue.

<table><tbody><tr><td>GRIN1 (GFP-tagged) - Receptor de glutamato humano, ionotrópico, N-metil D-aspartato 1 (GRIN1), variante de transcrição NR1-1</td><td>Origene (Rockville, MD, EUA)</td><td>RG219368</td><td>clone NR1-cDNA marcado com sequências tGFP C-terminal</td></tr><tr><td>pCMV6-AC-GFP</td><td>Origene (Rockville, MD, EUA)</td><td>PS100010</td><td>vetor mamífero com etiqueta tGFP C-terminal</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen (Hilden Alemanha)</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Transfecção de Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA)</td> <td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Soro Reduzido Meio</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Glicose Alta, Piruvato</td><td>Thermo Fisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal Caracterizado, Origem dos EUA</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-IgG humano (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11014</td><td></td></tr><tr><td>Controle positivo: receptor anti-glutamato (tipo NMDA)</td> <td>Euroimmun AG, L&uuml; beck, Alemanha</td><td>CA 112d-0101</td><td></td></tr><tr>Kit <td></td><td></td><td></td>de<td>Ensaio Euroimmun</td></tr></tbody></table>

um ensaio simples baseada em célula imunofluorescência para detectar anticorpos contra o receptor n-metil-d-aspartato (nmda) no sangue

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

A presença de auto-anticorpos de anti-NMDA receptor pode causar vários sintomas neuropsiquiátricos nos pacientes afetados, denominados encefalite auto-imune do anti-NMDA receptor. Detecção dos auto-anticorpos específicos contra o receptor NMDA no sangue ou no líquido cerebrospinal (CSF) é essencial para o diagnóstico preciso desta condição. O receptor NMDA é um íon canaleta complexo proteico que contém quatro subunidades, incluindo dois subunidade obrigatória de receptores NMDA 1 (NR1) e um ou dois receptores NMDA 2A subunidade (NR2A), 2B de subunidade do receptor NMDA (NR2B), subunidade do receptor NMDA 2C (NR2C), ou o receptor NMDA subunidade 2D (NR2D). O epítopo de auto-anticorpos de receptor NMDA-anti foi relatado para estar presentes no domínio N-terminal extracelular de NR1 subunidade do receptor NMDA. O objetivo deste estudo é desenvolver um ensaio de imunofluorescência baseada em célula simples que pode ser usado como um teste de triagem para detectar a presença de auto-anticorpos contra NR1 subunidade do receptor NMDA no sangue para facilitar a pesquisa clínica e básica de encefalite auto-imune do receptor NMDA-anti.

Em média, poderíamos obter 200-300 µ g plasmídeo de expressão livre de endotoxinas NR1-GFP e GFP de cultura bacteriana 250 mL, seguindo os procedimentos descritos na secção 1 do protocolo. Um montante de 100 ng/poço do plasmídeo a expressão foi usado para o transfection das células HEK293 cultivadas na placa de 48 conforme descrito na seção 2 do protocolo. 24-30 h após a transfeccao, as células expressaram a NR1-GFP, e proteínas recombinantes de GFP poderiam ser detectadas sob microscópio...

Ectopically manifestámos NR1 subunidade do receptor NMDA marcado com proteína verde fluorescente em células embrionárias humanas (HEK293) como antígeno para detectar anticorpos contra o receptor NMDA no sangue de pacientes suspeitado com encefalite auto-imune. Este método simples pode ser adequado para fins em situações clínicas de triagem.

Um ensaio simples baseada em célula imunofluorescência para detectar anticorpos contra o Receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) no sangue

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

O objetivo geral deste ensaio é detectar autoanticorpos contra o receptor NMDA no sangue de pacientes com suspeita de encefalite autoimune. A medida ajuda a responder às questões-chave no diagnóstico diferencial de pacientes com sintomas neuropsiquiátricos agudos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é uma medida de triagem simples e confiável.Comece este procedimento preparando placas de cultura revestidas com gelatina. Alíquota de 200 microlitros de uma solução de gelatina a 2% para cada poço de uma placa de cultura de 48 poços e incube a placa a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Após 30 minutos, aspire a solução de gelatina dos poços.Semear em cada poço 5 vezes 10 para as 4ª células HEK293 em 200 microlitros de meio de cultura celular, contendo 10%FBS. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada fornecida com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, substitua o meio de cultura gasto em cada poço por 200 microlitros de meio de cultura fresco, contendo 10% de FBS.Aumentando de acordo com o número total de poços no experimento, prepare a solução A misturando o plasmídeo NR1-GFP com o meio de cultura. Preparar a solução B mistu

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Neurociência

Este vídeo demonstra uma técnica para identificar anticorpos contra antígenos específicos em uma amostra usando uma cultura neuronal do hipocampo de rato. Ao expor neurônios cultivados a amostras de pacientes contendo autoanticorpos direcionados aos receptores N-metil-D-aspartato (NMDARs), a presença de autoanticorpos ligados à superfície neuronal é revelada por meio de imunocoloração.

Um ensaio para detectar autoanticorpos em soro humano usando uma cultura neuronal do hipocampo

Ao longo dos últimos anos, os ensaios baseados em células vivas têm sido utilizados com sucesso para detectar anticorpos contra antigénios de superfície e de conformação. Aqui, descrevemos um método que utiliza o fluxo de alto rendimento citometria permitindo a análise de grandes grupos de pacientes. Detecção de novos anticorpos irá melhorar o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados pela imunes.

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

Descrevemos aqui um método para gerar microarrays de antígenos personalizáveis que podem ser usados para a detecção simultânea de autoanticorpos séricos IgG e IgM de humanos e camundongos. Essas matrizes permitem alto rendimento e detecção quantitativa de anticorpos contra quaisquer antígenos ou epítopos de interesse.

Geração de duas cores Antigen Microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos IgG e IgM

Os autoanticorpos DFS70 imitam padrões comuns de anticorpos antinucleares doença associada a exata interpretação desafiador quando usando substratos convencionais de HEp-2. O protocolo descreve vantagens do romance substrato engenharia de HEp-2 em HEp-2 convencional em ANA triagem e distinguir padrões de DFS70 com alta confiança em monoespecíficos e mistos casos positivos de ANA.

Simultânea distinção de monoespecíficos e DFS70 mistos padrões durante exibição de ANA com um substrato de romance nocaute ELITE/DFS70 HEp-2

O objetivo do presente protocolo é facilitar o estudo dos receptores de NMDA (NMDAR) em uma escala maior e permitir a análise dos efeitos moduladora de pequenas moléculas e suas aplicações terapêuticas.

Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato

Baseada em célula de ensaio é um método amplamente utilizado para detectar imunoglobulina de soro antiaquaporina-4 G. Esse método pode ser aplicado para o diagnóstico clínico e pesquisas científicas de transtornos do espectro óptico Neuromielite.

Deteção de imunoglobulina Antiaquaporina-4 G de soro humano por ensaio baseados em células

Modelamos um ensaio de ECL multiplexado simples que combina 7 ensaios de autoanticorpos juntos. O ensaio é capaz de rastrear DM1 e várias outras doenças autoimunes, simultaneamente, incluindo doença celíaca, doença tireoidiana autoimune e síndrome poliglandular autoimune 1.

Um ensaio de eletroquimioluminescência de alto rendimento 7-plex rastreando simultaneamente diabetes tipo 1 e múltiplas doenças autoimunes

Encefalite autoimune é uma nova categoria de doenças mediadas por anticorpos do sistema nervoso central. Neurônios hipocampais podem ser usados para descobrir e caracterizar esses anticorpos. Este artigo fornece um protocolo para a cultura celular primária e imunostenção para determinar autoanticorpos no soro e fluido cefalorraquidiano dos pacientes.

Culturas neuronais hipocampais para detectar e estudar novos anticorpos patogênicos envolvidos em encefalite autoimune

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal de esclerose múltipla (EM), que compartilha com a doença humana uma resposta autoimune humoral robusta. Aqui, relatamos um protocolo ELISA simples e flexível para quantificar autoanticorpos no soro de camundongos imunizados com EAE.

Quantificação de anticorpos autorreativos em camundongos após encefalomielite autoimune experimental

Fornecemos uma metodologia de imunocitoquímica (ICC) passo a passo para detectar anti-MDA5. Essa abordagem envolve fixação celular, permeabilização, incubação de anticorpos e técnicas de imagem, que permitem a detecção precisa de autoanticorpos anti-MDA5, auxiliando no diagnóstico de doença pulmonar intersticial de rápida progressão em pacientes com miosite.

Detecção de Autoanticorpos Anti-MDA5 Utilizando Células HeLa e Imunocitoquímica com Microscopia de Luz

Descrevemos uma plataforma de imunoensaio recentemente desenvolvida com base nos princípios da biologia sintética livre de células e na técnica de dot-blot para detecção personalizável da resposta de anticorpos em soros humanos e animais.

Cell-free Dot Blot como uma plataforma de imunoensaio prática e adaptável para a detecção da resposta de anticorpos em soros humanos e animais

Aprenda um ensaio de imunofluorescência baseado em células para detectar anticorpos contra o receptor NMDA no sangue, utilizando células HEK293. Este método simples auxilia no diagnóstico de encefalite autoimune.

Um ensaio simples baseada em célula imunofluorescência para detectar anticorpos contra o Receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) no sangue (Vídeo) | JoVE Journal

Um ensaio simples baseada em célula imunofluorescência para detectar anticorpos contra o Receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) no sangue

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