Um ensaio simples baseada em célula imunofluorescência para detectar anticorpos contra o Receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) no sangue

O objetivo geral deste ensaio é detectar autoanticorpos contra o receptor NMDA no sangue de pacientes com suspeita de encefalite autoimune. A medida ajuda a responder às questões-chave no diagnóstico diferencial de pacientes com sintomas neuropsiquiátricos agudos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é uma medida de triagem simples e confiável.

Comece este procedimento preparando placas de cultura revestidas com gelatina. Alíquota de 200 microlitros de uma solução de gelatina a 2% para cada poço de uma placa de cultura de 48 poços e incube a placa a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Após 30 minutos, aspire a solução de gelatina dos poços.

Semear em cada poço 5 vezes 10 para as 4ª células HEK293 em 200 microlitros de meio de cultura celular, contendo 10%FBS. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada fornecida com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, substitua o meio de cultura gasto em cada poço por 200 microlitros de meio de cultura fresco, contendo 10% de FBS.

Aumentando de acordo com o número total de poços no experimento, prepare a solução A misturando o plasmídeo NR1-GFP com o meio de cultura. Preparar a solução B misturando o reagente de transfecção com meio de cultura. Prepare a solução C misturando a solução A e a solução B e incubando a mistura à temperatura ambiente por 20 a 30 minutos.

Em seguida, alíquota de 40 microlitros de solução C para cada poço contendo as células HEK293. Gire a placa suavemente e incube a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada fornecida com 5% de dióxido de carbono durante a noite. Verifique a expressão da proteína recombinante NR1-GFP nas células hospedeiras sob um microscópio fluorescente com ampliação de 40 a 200 vezes, antes de prosseguir para o ensaio de imunofluorescência baseado em células.

Para iniciar este ensaio, primeiro aspire o meio gasto dos poços da placa de cultura e, em seguida, lave cada poço com 200 microlitros de PBS três vezes. Adicione 200 microlitros de solução de paraformaldeído a 4% em cada poço e incube a placa em temperatura ambiente por 15 minutos. Aspire a solução de paraformaldeído dos poços e lave cada poço com 200 microlitros de PBS três vezes.

Em seguida, adicione 200 microlitros de leite desnatado a 10% em solução PBST a cada poço e incube a placa em temperatura ambiente com agitação suave por uma hora. Aspire o leite desnatado a 10% em solução de PBST dos poços e lave os poços com 200 microlitros de PBST uma vez. Incubar os alvéolos com plasma diluído de um a 100 em PBST como anticorpo primário com agitação suave à temperatura ambiente durante uma hora.

Após uma hora, aspire o plasma diluído dos poços e lave cada poço com 200 microlitros de PBST três vezes. Para cada poço, adicione 200 microlitros de IgG anti-humana de cabra, conjugado com Alexa Fluor 594 e incube a placa de cultura em temperatura ambiente com agitação suave por uma hora. Em seguida, aspire a IgG anti-humana de cabra conjugada com a solução Alexa Fluor 594 e lave cada poço com 200 microlitros de PBST três vezes.

Após a terceira lavagem do PBST, adicione 100 microlitros de solução de glicerol, contendo DAPI, a cada poço. Observe e visualize as células sob um microscópio fluorescente usando o filtro correto para cada corante e uma ocular de 10 vezes com objetivas de quatro, 10 vezes e 20 vezes. Essas imagens representativas tiradas 24 a 30 horas após a transfecção mostram células HEK293 que expressam NR1-GFP.

Aproximadamente 30% das células tinham o sinal verde sob o microscópio fluorescente. Nas imagens Alexa Fluor 594 correspondentes, o sinal vermelho no painel B indica a ligação dos autoanticorpos do receptor anti-NMDA ao NR1 expresso nas células HEK293. O sinal vermelho fraco no painel E indica o ruído de fundo das imagens do Alexa Fluor 594.

As células que expressam NR1-GFP foram usadas para rastrear a presença de autoanticorpos anti-receptor NMDA em uma amostra de plasma humano. Nessas imagens mescladas, a cor amarela indica colocalização dos autoanticorpos NR1-GFP e anti-receptor NMDA. As setas indicam exemplos de células com colocalização proeminente.

Uma amostra de plasma que mostre uma sobreposição superior a 30% dos sinais verde e vermelho será interpretada como positiva neste caso. Na imagem mesclada do controle negativo, há pouca sobreposição de sinais verdes e vermelhos, o que confirma a ligação específica dos autoanticorpos anti-receptor NMDA ao NR1-GFP no ensaio. Uma vez dominada, a técnica pode ser feita em quatro horas se for executada corretamente.

Ao tentar essa técnica, é importante lembrar que é apenas uma medida de triagem. Após esses procedimentos, outras medidas, como análise de western blot e análise baseada em tecido, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como especificidade de casos positivos. Após o desenvolvimento, a técnica abre caminho para pesquisadores no campo da psiquiatria explorarem o diagnóstico diferencial de pacientes com emergência aguda de saúde mental.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o ensaio para rastrear autoanticorpos contra o receptor NMDA no sangue.