Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

O objetivo do presente protocolo é medir o efeito da glicose mediada por alterações de respiração mitocondrial na presença de compostos naturais intactos 832/13 beta células usando respirometria de alta resolução.

O objetivo geral desta abordagem é avaliar diretamente a função respiratória das células beta pancreáticas, sob condições estimulatórias de insulina. Isso também pode ser usado para observar o efeito de diferentes compostos na função respiratória das células beta. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia das células beta pancreáticas, como se um determinado composto afeta a função das células beta pancreáticas por meio de mudanças na respiração.

A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para avaliar diretamente a função respiratória em células beta pancreáticas, sob condições basais e estimulatórias de insulina. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de preparação da célula e uso da máquina são difíceis de aprender, devido à precisão necessária na preparação da célula e na medição da respiração. Para começar, cultive células beta 832/13 derivadas de INS-1 em RPMI 1640 suplementado.

Remova as células de um frasco T75, adicionando dois mililitros de 0,25% de tripsina e incubando a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, neutralize a tripsina adicionando oito mililitros de mídia RPMI 1640 completa. Dilua 100 microlitros do volume celular em 900 microlitros de PBS e conte as células usando um hemocitômetro.

Em seguida, coloque as células em uma densidade de um milhão de células por mililitro, em um prato de 10 centímetros. Cultive as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de CO2, antes de iniciar os experimentos de respiração. Troque o meio 24 horas após o plaqueamento e cultura das células 832/13 em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Em seguida, trate as células com controle de veículo ou derivado de cacau, monômero de epicatequina, para uma concentração final de 100 nanomolares. Siga a adição do tratamento com cultura por mais 24 horas em uma incubadora umidificada, a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Em seguida, lave as células em tampão de ensaio de secreção de glicose 1x, ou SAB, por cinco minutos.

Aspire o tampão e incube as células em 1x SAB de baixa glicose por três horas, trocando o tampão a cada hora. Após a incubação, remova as células do prato com um mililitro de 0,25% de tripsina. Combine as células em tripsina do prato tratado com controle do veículo, com quatro mililitros de SAB em um tubo cônico de 15 mililitros.

Da mesma forma, combine o prato tratado com o composto de interesse, com um tampão. Dilua 100 microlitros do volume celular em 900 microlitros de PBS e conte as células usando um hemocitômetro. Dilua 100 microlitros do volume celular em 900 microlitros de PBS e conte as células usando um hemocitômetro.

Os dados demonstram que uma concentração de um milhão de células por mililitro é a mais eficaz. Depois de preparar o respirômetro de alta resolução conforme detalhado no protocolo de texto, adicione 2,4 mililitros de tampão SAB de baixa glicose 1x a cada câmara do oxígrafo. Agite o tampão continuamente usando barras de agitação magnéticas na câmara a 750 rpm e 37 graus Celsius, com um intervalo de gravação de dados de 2.0 segundos.

Para fazer isso, selecione o botão F7 e abra a guia rotulada, sistemas. Empurre os êmbolos totalmente para dentro e retraia-os para a configuração de aeração da chave. Deixe a máquina se equilibrar por no mínimo uma hora até que o fluxo de oxigênio estável seja obtido.

Em seguida, defina a máquina em 37 graus Celsius durante o experimento. Pressione o botão F7 e abra a guia rotulada como Oxigênio O2, para definir a tensão de polarização para 800 milivolts com um ganho de dois. Equilibre a concentração de oxigênio do tampão SAB por pelo menos 30 minutos, até que a mudança na concentração de oxigênio seja estável.

Em seguida, selecione uma região onde a mudança na concentração de oxigênio seja estável para estabelecer a medição em segundo plano da mudança na concentração de oxigênio, pressionando a tecla shift, clicando com o botão esquerdo do mouse e arrastando o mouse pela região selecionada. Clique na letra associada à região selecionada e altere-a para R1 para cada traço correspondente a cada uma das duas câmaras. Clique duas vezes na caixa de calibração de O2 nos cantos inferior esquerdo e direito da tela.

Clique no botão Selecionar marca para a calibração do ar como R1 e, em seguida, selecione calibrar e copiar para a área de transferência para ambas as câmaras. Em seguida, carregue 2,4 mililitros de amostra em cada câmara, carregando uma câmara com as células tratadas com o veículo de controle e uma câmara com células tratadas com composto em 1x SAB com baixa glicose. Empurrar o êmbolo até ao fim e aspirar o volume residual.

Agite as células continuamente ao longo do experimento a 750 rpm e 37 graus Celsius para todas as etapas subsequentes. Faça uma marca clicando em F4 e rotulando a marca como células quando as amostras forem carregadas. Meça as amostras por 30 minutos.

Após a estabilização do sinal, selecione uma região da mudança na concentração de oxigênio correspondente às condições de baixa glicose. Em seguida, adicione 12,5 microlitros de uma solução de glicose estéril a 45% em cada câmara através da porta de carregamento de titânio usando uma seringa. Faça uma marca rotulada glicose, quando o tratamento for adicionado.

Deixe o sinal estabilizar e registre a respiração celular até que um fluxo estável de oxigênio seja alcançado. Neste ponto, selecione a região da mudança na concentração de oxigênio para representar a leitura de glicose de 16,7 milimolares, que corresponde às condições estimulatórias. Depois que a estabilização do sinal for alcançada, adicione um microlitro de cinco milimolares de oligomicina A em cada câmara através da porta de carregamento.

Faça uma marca rotulada, OligoA, quando o tratamento for adicionado. Deixe o sinal estabilizar e registre a respiração celular até que um fluxo estável de oxigênio seja alcançado. Assim que o fluxo de oxigênio estável for alcançado, selecione esta área da curva.

A oligomicina A inibe a ATP sintase e, portanto, o único fluxo de oxigênio que ocorre é por vazamento de elétrons e não por fosforilação oxidativa. Em seguida, adicione um FCCP milimolar em incrementos de um microlitro até que uma frequência respiratória máxima seja estabelecida. Isso representa respiração desacoplada máxima.

Entre três e quatro microlitros de FCCP é suficiente para induzir a respiração desacoplada máxima de células beta 832/13 derivadas de INS-1. Faça uma marca rotulada, FCCP quando o tratamento for adicionado. Deixe o sinal estabilizar e registre a respiração celular até que um fluxo estável de oxigênio seja alcançado.

Em seguida, selecione essa área da curva. O FCCP é um agente desacoplador, permitindo a medição da respiração desacoplada. Depois que a estabilização do sinal for alcançada, adicione um microlitro de cinco milimolares Antimicina A em cada câmara através da porta de carregamento.

Faça uma marca rotulada, AntiA, quando o tratamento for adicionado e repita o procedimento de seleção da curva. Insira o número de células por mililitro usado no ensaio, pressionando o botão F3 do programa de análise do respirômetro. Altere as unidades para células por mililitro, insira a concentração celular e altere o meio para SAB.

Selecione as leituras de fundo para normalizar os dados selecionando e inserindo no formulário de calibração de oxigênio. Faça seleções de leituras de glicose 2.5 milimolar, glicose 16.7 milimolar, oligomicina A, FCCP e antimicina A. Dentro do programa de análise do respirômetro, insira a concentração de proteína e selecione os valores médios apropriados para cada tratamento durante a medição da respiração. Em seguida, clique em F2 e clique na função copiar para a área de transferência.

Isso exporta os dados para uso em outros programas de análise. Use os valores negativos de inclinação de O2 para cálculos. Compile os dados para três a cinco execuções independentes de controles tratados com veículos e células tratadas com compostos naturais para determinar o efeito na respiração celular intacta de células beta 832/13 derivadas de INS-1.

As células beta 832/13 intactas derivadas do INS-1 demonstram um aumento induzido pela glicose na utilização de oxigênio. É fundamental que o número apropriado de células seja usado. Os resultados obtidos neste experimento demonstram que um milhão de células por mililitro é a quantidade ideal.

As células beta 832/13 derivadas do INS-1 tratadas com curcumina não apresentam alteração na respiração geral. Por outro lado, as células beta 832/13 derivadas do INS-1 tratadas com epicatequinas monoméricas de cacau aumentaram a respiração a 2,5 milimolares de glicose e 16,7 milimolares de glicose. O aumento da respiração também é observado durante o estado de vazamento, que é o estado respiratório basal não fosforilante, bem como a respiração do sistema de transporte de elétrons ou o estado ETS, que é a respiração máxima.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar diretamente a função respiratória das células beta pancreáticas sob condições estimulatórias de insulina. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de pré-tratar as células com tampão SAB de baixa glicose e obter contagens precisas de células para o ensaio.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em obter a quantidade certa de células para medições eficazes. Com muitas células, o sinal é difícil de avaliar e, com poucas, o sinal não é alto o suficiente para ser medido de forma consistente. As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de diabetes e qualquer condição afetada por alterações na função das células beta pancreáticas, porque a respiração mitocondrial é um componente crítico de como funciona a secreção de insulina.

Após este procedimento, outros métodos, como a secreção de insulina estimulada por glicose, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: qual é o efeito desses compostos na secreção de insulina? Embora esse método possa fornecer informações sobre a função das células beta, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como músculos, fígado, tecido adiposo e outras análises respiratórias mitocondriais.