Name: Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Aprenda a medir a função mitocondrial em células-beta pancreáticas intactas usando respirometria de alta resolução. Este método avalia os efeitos de compostos naturais sobre a respiração celular em condições estimuladoras de insulina.

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Os autores gostaria de agradecer os membros dos laboratórios Tessem e Hancock para assistente e discussão científica. Os autores agradecer Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) para fornecer a fração de monômero de cacau epicatequina derivada. Este estudo foi suportado por uma concessão da Fundação de educação e pesquisa-ação Diabetes de JST.

1. cultura de pilha
<ol><li>Cultura INS-1 derivado 832/13 células beta em RPMI 1640 suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina, 10 mM HEPES, glutamina de 2 mM, 1 mM piruvato de sódio e 0,05 mM 2-Mercaptoetanol9,10,11 ,12,13.</li>
	<li>Remova células 832/13 de um frasco de T75 usando 2 mL de tripsina 0,25%, incubar a 37 ° C por 10 min. neutralizar tripsina adicionando 8 mL de mídia completa de RPMI 1640.</li>
	<li>Contar as células usando um hemocytometer e diluir 100 µ l do volume de célula de etapa 1.2 em 900 µ l de PBS.</li>
	<li>Células de placa 832/13 em uma densidade de 2 x 106 células/mL em um 6 bem o prato.</li>
	<li>Cultura de células para 48 h numa incubadora umidificado a 37 ° C e 5% CO2 antes de iniciar os experimentos de respiração.</li>
</ol>2. preparação de células para respirometria de alta resolução
<ol><li>
Tratamento de 832/13 células com monômero de cacau epicatequina derivada.
	<ol>
<li>Cultura de células 832/13 para 24 h após chapeamento numa incubadora umidificado a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
		<li>Mudar de mídia 24 h após o chapeamento e tratar as células 832/13 com o controle do veículo (3 poços) ou 100 monômero de cacau nM (3 poços), seguido de cultura para um adicional 24h (total de 48 h) em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
		<li>Lavam-se células de 832/13 em 1 x baixa glicose secreção ensaio Buffer (SAB) para o buffer de aspirado de 5 min. e incube 832/13 células em 1x baixa glicose SAB para 3h, mudando 1 x baixa glicose SAB cada hora.<ol>
<li>Fazer 10 x SAB com 33,32 g de NaCl, 1,73 g de KCl, 0,82 g de KH2PO4, 0,7 g de MgSO4 e adicione H2O, até um volume final de 500 mL. Filtro estéril a solução final.</li>
			<li>Faça 1 x baixa glicose SAB com 10 mL de 10 x SAB, 100 µ l de 45% de glicose, 2 mL de 1m HEPES, 1ml de 0,25 M CaCl2, 0,57 mL de solução de BSA de 35%, 0,21 g de NaHCO3 e adicione H2O para um volume final de 100 mL. Filtro estéril a solução final.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tratamento de 832/13 células com curcumina.
	<ol>
<li>Cultura 832/13 células para 48 h após chapeamento numa incubadora umidificado a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
		<li>Lavar as células 832/13 1 x baixa glicose SAB para o buffer de aspirado de 5 min. e incube 832/13 células em 1x baixa glicose SAB para 3h, mudando 1 x baixa glicose SAB a cada hora.</li>
		<li>Após 2,5 h de incubação h 3 em 1 x baixa glicose SAB, Aspire o tampão e incubar as células em 1 x baixa glicose SAB com o controle do veículo ou 40 µM curcumina por 30 min. Após incubação, Aspire o buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colheita de células com tripsina para respirometria de alta resolução
	<ol>
<li>Após a incubação de 3h em 1 x baixa glicose SAB, remova as células da placa com 250 µ l de tripsina 0,25% por poço.</li>
		<li>Combine as células em tripsina de 3 poços tratados com o controle do veículo ou compostos de interesse com 4 mL de SAB em um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Contar as células usando um hemocytometer e diluir 100 µ l do volume de célula de etapa 2.3.2 em 900 µ l de PBS.</li>
		<li>Dilua o número adequado de células em 1 x baixa glicose SAB fazer 3 mL na concentração adequada para cada câmara. Os dados demonstram que uma concentração de 1 x 106 células/mL é o mais eficaz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colheita de células com dissociação mecânica para respirometria de alta resolução
	<ol>
<li>Após a incubação de 3h em 1 x baixa glicose SAB, adicione 1 mL de 1x baixa glicose SAB a cada bem e delicadamente explodir células no prato com dissociação mecânica pipetando com uma ponta de pipeta 1000 µ l.</li>
		<li>Combine as células de 3 poços tratados com o controle do veículo ou compostos de interesse em um total de 3 mL SAB em um tubo cônico de 15 mL para a respiração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. High-Resolution respirometria
<ol><li>Preparação da respirometer de alta resolução.
	<ol>
<li>Ligue o respirometer de alta resolução e conectar para a área de trabalho com o lançamento do programa de análise de respirometer.</li>
		<li>Aspire o etanol a 70% de ambas as câmaras. Aproveite estas câmaras em etanol a 70% por um período mínimo de 45 min.</li>
		<li>Lave as câmaras duas vezes com etanol 70%, por aspiração após cada etapa.</li>
		<li>Lave as câmaras três vezes com o ddH2O, por aspiração após cada etapa.</li>
		<li>Lave os êmbolos de câmara no ddH2O. Isto limpa fora etanol residual dos êmbolos e para o porto de titânio.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibração de sensores de oxigênio polarographic.
	<ol>
<li>Adicionar a 2,4 mL de tampão de baixa glicose SAB 1x a cada câmara oxygraph, agitando o buffer continuamente usando barras magnéticas celeuma na câmara a 750 rpm e 37 ° C, com um intervalo de gravação de dados no 2.0 s apertando a tecla F7 e abrindo a guia rotulada "Sistemas". Empurre os pistões em todo o caminho e então retorne à configuração da chave de aeração. Deixe a máquina equilibrar durante um período mínimo de 1 hora até à obtenção de fluxo de oxigênio estável.</li>
		<li>Defina a máquina a 37 ° C para a duração do experimento. Definir a tensão de polarização de 800 mV, com um ganho de 2 apertando a tecla F7 e abrindo na guia rotulada "Oxigênio, O2". Equilibrar a concentração de oxigênio do buffer SAB pelo menos 30 min, enquanto a mudança na concentração de oxigênio é estável (menos de 2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>Após a estabilização da concentração de oxigênio, selecione uma região onde a alteração da concentração de oxigênio é estável para estabelecer a medida do fundo da mudança na concentração de oxigênio.<ol>
<li>Selecione uma região por pressionando a tecla shift, o botão esquerdo do mouse e arrastar o mouse na região selecionada. Clique sobre a letra associada a região selecionada e mude para "R1" para cada traço, correspondente com cada uma das duas câmaras.</li>
			<li>Clique duas vezes na caixa "O2 calibração" no canto inferior esquerdo e direito cantos da tela, clique no botão "selecionar marca" para a "calibração de ar" como R1 e selecione "calibrar e copiar para o clipboard" para ambas as câmaras.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação da respiração das células beta de 832/13 preparado em etapas 2.1.5 ou 2.2.5.
	<ol>
<li>Carga de 2,4 mL da amostra em cada câmara (uma câmara com controle veículo Tratado células, uma câmara com células tratadas compostas) em 1 x baixa glicose sab Mantêm a 0,5 mL de amostra de células para quantificação da proteína, ensaio BCA (ácido Bicinchoninic) se usando a abordagem de dissociação mecânica (congelar a-20 ° C para medição mais tarde).<ol>
<li>Empurre o êmbolo todo o caminho e aspire o volume residual. Misture as células continuamente ao longo do experimento a 750 rpm e 37 ° C, durante todas as etapas subsequentes. Faça uma marca clicando em F4 e rotular como "células", quando as amostras são carregadas.</li>
			<li>Medir as amostras por 30 min. Após a estabilização do sinal, selecione uma região da mudança na concentração de oxigênio correspondente às condições de baixos de glicose (glicose 2,5 mM), conforme descrito em 3.2.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Após estabilização do sinal é atingida, adicione 12,5 µ l de uma solução de glicose estéril de 45% (concentração final de 16,7 mM) em cada câmara através do titânio Porto utilizando uma seringa de carregamento. Faça que uma marca medido "Glicose", como descrito em 3.3.1, quando o tratamento é adicionado. Deixe sinal estabilizar e gravar a respiração celular, até que um fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Selecione esta região da mudança na concentração de oxigênio, conforme descrito em 3.2.3. Esta é a leitura de glicose 16,7 mM e corresponde com condições estimulatórios7.</li>
		<li>Após estabilização do sinal é atingida, adicione 1 µ l de oligomicina 5mM (2,5 µM concentracao final) em cada câmara através do porto de carregamento. Faça que uma marca medido "OligoA", como descrito em 3.3.1, quando o tratamento é adicionado. Deixe sinal estabilizar e gravar a respiração celular, até que um fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Selecione esta área da curva, conforme descrito em 3.2.3. Oligomycin A inibe a ATP sintase e, portanto, a única ocorrendo fluxo do oxigênio é através de vazamento de elétrons e não a fosforilação oxidativa7.</li>
		<li>Após estabilização do sinal é atingida mais 1 mM Compararia em incrementos de 1 µ l até uma taxa de respiração máxima é estabelecida. Isso representa a respiração desacoplada máxima. Entre 3-4 µ l Compararia é suficiente (1,5-2,0 µM concentração final) para induzir a respiração desacoplada máxima das células INS-1 832/13. Faça uma marca rotulada "FCCP", conforme descrito em 3.3.1, quando o tratamento é adicionado. Deixe sinal estabilizar e gravar a respiração celular, até que um fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Selecione esta área da curva, conforme descrito em 3.2.3. Compararia é um agente de desacoplamento. Isso nos permite medir a respiração desacopladas7.</li>
		<li>Após estabilização do sinal é atingida adicione 1 µ l de 5mm Antimycin A (concentração final de 2,5 µM) em cada câmara através do porto de carregamento. Faça uma marca rotulada "AntiA" conforme descrito em 3.3.1, quando o tratamento é adicionado. Deixe sinal estabilizar e gravar a respiração celular, até que um fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Selecione esta área da curva, conforme descrito em 3.2.3. Nota: Antimycin A vincula citocromo C redutase, inibe a oxidação de ubiquinona e bloqueia a respiração de todos. Isso nos permite parar completamente a respiração7.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 células beta para normalização de concentração e respiração de proteína de medição.
	<ol>
<li>Usando a 0,5 mL da amostra retida no carregamento, amostra de proteína de medida usando o BCA método13.</li>
		<li>Execute cada amostra em triplicata, sem diluição, seguindo as instruções do fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 célula beta cálculos de respiração das células trypsinized.<ol>
<li>Digite o número de células por mL uso no ensaio empurrando a tecla F3 do programa de análise de respirometer. Alterar as unidades de células/mL, insira a concentração celular e alterar médio para sab.</li>
		<li>Selecione leituras de fundo para normalizar os dados selecionando e entrando O2 forma de calibração conforme descrito em 3.2.3.</li>
		<li>Faça seleções de leituras de 2,5 mM de glicose, 16,7 mM de glicose, Oligomycin A, FCCP e A Antimycin conforme descrito em 3.3.1.</li>
		<li>Dentro do programa de análise de respirometer, exporte as leituras para cada câmara após entrar a concentração de proteína e selecionando valores médios apropriados para cada tratamento durante a medição da respiração. Isto é feito clicando em F2 e, em seguida, empurrando o "copiar para a função de transferência". Isso exporta os dados para uso em outros programas de análise. Use os valores de "Declive negativo2" para cálculos.</li>
		<li>Compilação de dados para 3-5 é executado independente do veículo tratados controles e naturais compostos de células tratadas para determinar o efeito na intacta respiração celular de células beta de INS-1 832/13.</li>
	</ol></li>
	<li>cálculos de respiração de célula beta de 832/13 de dissociado mecanicamente as células.<ol>
<li>Inserir os cálculos de proteína de ensaio BCA empurrando a tecla F3 do programa de análise de respirometer. Alterar as unidades de mg, inserir a concentração do BCA e alterar médio para sab.</li>
		<li>Selecione leituras de fundo para normalizar os dados selecionando e entrando O2 forma de calibração conforme descrito em 3.2.3.</li>
		<li>Faça seleções de leituras de 2,5 mM de glicose, 16,7 mM de glicose, Oligomycin A, FCCP e A Antimycin conforme descrito em 3.3.1.</li>
		<li>Dentro do programa de análise de respirometer, exporte as leituras para cada câmara após entrar a concentração de proteína e selecionando valores médios apropriados para cada tratamento durante a medição da respiração. Isto é feito clicando em F2 e, em seguida, empurrando o "copiar para a função de transferência". Isso exporta os dados para uso em outros programas de análise. Use os valores de "Declive negativo2" para cálculos.</li>
		<li>Compilação de dados para 3-5 é executado independente do veículo tratados controles e naturais compostos de células tratadas para determinar o efeito na intacta respiração celular de células beta de INS-1 832/13.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O objectivo do presente protocolo é usar respirometria de alta resolução para medir as taxas respiratórias em células-beta do pâncreas intactas. Este método permite a medição da resposta célula beta à glicose aumento níveis. O protocolo também permite o tratamento prévio com vários compostos, como demonstrado no presente protocolo com o natural monomérico epicatequina ou curcumina4,5. Tratamento com vários outros compostos pode se...

O objetivo principal da célula beta pancreática é manter o sistema normoglycemia, através da secreção de insulina glicose-estimulado. As células beta sentir mudanças fisiológicas em circulação glicose em grande parte devido a baixa afinidade, transportador de glicose alta capacidade GLUT2 (Glucose Transporter 2, Km 16,7 mM)1. Como aumento dos níveis de glicose circulatório, este transporte de baixa afinidade de alta capacidade facilita um aumento proporcional de glicose intracelular dentro da célula beta. Glicose é metabolizada através da glicólise, o ciclo de TCA (ciclo do ácido cítrico) e respiração mitocondrial, resultando em elevados níveis celulares de ATP (adenosina trifosfato). A elevada concentração de ATP bloqueia os canais de K+ sensíveis ATP, resultando em despolarização da membrana. Despolarização da membrana provoca a abertura de canais de tensão Ca2 + e subsequente liberação de vesículas limite de grânulos de insulina2. Disfunção da célula beta é uma marca registrada de Diabetes tipo 2 (T2D) e resulta na secreção de insulina diminuída e mal controlado e, finalmente, a morte de células beta3. Mecanismos que mantêm ou melhorar a função da célula beta podem ser usados como um tratamento para T2D.
Estudos têm demonstrado os efeitos benéficos de ocorrência natural compostos à base de plantas em células pancreáticas do beta4. Estes compostos podem ter seu efeito através da crescente proliferação de células beta, sobrevivência ou a secreção de insulina glicose-estimulada. Por exemplo, estudos recentes têm demonstrado que epicatequina monomérica aumenta a secreção de insulina glicose-estimulada, aumentando a respiração mitocondrial e ATP celular a aumentar os níveis de5. Portanto, compreender como esses compostos podem aumentar funcional de células beta em massa é importante para alavancar estes compostos como terapêutica potencial.
Respiração celular pode ser medida através de um número de ferramentas. Uso de um respirometer de alta resolução permite a titulação de moduladores químicos para uma população de célula intacta ou permeabilized6. Esta ferramenta permite a adição de vários compostos, em diferentes concentrações, dando assim uma grande variedade de informações.
Dada a conexão íntima entre o metabolismo da glicose e função da célula beta, medições de respiração celular são críticas. Medições da respiração celular podem ser feitas usando permeabilized ou intactas as células beta, com cada um que tem seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens de7,8. Enquanto permeabilização de células beta permite medir diferentes aspectos da cadeia de transporte de elétrons, fá-lo sem cumprimentos para o mecanismo de indução de respiração na célula beta, absorção de glicose e metabolismo. Portanto, o uso da respiração celular de beta unpermeabilized é uma técnica muito útil para determinar a resposta de células beta para vários níveis de glicose, usando o consumo de oxigênio como a leitura.
O objetivo desta técnica é medir o consumo de oxigênio em intacta INS-1 derivado de células beta de 832/13. Esta técnica nos permite determinar a resposta das células beta às condições unstimulatory glicose (glicose 2,5 mM) bem como condições estimulatórios glicose (glicose 16,7 mM). Enquanto as células unpermeabilized não nos permitem testar individualmente complexo I, II ou III do elétron da cadeia de transporte, a técnica que permite medições lidando com respiração de inibição (A oligomicina), desacoplada complexa IV (FCCP-carbonila cianeto- 4- phenylhydrazone (trifluorometoxi)) e completamente inibida a respiração (A Antimycin). Este estudo demonstra a eficácia da respiração em intactas unpermeabilized células-beta do pâncreas, bem como o efeito de dois compostos naturais, epicatequina monomérica e curcumina, na respiração celular beta de medição.

<table><tbody><tr><td>Núcleo O2k: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Instrumento para respirometria de alta resolução</td></tr><tr><td>Programa DatLab 6</td><td>Oroboros Instruments</td><td>27141-01</td><td>Programa de computador para análise de respirometria de alta resolução</td></tr><tr><td>INS-1 832/13 linha celular Duke</td><td>University Medical Center</td><td>NENHUM</td><td>Linha de células beta, presente do Dr. Christopher Newgard</td></tr><tr><td>Curcumina</td><td>Sigma</td><td>C7727</td><td>Pré-tratamento de células beta</td></tr><tr><td>Monômero de epicatequina de cacau</td><td>Virginia Polytechnic Institute and State University</td><td>NENHUM</td><td>Pré-tratamento de células beta, presente do Dr. Andrew Neilson</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>832/13 mídia de células beta</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>832/13 componente de mídia de célula beta</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td>832/13 componente de mídia de célula beta</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3662</td><td>832/13 componente de mídia de célula beta / 1x SAB Buffer</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Caisson</td><td>GLL01</td><td>832/13 componente de mídia de célula beta</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>832/13 componente</td></tr> <tr>de mídia de célula beta<td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>832/13 componente de mídia de célula beta</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td>Componente do tampão 10x SAB</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Componente do tampão 10x SAB</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Componente do tampão 10x SAB</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Componente de 10x tampão SAB</td></tr><tr><td>D-(+) Solução de Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>Componente de 1x tampão SAB, produto químico para ensaio de respiração</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Componente de 1x tampão SAB</td></tr><tr><td>35% BSA Solução</td><td>Sigma</td><td>A7979</td><td>Componente de 1x tampão SAB</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Componente de 1x tampão SAB</td></tr><tr><td>200 prova de etanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Lavagem Oxígrafo O2k Câmaras</td></tr><tr><td>Oligomicina A</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Produtos químicos para ensaio de respiração</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Produtos químicos para ensaio de respiração</td></tr><tr><td>Anitmicina A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Produtos químicos para ensaio de respiração</td></tr><tr><td>Kit de proteína BCA</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td>Para a determinação da concentração de proteínas</td></tr></tbody></table>

respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-beta intacto na presença de compostos naturais

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Respirometria de alta resolução permite a medição do consumo de oxigênio de mitocôndrias isoladas, células e tecidos. As células beta desempenham um papel fundamental no corpo por controlar níveis de glicose no sangue através da secreção de insulina em resposta a concentrações elevadas de glicose. A secreção de insulina é controlada pelo metabolismo da glicose e respiração mitocondrial. Portanto, medir a respiração celular intacta de beta é essencial para ser capaz de melhorar a função da célula beta como um tratamento para o diabetes. Usar intacta 832/13 INS-1 derivado de células beta, podemos medir o efeito do aumento da concentração de glicose na respiração celular. Este protocolo permite-nos medir a respiração celular beta na presença ou ausência de vários compostos, permitindo que se determine o efeito de dado compostos na respiração celular intacta. Aqui vamos demonstrar o efeito de dois compostos naturais, epicatequina monomérica e curcumina, na célula beta respiração sob a presença de condições de glicose elevada (16,7 mM) ou baixo (2,5 mM). Esta técnica pode ser usada para determinar o efeito de vários compostos na respiração celular intacta de beta na presença de diferentes concentrações de glicose.

As células beta INS-1 832/13 que são preparadas e colhidas conforme descrito no protocolo irá demonstrar a modulação no consumo de oxigênio baseado em várias intervenções químicas (figura 1A). Será observado um aumento na respiração quando a concentração de glicose é aumentada para 16,7 mM de glicose (figura 1B). Respiração diminuirá quando as células intactas são tratadas com o Oligomycin A. Esta respiração é conhecida como vazamento, que é definido como o esta...

O objetivo do presente protocolo é medir o efeito da glicose mediada por alterações de respiração mitocondrial na presença de compostos naturais intactos 832/13 beta células usando respirometria de alta resolução.

Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

O objetivo geral desta abordagem é avaliar diretamente a função respiratória das células beta pancreáticas, sob condições estimulatórias de insulina. Isso também pode ser usado para observar o efeito de diferentes compostos na função respiratória das células beta. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia das células beta pancreáticas, como se um determinado composto afeta a função das células beta pancreáticas por meio de mudanças na respiração.A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para avaliar diretamente a função respiratória em células beta pancreáticas, sob condições basais e estimulatórias de insulina. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de preparação da célula e uso da máquina são difíceis de aprender, devido à precisão necessária na preparação da célula e na medição da respiração. Para começar, cultive células beta 832/13 derivadas de INS-1 em RPMI 1640 suplementado.Remova as células de um frasco T75, adicionando dois mililitros de 0,25% de tripsina e incubando a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, neutralize a tripsina adicionando oito mililitros de mídia RPMI 1640 completa. Dilua 100 microlitros do volume celular em 900 microlitros de PBS e conte as células usando um hemocitômetro.Em seguida, coloque as células em uma densidade de um milhão de células por mililitro, em um prato de 10 centímetros. Cultive as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de CO2, antes de iniciar os experimentos de respiração. Troque o meio 24 horas após o plaqueamento e cultura das células 832/13 em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de CO2.Em seguida, trate as células com controle de veículo ou derivado de cacau, monômero de epicatequina, para uma concentração final de 100 nanomolares. Siga a adição do tratamento com cultura por mais 24 horas em uma incubadora umidificada, a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Em seguida, lave as células em tampão de ensaio de secreção de glicose 1x, ou SAB, por cinco minutos.Aspire o tampão e incube as células em 1x SAB de baixa glicose por três horas, trocando o tampão a cada hora. Após a incubação, remova as células do prato com um mililitro de 0,25% de tripsina. Combine as células em tripsina do prato tratado com controle do veículo, com quatro mililitros de SAB em um tubo cônico de 15 mililitros.Da mesma forma, combine o prato tratado com o composto de interesse, com um tampão. Dilua 100 microlitros do volume celular em 900 microlitros de PBS e conte as células usando um hemocitômetro. Dilua 100 microlitros do volume celular em 900 microlitros de PBS e conte as células usando um hemocitômetro.Os dados demonstram que uma concentração de um milhão de células por mililitro é a mais eficaz. Depois de preparar o respirômetro de alta resolução conforme detalhado no protocolo de texto, adicione 2,4 mililitros de tampão SAB de baixa glicose 1x a cada câmara do oxígrafo. Agite o tampão continuamente usando barras de agitação magnéticas na câmara a 750 rpm e 37 graus Celsius, com um intervalo de gravação de dados de 2.0 segundos.Para fazer isso, selecione o botão F7 e abra a guia rotulada, sistemas. Empurre os êmbolos totalmente para dentro e retraia-os para a configuração de aeração da chave. Deixe a máquina se equilibrar por no mínimo uma hora até que o fluxo de oxigênio estável seja obtido.Em seguida, defina a máquina em 37 graus Celsius durante o experimento. Pressione o botão F7 e abra a guia rotulada como Oxigênio O2, para definir a tensão de polarização para 800 milivolts com um ganho de dois. Equilibre a concentração de oxigênio do tampão SAB por pelo menos 30 minutos, até que a mudança na concentração de oxigênio seja estável.Em seguida, selecione uma região onde a mudança na concentração de oxigênio seja estável para estabelecer a medição em segundo plano da mudança na concentração de oxigênio, pressionando a tecla shift, clicando com o botão esquerdo do mouse e arrastando o mouse pela região selecionada. Clique na letra associada à região selecionada e altere-a para R1 para cada traço correspondente a cada uma das duas câmaras. Clique duas vezes na caixa de calibração de O2 nos cantos inferior esquerdo e direito da tela.Clique no botão Selecionar marca para a calibração do ar como R1 e, em seguida, selecione calibrar e copiar para a área de transferência para ambas as câmaras. Em seguida, carregue 2,4 mililitros de amostra em cada câmara, carregando uma câmara com as células tratadas com o veículo de controle e uma câmara com células tratadas com composto em 1x SAB com baixa glicose. Empurrar o êmbolo até ao fim e aspirar o volume residual.Agite as células continuamente ao longo do experimento a 750 rpm e 37 graus Celsius para todas as etapas subsequentes. Faça uma marca clicando em F4 e rotulando a marca como células quando as amostras forem carregadas. Meça as amostras por 30 minutos.Após a estabilização do sinal, selecione uma região da mudança na concentração de oxigênio correspondente às condições de baixa glicose. Em seguida, adicione 12,5 microlitros de uma solução de glicose estéril a 45% em cada câmara através da porta de carregamento de titânio usando uma seringa. Faça uma marca rotulada glicose, quando o tratamento for adicionado.Deixe o sinal estabilizar e registre a respiração celular até que um fluxo estável de oxigênio seja alcançado. Neste ponto, selecione a região da mudança na concentração de oxigênio para representar a leitura de glicose de 16,7 milimolares, que corresponde às condições estimulatórias. Depois que a estabilização do sinal for alcançada, adicione um microlitro de cinco milimolares de oligomicina A em cada câmara através da porta de carregamento.Faça uma marca rotulada, OligoA, quando o tratamento for adicionado. Deixe o sinal estabilizar e registre a respiração celular até que um fluxo estável de oxigênio seja alcançado. Assim que o fluxo de oxigênio estável for alcançado, selecione esta área da curva.A oligomicina A inibe a ATP sintase e, portanto, o único fluxo de oxigênio que ocorre é por vazamento de elétrons e não por fosforilação oxidativa. Em seguida, adicione um FCCP milimolar em incrementos de um microlitro até que uma frequência respiratória máxima seja estabelecida. Isso representa respiração desacoplada máxima.Entre três e quatro microlitros de FCCP é suficiente para induzir a respiração desacoplada máxima de células beta 832/13 derivadas de INS-1. Faça uma marca rotulada, FCCP quando o tratamento for adicionado. Deixe o sinal estabilizar e registre a respiração celular até que um fluxo estável de oxigênio seja alcançado.Em seguida, selecione essa área da curva. O FCCP é um agente desacoplador, permitindo a medição da respiração desacoplada. Depois que a estabilização do sinal for alcançada, adicione um microlitro de cinco milimolares Antimicina A em cada câmara através da porta de carregamento.Faça uma marca rotulada, AntiA, quando o tratamento for adicionado e repita o procedimento de seleção da curva. Insira o número de células por mililitro usado no ensaio, pressionando o botão F3 do programa de análise do respirômetro. Altere as unidades para células por mililitro, insira a concentração celular e altere o meio para SAB.Selecione as leituras de fundo para normalizar os dados selecionando e inserindo no formulário de calibração de oxigênio. Faça seleções de leituras de glicose 2.5 milimolar, glicose 16.7 milimolar, oligomicina A, FCCP e antimicina A. Dentro do programa de análise do respirômetro, insira a concentração de proteína e selecione os valores médios apropriados para cada tratamento durante a medição da respiração. Em seguida, clique em F2 e clique na função copiar para a área de transferência.Isso exporta os dados para uso em outros programas de análise. Use os valores negativos de inclinação de O2 para cálculos. Compile os dados para três a cinco execuções independentes de controles tratados com veículos e células tratadas com compostos naturais para determinar o efeito na respiração celular intacta de células beta 832/13 derivadas de INS-1.As células beta 832/13 intactas derivadas do INS-1 demonstram um aumento induzido pela glicose na utilização de oxigênio. É fundamental que o número apropriado de células seja usado. Os resultados obtidos neste experimento demonstram que um milhão de células por mililitro é a quantidade ideal.As células beta 832/13 derivadas do INS-1 tratadas com curcumina não apresentam alteração na respiração geral. Por outro lado, as células beta 832/13 derivadas do INS-1 tratadas com epicatequinas monoméricas de cacau aumentaram a respiração a 2,5 milimolares de glicose e 16,7 milimolares de glicose. O aumento da respiração também é observado durante o estado de vazamento, que é o estado respiratório basal não fosforilante, bem como a respiração do sistema de transporte de elétrons ou o estado ETS, que é a respiração máxima.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar diretamente a função respiratória das células beta pancreáticas sob condições estimulatórias de insulina. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de pré-tratar as células com tampão SAB de baixa glicose e obter contagens precisas de células para o ensaio.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em obter a quantidade certa de células para medições eficazes. Com muitas células, o sinal é difícil de avaliar e, com poucas, o sinal não é alto o suficiente para ser medido de forma consistente. As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de diabetes e qualquer condição afetada por alterações na função das células beta pancreáticas, porque a respiração mitocondrial é um componente crítico de como funciona a secreção de insulina.Após este procedimento, outros métodos, como a secreção de insulina estimulada por glicose, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: qual é o efeito desses compostos na secreção de insulina? Embora esse método possa fornecer informações sobre a função das células beta, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como músculos, fígado, tecido adiposo e outras análises respiratórias mitocondriais.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Métodos para biópsia de vasto lateral, a preparação de mitocôndrias purificada e profiling respirométrico são descritos. O uso de volume muscular pequeno torna esta técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

Aqui, uma amostra de músculo quadríceps é retirada de um porco anestesiado e as mitocôndrias são isoladas por centrifugação diferencial. Em seguida, as frequências respiratórias dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória mitocondrial são determinadas por meio de respirometria de alta resolução.

Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

Avaliar a fosforilação oxidativa usando respirômetros de alta resolução tornou-se parte integrante da análise funcional das mitocôndrias e do metabolismo de energia celular. Aqui, apresentamos protocolos para a análise do metabolismo de energia celular usando respirômetros de alta resolução baseados em câmara e microplatos e discutimos os principais benefícios de cada dispositivo.

Respirometria de alta resolução para avaliar bioenergésicos em células e tecidos usando respirômetros baseados em câmara e placas

A respirometria de alta resolução acoplada aos sensores de fluorescência determina o consumo mitocondrial de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar as taxas respiratórias mitocondriais e a produção de ROS no nervo ciático permeabilizado.

Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

O estado metabólico das células epiteliais pigmentares da retina humana (H-RPE) reflete sua saúde e função. Apresentamos aqui um protocolo otimizado para examinar o fluxo metabólico em tempo real de H-RPE usando respirometria de alta resolução.

Análise em Tempo Real da Bioenergética em Células Epiteliais Pigmentares Pigmentares Humanas Primárias Usando Respirometria de Alta Resolução

A análise da função mitocondrial espermática por respirometria de alta resolução permite medir o consumo de oxigênio de espermatozoides que se movem livremente em um sistema de câmara fechada. A técnica pode ser aplicada para medir a respiração em espermatozoides humanos, o que fornece informações sobre as características mitocondriais e integridade dos espermatozoides.

Respirometria de Alta Resolução para Avaliação da Função Mitocondrial em Espermatozoides Humanos

Aqui, descrevemos um método abrangente para medir a fosforilação oxidativa mitocondrial em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas frescas de músculos humanos ou de camundongos. Este método permite a quantificação em tempo real da respiração mitocondrial e a avaliação da preferência de combustível e flexibilidade metabólica, preservando as redes mitocondriais existentes e a integridade da membrana.

Medição da respiração mitocondrial em fibras musculares esqueléticas humanas e de camundongos por respirometria de alta resolução

Os métodos para estudar a bioenergética mitocondrial sob concentrações de substrato fisiologicamente relevantes em células imunes são limitados. Fornecemos um protocolo detalhado que usa fluorespirometria de alta resolução para avaliar as mudanças na resposta do potencial da membrana mitocondrial à demanda de energia em células T humanas, monócitos e células mononucleares periféricas.

Fluorespirometria de alta resolução para avaliar mudanças dinâmicas no potencial da membrana mitocondrial em células imunes humanas

Aqui, mostramos que a câmara de 0,5 mL para respirometria de alta resolução mostra resultados consistentes com a câmara de 2,0 mL se a correção instrumental apropriada de fundo O2 for aplicada. Requer menos amostra, o que é vantajoso para estudos com disponibilidade limitada ou baixa capacidade respiratória.

Respirometria de alta resolução em uma câmara de pequeno volume

Aprenda a medir a função mitocondrial em células-beta pancreáticas intactas usando respirometria de alta resolução. Este método avalia os efeitos de compostos naturais sobre a respiração celular em condições estimuladoras de insulina.

Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

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