Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

O objetivo geral do experimento a seguir é usar a tecnologia de consumo de oxigênio baseada em microplacas para avaliar a função da cadeia de transporte de elétrons, da via de oxidação beta do ciclo de TCA e dos transportadores de substrato. Isso é conseguido preparando primeiro o substrato e as soluções de injeção para o ensaio. O segundo passo é adicionar as soluções de injeção em um cartucho de ensaio tric previamente hidratado para calibrar a máquina de consumo de oxigênio.

Em seguida, prepare as soluções de substrato mitocondrial e carregue essas soluções na placa de cultura de células. Gire a placa de cultura de células para permitir a aderência mitocondrial à placa bem antes de carregar a placa no ensaio métrico Respira. São obtidos resultados de instrumentos que mostram as taxas de consumo de oxigênio com base na respiração mitocondrial para cada ensaio respiratório métrico.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o Eletrodo de Clark, é que as tecnologias baseadas em microplacas permitem uma aquisição mais eficiente e de maior rendimento do consumo de oxigênio com quantidades menores de mitocôndrias, geralmente indivíduos novos neste método terão dificuldades por causa de todas as partes móveis envolvidas na preparação das soluções para o ensaio Na noite anterior ao experimento Cartucho de ensaio tric de hidrato em um mililitro de solução de calibração em um não Incubadora de CO2 a 37 graus Celsius no dia seguinte, retire todos os talos congelados e descongele-os em um banho ou incubadora a 37 graus Celsius. Prepare todas as soluções de substrato e soluções de injeção e armazene-as no gelo. O próximo passo é programar a máquina de medição de consumo de oxigênio de vários poços para o peso da mistura adequada e medir os parâmetros.

Entre no software de análise e selecione o modo padrão. Entre no fórum de convidados de cavalos-marinhos e clique no assistente de ensaio. Uma vez no assistente de ensaio, clique no protocolo para alterar os parâmetros de peso e medida da mistura.

Rotule os poços de fundo na guia de correção traseira e certifique-se de destacar. Faça a correção de antecedentes. Rotule as condições clicando primeiro na guia de grupos e rótulos, seguida pela guia de informações do grupo.

Depois que esses parâmetros forem inseridos, clique em final seguido de salvar modelo. Para iniciar este procedimento, coloque as soluções de injeção em um cartucho de ensaio. Tome cuidado para injetar as soluções nas portas adequadas.

Carregue o cartucho de ensaio na máquina com um canto entalhado no canto inferior esquerdo. Inicie a calibração entrando primeiro no software de análise e, em seguida, entrando no modo padrão. Entre no fórum de convidados de cavalos-marinhos.

Abra o modelo salvo na unidade XF na guia de modelos. Uma vez aberto, clique em iniciar para iniciar a calibração, que levará cerca de 30 minutos. As mitocôndrias para este procedimento foram isoladas do músculo esquelético vermelho suavemente, mas misturaram completamente o estoque de substrato mitocondrial, agitando suavemente iterando a solução com uma ponta de pipeta de 200 microlitros que teve cerca de três milímetros de sua extremidade cortada.

Depois de determinar a concentração de proteína do estoque mitocondrial, resus suspende 10 microgramas de proteína mitocondrial por 200 microlitros da mistura de substrato conhecida da podridão do succinato. Misture a solução de substrato mitocondrial suavemente, mas completamente, mexendo suavemente tating a solução com uma ponta de pipeta de 200 microlitros que teve cerca de três milímetros de sua extremidade cortada da mesma maneira. Reeses Band, 14 microgramas de proteína mitocondrial por 200 microlitros de cada uma das misturas de substrato restantes colocam todas as misturas de substrato de proteína mitocondrial no gelo.

Coloque uma placa de cultura de células de 24 poços no gelo e em carga triplicata 50 microlitros por poço de cada uma das misturas de substrato mitocondrial. Os desenvolvedores do ensaio tric baseado em microplacas recomendam deixar um mínimo de dois poços em branco sem mitocôndrias, de preferência em ambos os lados da placa de cultura de células. Gire a placa de cultura de células a 2000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius para aderir as mitocôndrias aos poços enquanto a placa está girando.

Aqueça as soluções de substrato em banho-maria a 37 graus Celsius. Após a conclusão da centrifugação, carregue cuidadosamente 450 microlitros de cada solução de substrato em cima de seus respectivos poços. Certifique-se de carregar a placa em temperatura ambiente.

Carregue os poços em branco com 500 microlitros de substrato em branco. Os poços designados para o ensaio de fluxo de elétrons devem ser carregados com o substrato de fluxo de elétrons, enquanto os poços em branco do ensaio acoplado podem ser carregados com qualquer substrato de ensaio de acoplamento. Depois que 450 microlitros de substrato forem adicionados a cada um, visualize a camada de mitocôndrias no poço com ampliação de 20 x para garantir que as mitocôndrias sejam dispersas uniformemente em uma única monocamada.

Conforme mostrado neste exemplo, os poços de imagem que não parecem ter uma monocamada distribuída uniformemente podem ser removidos após o oc. Depois de confirmar a adesão mitocondrial, leve a placa de cultura de células para o instrumento de ensaio métrico Respir. Clique em OK.

A máquina ejetará a placa de utilidade que foi usada anteriormente para calibração. Remova a placa de utilidade e coloque a placa de cultura de células que contém as mitocôndrias na bandeja. O entalhe azul na placa de cultura de células deve ser colocado no canto inferior esquerdo da bandeja.

Clique em continuar para iniciar a execução do ensaio, que leva cerca de 40 minutos. Após a conclusão da execução, pressione ejetar na tela para ejetar a placa de cultura de células. Assim que a placa for ejetada, remova e descarte a placa de cultura de células e o cartucho.

Clique em continuar na tela. A execução será salva automaticamente como um arquivo XLS no arquivo de dados. Abra este arquivo e altere a exibição de O2 para OCR pressionando a seta para baixo sob o marcador Y um.

Em seguida, altere as taxas de ponto a ponto a ponto nos dados de taxa exibidos como opção. Clique em OK. Para aplicar essas alterações, clique na guia modo de grupo de poços no canto inferior esquerdo da tela para agrupar poços de condições semelhantes.

Por fim, clique na guia de erro padrão médio de exemplo no meio da tela à esquerda. Esses comandos também podem ser configurados antes do ensaio. Esses traçados representam taxas de consumo de oxigênio ou OCR versus tempo para quatro ensaios de acoplamento.

O primeiro painel representa o estado dois, respiração ou respiração na ausência de um DP. O segundo painel após a injeção de A DP representa a respiração acoplada máxima, também chamada de respiração de estado três. O terceiro painel após a injeção de oligo micina. A representa a respiração devido ao vazamento de prótons, também chamado de estado quatro oh respiração.

O quarto painel após a injeção de FCCP representa a respiração desacoplada máxima, também chamada de respiração do Estado três U. O quinto painel após a injeção de antimicina A representa a inibição da respiração oxidativa. Todos os estados mitocondriais têm desvio padrão mínimo devido à mistura completa do estoque mitocondrial e das misturas de substrato mitocondrial e à obtenção de uma única monocamada de mitocôndrias após o spin de aderência.

Em contraste, carregar mitocôndrias desiguais em cada poço e não atingir uma única monocamada de mitocôndrias leva a um aumento do desvio padrão em cada estado, conforme indicado pelo traço azul, que mostra valores de OCR acima de 1.500 ole por minuto, bem como diminuição das taxas de respiração ao longo do período de medição, exemplificado pela queda nos valores de taxa ponto a ponto. Observe que o traço vermelho mostra taxas ponto a ponto consistentes e os valores máximos de OCR estão abaixo de 1.500 ole por minuto. A sobrecarga de proteínas mitocondriais também pode levar ao esgotamento de oxigênio dentro da microcâmara do poço, impedindo assim a medição precisa do OCR para cada medição sucessiva, conforme indicado pelo Blue Trace, que mostra valores de O2 próximos de zero durante o período de medição, bem como valores iniciais de O2 significativamente reduzidos após cada medição sucessiva.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter pacientes ao misturar as mitocôndrias e as soluções de substrato. Uma vez que esses métodos são dominados, experimentos adicionais podem ser deformados para responder a perguntas adicionais, como: como os tratamentos direcionados a medicamentos de um determinado transportador de substrato influenciam o consumo de oxigênio mitocondrial?