Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar a tecnologia de consumo de oxigênio baseada em microplacas para avaliar a função da cadeia de transporte de elétrons, do ciclo do ácido tricarboxílico, da via de beta-oxidação e dos transportadores de substratos. Isso é realizado primeiramente preparando os substratos e as soluções de injeção para o ensaio. O segundo passo é adicionar as soluções de injeção em um cartucho tric previamente hidratado para calibrar a máquina de consumo de oxigênio.

Em seguida, prepare as soluções de substrato mitocondrial e carregue essas soluções na placa de cultura celular. Gire a placa de cultura celular para permitir a aderência mitocondrial ao poço da placa antes de inserir a placa no ensaio respirométrico. Os resultados do instrumento são obtidos e mostram as taxas de consumo de oxigênio com base na respiração mitocondrial para cada ensaio respirométrico.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o Eletrodo de Clark, é que as tecnologias baseadas em microplacas permitem a aquisição mais eficiente e com maior produtividade do consumo de oxigênio, utilizando menores quantidades de mitocôndrias. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades devido ao grande número de componentes envolvidos no preparo das soluções para o ensaio. Na noite anterior ao experimento, hidrate a cartela do ensaio tric com um mililitro de solução de calibração em um incubador sem CO₂ a 37 graus Celsius. No dia seguinte, retire todas as alíquotas congeladas e descongele-as em banho ou incubador a 37 graus Celsius. Prepare todas as soluções de substrato e soluções de injeção e armazene-as em gelo. O próximo passo é programar o equipamento de medição de consumo de oxigênio em múltiplas poças com os parâmetros corretos de mistura, peso e medição.

Abra o software de análise e selecione o modo padrão. Acesse o fórum do Seahorse Guest e clique no assistente de ensaio. Ao entrar no assistente de ensaio, clique em protocolo para alterar os parâmetros de mistura, peso e medição.

Rotule as poços de fundo sob a aba de correção de fundo e certifique-se de destacar. Faça a correção de fundo. Rotule as condições clicando primeiro na aba grupos e rótulos, seguida pela aba informações do grupo.

Após inserir esses parâmetros, clique em finalizar seguido por salvar modelo. Para iniciar este procedimento, carregue as soluções de injeção em uma cartela de execução de ensaio. Tenha cuidado para injetar as soluções nos portos corretos.

Carregue o cartucho do ensaio na máquina com o canto recortado voltado para a parte inferior esquerda. Inicie a calibração entrando primeiro no software de análise e, em seguida, no modo padrão. Acesse o fórum convidado do Seahorse.

Abra o modelo salvo no XF Drive, na guia modelos. Após abri-lo, clique em iniciar para começar a calibração, o que levará cerca de 30 minutos. As mitocôndrias para este procedimento foram isoladas de músculo esquelético vermelho, misturando suave mas completamente o estoque de substrato mitocondrial, agitando suavemente com a ponta de uma pipeta de 200 microlitros que teve cerca de três milímetros de sua extremidade cortados.

Após determinar a concentração proteica do estoque mitocondrial, ressuspenda 10 microgramas de proteína mitocondrial por 200 microlitros da mistura conhecida de substrato succinato/rotenona. Misture suavemente, porém completamente, a solução de substrato mitocondrial agitando-a suavemente com a ponteira de uma pipeta de 200 microlitros que teve cerca de três milímetros de sua extremidade cortados da mesma maneira. Para os demais meios de substrato, utilize 14 microgramas de proteína mitocondrial por 200 microlitros; coloque todas as misturas de proteína mitocondrial com substrato sobre gelo.

Coloque uma placa de cultura celular de 24 poços sobre gelo e, em triplicata, adicione 50 microlitros por poço de cada uma das misturas de substratos mitocondriais. Os desenvolvedores do ensaio tric baseado em microplaca recomendam deixar um mínimo de dois poços em branco sem mitocôndrias, preferencialmente em ambos os lados da placa de cultura celular. Centrifugue a placa de cultura celular a 2000 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius para aderir as mitocôndrias aos poços enquanto a placa estiver em rotação.

Aqueça as soluções de substrato em banho-maria a 37 graus Celsius. Após a centrifugação, adicione cuidadosamente 450 microlitros de cada solução de substrato sobre os respectivos poços. Certifique-se de carregar a placa em temperatura ambiente.

Carregue as pocas vazias com 500 microlitros de branco do substrato. As pocas designadas para o ensaio de fluxo de elétrons devem ser carregadas com o substrato de fluxo de elétrons, enquanto as pocas de branco para o ensaio acoplado podem ser carregadas com qualquer substrato de ensaio de acoplamento. Após a adição de 450 microlitros de substrato a cada poço, visualize a camada de mitocôndrias no poço em 20 x de magnificação para garantir que as mitocôndrias estejam dispersas uniformemente em uma única monocamada.

Como mostrado neste exemplo, poços de imagem que não parecem ter uma monocamada uniformemente distribuída podem ser removidos após a oclusão. Após confirmar a adesão mitocondrial, leve a placa de cultura celular ao instrumento do ensaio Respir métrico. Clique em OK.

A máquina ejetará a placa de utilidade que foi usada anteriormente para calibração. Remova a placa de utilidade e coloque a placa de cultura celular que contém as mitocôndrias na bandeja. A marca azul na placa de cultura celular deve ser colocada no canto inferior esquerdo da bandeja.

Clique em continuar para iniciar a execução do ensaio, que leva cerca de 40 minutos. Após a conclusão da execução, pressione ejetar na tela para ejetar a placa de cultura celular. Uma vez que a placa for ejetada, remova e descarte a placa de cultura celular e a cartucho.

Clique em continuar na tela. A execução será automaticamente salva como um arquivo XLS na pasta de dados. Abra este arquivo e altere a exibição de O2 para OCR clicando na seta para baixo abaixo do marcador Y um.

Em seguida, altere o ponto médio para taxas de ponto a ponto na exibição de dados de taxa como opção. Clique em OK. Para aplicar essas alterações, clique na guia modo de grupo de poços no canto inferior esquerdo da tela para agrupar poços com condições semelhantes.

Por fim, clique na aba de erro padrão da média da amostra na parte central da tela à esquerda. Esses comandos também podem ser configurados antes do ensaio. Esses traçados representam as taxas de consumo de oxigênio ou OCR versus tempo para quatro ensaios de acoplamento.

O primeiro painel representa o estado dois, a respiração ou a respiração na ausência de um DP. O segundo painel após a injeção de um DP representa a respiração acoplada máxima, também chamada de respiração no estado três. O terceiro painel após a injeção de oligomicina representa a respiração devido ao vazamento de prótons, também denominada respiração no estado quatro oh.

O quarto painel após a injeção de FCCP representa a respiração máxima desacoplada, também chamada de respiração Estado três U. O quinto painel após a injeção de antimicina A representa a inibição da respiração oxidativa. Todos os estados mitocondriais apresentam desvio padrão mínimo devido à mistura completa do estoque mitocondrial e das misturas de substratos mitocondriais, bem como à formação de uma única monocamada de mitocôndrias após a centrifugação de aderência.

Em contraste, carregar quantidades desiguais de mitocôndrias em cada poço e não obter uma única monocamada de mitocôndrias leva ao aumento do desvio padrão em cada estado, conforme indicado pelo traço azul, que mostra valores de OCR acima de 1.500 ole por minuto, bem como à diminuição das taxas de respiração ao longo do período de medição, exemplificada pela queda nos valores da taxa ponto a ponto. Observe que o traço vermelho mostra taxas ponto a ponto consistentes e valores máximos de OCR abaixo de 1.500 ole por minuto. O excesso de proteína mitocondrial também pode levar ao esgotamento de oxigênio dentro da microcâmara do poço, impedindo assim a medição precisa do OCR em cada medição subsequente, conforme indicado pelo traço azul, que mostra valores de O₂ se aproximando de zero durante o período de medição, bem como valores iniciais de O₂ significativamente reduzidos após cada medição subsequente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter paciência ao misturar as soluções de mitocôndrias e substrato. Uma vez dominados esses métodos, experimentos adicionais podem ser realizados para responder outras perguntas, como, por exemplo, como os tratamentos farmacológicos direcionados a um transportador de substrato específico influenciam o consumo mitocondrial de oxigênio?