Multimodal Imaging hierárquica das seções Serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes Volumes

O objetivo geral deste fluxo de trabalho é identificar certos alvos para imagens ultraestruturais dentro de um tecido usando microscopia de luz seguida de imagens 3D em um MEV em resolução muito alta. O fluxo de trabalho de imagem apresentado aqui pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a ultraestrutura celular ou tecidual em vários campos, como biologia celular, biologia do desenvolvimento, neurociência ou mesmo patologia. A principal vantagem da técnica, que na verdade é baseada na tomografia de matriz, é que o corte do tecido em matrizes de seções seriais facilita a identificação das estruturas-alvo, mesmo quando inicialmente elas estão enterradas dentro do volume da amostra original.

A tomografia de matriz foi originalmente introduzida em um contexto de neurociência, mas também pode ser aplicada a uma ampla gama de outros sistemas, incluindo bactérias, plantas, animais e até amostras de pacientes em um ambiente de patologia. Indivíduos novos neste método terão dificuldades porque coletar muitas seções em série é muito difícil. Trabalhar sem suporte adicional pode causar perda de seções ou desarranjo das fitas.

Usando uma pequena escova formada por alguns fios de cabelo fixados a um palito, cubra cuidadosamente os lados dianteiro e traseiro de um bloco pré-aparado com uma mistura adesiva. Execute esta etapa rapidamente porque o solvente dessa mistura evapora em segundos. Enquanto as amostras secam, corte pedaços de pastilhas de silício em um tamanho que caiba no barco da faca e marque-os com um riscador de diamante.

Em seguida, limpe o wafer de silício manualmente com isopropanol e tecido sem fiapos. Fixe o substrato em uma extremidade da placa de suporte usando um adesivo removível. Uma vez endurecido, o plasma ativa o substrato usando descarga incandescente com ar para obter uma superfície hidrofílica.

Com o substrato montado mais próximo do fio da navalha, insira o suporte no clamp do suporte do substrato. Em seguida, insira uma faca de diamante jumbo no porta-faca e ajuste o ângulo de folga para zero grau. Em seguida, encha o barco de facas com água destilada.

Aproxime-se da faca de forma que fique a um a dois milímetros da amostra. Em seguida, abaixe o substrato na água usando os parafusos de um a três do suporte do substrato. Verifique se a linha de água está localizada no terço superior do substrato.

Como é difícil ver a distância ao solo ao usar um wafer de silício, abaixe o substrato até sentir que ele toca o chão. Em seguida, levante um pouco o substrato. Certifique-se de que nem o substrato nem o transportador toquem no barco da faca durante o corte.

Em seguida, use uma seringa ou pipeta para ajustar o nível da água no barco. Enquanto observa através do binóculo, adicione ou remova água até que toda a área da superfície da água mostre um reflexo homogêneo da iluminação da luz superior do ultramicrótomo. Quando a configuração estiver concluída, comece a seccionar a amostra.

Quando várias seções tiverem sido cortadas, interrompa o processo de corte e solte a fita do fio da faca acariciando suavemente o fio da faca com um cílio ou um pêlo de gato muito macio. Manipule a fita em direção ao substrato e empurre suavemente a primeira seção da fita para prendê-la à parte seca do substrato. Continue seccionando a amostra e anexando as fitas ao substrato.

Comece de um lado do substrato e mova-se gradualmente em direção ao outro a cada nova fita. Quando o substrato estiver completamente coberto com fitas, levante suavemente o substrato do barco da faca usando os parafusos do micromanipulador do suporte do substrato. Deixe o conjunto de fitas secar e guarde-o em um ambiente livre de poeira.

Após a secagem, remova o substrato montado com adesivo o mais rápido possível do suporte. Em seguida, core sua amostra para microscopia de luz conforme descrito no protocolo de texto que acompanha e realize imagens. Em seguida, core a amostra para microscopia eletrônica e monte-a em pontas de alumínio com uma almofada de carbono pegajosa.

Agora imagine essas matrizes no microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo. Para evitar o carregamento, use energias de elétrons primários de três kV ou menos e uma corrente de feixe entre 50 e 800 picoamperes. Ao usar lamínulas de vidro revestidas com ITO, conecte a superfície condutora ao suporte do microscópio com fita de cobre e tinta prateada.

O primeiro passo na cascata de imagens hierárquicas é gerar uma visão geral da matriz de forma que as seções individuais possam ser reconhecidas. Primeiro, defina os quatro cantos de sua matriz representando graficamente uma imagem de cada canto com baixa ampliação, cerca de 100x, e crie um ROI envolvendo toda a matriz. Atribua um protocolo de imagem a esse ROI com os seguintes parâmetros.

Use o detector de elétrons secundário para imagens de alta velocidade usando um tempo de permanência curto de cerca de 0,2 microssegundos. Escolha um tamanho de pixel de imagem grande e um tamanho de bloco de 2000 por 2000 pixels. O resultado é uma imagem muito ruidosa, mas mesmo aqui, o tecido dentro da seção é visível.

Em seguida, gere um conjunto de seções criando uma região de interesse, delineando apenas o tecido na primeira seção. Clone-o em todas as seções subsequentes usando a ferramenta de carimbo. Gire as regiões de interesse quando necessário para acomodar fitas dobradas.

Atribua um protocolo à seção que melhor exibe a subestrutura do tecido. Aqui, um tamanho de pixel intermediário de 60 nanômetros, um tamanho de bloco de 12000 por 12000 pixels e um tempo de permanência de 3,2 microssegundos foi usado. Devido à baixa qualidade, um segundo conjunto de seções descrevendo algumas células selecionadas foi criado usando um tamanho de pixel menor e um detector mais sensível.

Agora é possível reconhecer muito bem as duas células-alvo. Crie um conjunto de locais dentro do conjunto de seções que contém a estrutura de destino para imagens SEM de resolução mais alta. Torne a região de interesse grande o suficiente para levar em conta a precisão em etapas.

Verifique e ajuste as posições dos sites. O ajuste automático é necessário quando muitas seções são fotografadas. É importante colocar as regiões de interesse para que o centro não fique sobre material vazio sem detalhes estruturais, por exemplo, vacúolos.

Em seguida, defina as configurações de foco automático e verifique o desempenho da imagem ao longo do comprimento de uma fita em uma pequena região de interesse próxima ao local que será fotografado. Em seguida, defina um protocolo de imagem para a aquisição de MEV de alta resolução. Para ver os compartimentos da membrana, escolha um tamanho de pixel de imagem entre três e cinco nanômetros.

Selecione um tempo de permanência dependendo do detector para que a imagem não fique muito barulhenta. Como o estágio precisa percorrer uma grande distância entre a gravação desta e desta seção, defina os valores de foco em pelo menos a primeira seção de cada faixa de opções usando a opção de protocolo de verificação. Em seguida, inicie a imagem SEM automatizada em toda a série de regiões-alvo de interesse.

Quando terminar, exporte os dados adquiridos como uma série de imagens, de preferência no formato TIF. Importe séries de imagens para Fiji como uma pilha virtual. Em seguida, corte a pilha para processamento posterior, aparando a área o mais próximo possível da estrutura de interesse.

Além disso, ajuste o brilho e o contraste e salve a pilha. Uma vez cortado e otimizado, abra um novo TrakEM no menu Arquivo. Clique com o botão direito do mouse no campo da imagem e importe a pilha para o TrakEM como uma fatia por camada.

Ao clicar com o botão direito, escolha Alinhar camadas. Escolha mínimos quadrados como modo, defina o intervalo do primeiro ao último e escolha nenhum como referência. Em seguida, selecione os valores de configuração padrão e escolha Rígido como a transformação desejada.

Quando o registro estiver concluído e satisfatório, salve o conjunto de dados alinhado clicando com o botão direito do mouse e escolhendo Exportar. Faça uma imagem plana, defina o intervalo da primeira à última imagem e deixe o software mostrar a pilha resultante. Quando terminar, salve a pilha no formato TIF.

Após a preparação, a matriz de seção aparece como uma matriz que consiste em várias faixas de seções seriais. Esta seção mostra uma visão geral de uma ponta de raiz de arabidopsis, corada com iodeto de propídio. As seções sequenciais desta amostra foram alinhadas conforme descrito no protocolo e combinadas para mostrar a amostra em 3D como um único arquivo de filme.

Aqui, pode-se ver as duas células-alvo que mais tarde serão fotografadas em resolução nanométrica no SEM. Após coloração adicional com acetato de uranila e citrato sanguíneo, as matrizes foram fotografadas no microscópio eletrônico. Esta imagem estática mostra a seção da amostra fotografada pela primeira vez com resolução de 20 nanômetros e na segunda rodada de imagens, com resolução de cinco nanômetros.

Aqui, 210 imagens sequenciais do microscópio eletrônico foram alinhadas e cortadas conforme descrito no protocolo. O vídeo tem como alvo apenas duas células e mostra como os vacúolos dentro das células são organizados e às vezes conectados em 3D. A imagem hierárquica automatizada das matrizes no SEM mostrado aqui pode fornecer mapeamento contínuo em diferentes níveis de resolução, desde uma visão geral de toda a matriz até detalhes subcelulares.

Na maior ampliação, vacúolos, mitocôndrias, núcleo e retículo endoplasmático são reconhecíveis. Uma vez dominado, a colocação de fitas de seção lado a lado em um substrato típico pode ser feita em poucas horas se for executada corretamente. Isso pode fornecer centenas de seções em um substrato para imagens.

O tempo de imagem para um número tão grande de seções pode variar de um microscópio para outro, ainda mais se seus instrumentos de imagem favoritos tiverem diferentes níveis de automação. É interessante notar que o fluxo de trabalho geral pode ser facilmente combinado com outras técnicas de imagem, como coloração histo padrão ou mesmo candoluminescência, ou simplesmente pode ser usado como ferramenta autônoma para imagens artoestruturais de grandes volumes. Outro aspecto desse fluxo de trabalho é a fácil acessibilidade.

Os estudos iniciais são viáveis sem ferramentas adicionais ou automação, o que significa sem grandes investimentos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia sobre o fluxo de trabalho e como a imagem multimodal e hierárquica pode ser usada para direcionar e criar imagens de estruturas interessantes em um grande volume 3D em diferentes níveis de resolução.