Name: Multimodal Imaging hierárquica das seções Serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes Volumes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda a identificar alvos celulares específicos em grandes volumes teciduais usando microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura. Este protocolo de tomografia de série permite imagem hierárquica multimodal de ultrastruturas.

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Este trabalho foi apoiado pela concessão FKZ 13GW0044 do Ministério Federal alemão de educação e pesquisa, projeto MorphiQuant-3D. Agradecemos Bartels Carolin para suporte técnico.

<ol><li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+third+dimension%3A+Volume+electron+microscopy+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li>
<li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience.</a> J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li>
<li>Wacker, I., Schröder, R. R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jmi.12087/full">Array tomography.</a> J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).</li>
<li>Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).</li>
<li>Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+Microscopes%3A+3D+Correlative+Light+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Complex+Biological+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures.</a> Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).</li>
<li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopy%3A+ultrasructure+lights+up%21%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li>
<li>Verkade, P., Müller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVerkade%2C+P+%22Methods+in+Cell+Biology+Correlative+Light+and+Electron+Microscopy+III%22">Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III</a>. 140, 1st ed, Elsevier. 1-352 (2017).</li>
<li>Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescing+the+Electron%3A+Strategies+in+Correlative+Experimental+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design.</a> Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).</li>
<li>Wacker, I., Schröder, R. R., Schroeder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+goes+3D%3A+Exploring+the+potential+of+array+tomography+versus+FIB+nanotomography+for+a+CADASIL+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastruct+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample.</a> Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).</li>
<li>Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schröder, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+imaging%3A+a+new+concept+for+targeted+imaging+of+large+volumes+from+cells+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues.</a> BMC Cell Biol. 17 (1), 38(2016).</li>
<li>Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper%3A+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Front Neural Circuits. 8, Article 68 (2014).</li>
<li>Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+Tomography%3A+Production+of+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Array Tomography: Production of Arrays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).</li>
<li>Fahrenbach, W. H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jemt.1060010407/abstract">Continuous serial thin sectioning for electron microscopy.</a> J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).</li>
<li>Harris, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+serial+sectioning+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy.</a> J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+Tomography%3A+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li>
</ol>

KIT recebeu os reembolsos por Boeckeler instrumentos para fornecimento de um modelo funcional do titular do substrato. Marlene Thaler é funcionário da ZEISS microscopia GmbH, fabricante de sistemas de microscópio mencionadas neste artigo. Além disso, a ZEISS oferece certas soluções como pacotes de solução de Atlas de ZEISS para uma ampla gama de aplicações em imagens 3D, de grande área para SEM e FIB-SEM instrumentos. Todos os outros autores não têm nada para divulgar.

Demonstrou-se um fluxo de trabalho para o direcionamento de células específicas dentro de um tecido por AT hierárquica multimodal: uma amostra de resina-incorporado é rasgada em matrizes de seriais seções, que são colocadas em um substrato condutor usando um suporte de substrato personalizados. Depois de rotulagem com um fluoróforo e imagem no FLM, o volume reconstruído é usado para selecionar as células alvo. Após coloração adicionais rodadas com metais pesados para introduzir o contraste, esses destinos são imaginados durante várias cem seções em nanoescala resolução em um SEM usar uma plataforma de software automatizado.
Para a produção de matrizes densamente com várias fitas longas, um titular de substrato semelhante à descrita aqui é necessário. Uma pessoa hábil e paciente pode ser capaz de anexar várias fitas para um substrato de silício, semi imerso no barco a faca e recuperar a matriz, reduzindo gradualmente o nível da água até as fitas estão sentados sobre o substrato. No entanto, na nossa experiência, há uma tendência para quebrar a formação quando o substrato está tocando em qualquer parte do barco faca (cf. nota no 1.3.2 no protocolo). Além disso, este procedimento é muito mais difícil com substratos revestidos ITO: (1) devido a transparência do vidro-ITO, é difícil ver a borda da água onde as extremidades das fitas tem que ser anexado; e (2) porque a superfície ITO-revestido é muito mais difícil do que a bolacha de silício altamente polido, as fitas tendem a quebrar durante o elevador e fragmentos menores, consistindo de algumas seções podem flutuar, destruindo assim a ordem das seções.
O fluxo de trabalho inteiro também é viável sem correlação com dados FLM. Neste caso, coleta de dados no SEM pode ter que ser executadas em várias sessões. Uma reconstrução 3D inicial ou pelo menos a avaliação de dados de baixa ou média resolução pode ser necessária para identificar alvos. Além disso, manchas histológicas convencionais para brightfield LM (não exigindo FLM) podem ser aplicadas. Claro que outras opções6,7,8 são anticorpos rotulagem nos arrays, como já demonstrado no livro inicial sobre a18, ou geneticamente codificado proteínas fluorescentes (XFPs) ou pré-incorporação de rotulagem com preservação da fluorescência durante a preparação da amostra.
Uma limitação geral do método discutido é o uso de seções de uma certa espessura e a amostragem discreta resultante do volume 3D: resolução em Z só pode ser tão bom quanto a espessura das seções, desde que o SEM recolhe apenas os dados da superfície de seção (d epending sobre a energia de energia primária/aterragem selecionada). Isto significa que o volume 3D resultante tem voxels anisotrópicos, por exemplo., 5 x 5 x 100 nm3 se 100 nm seções e um tamanho de pixel de imagem de 5 nm são usados. Para entidades muito pequenas em uma escala de tamanho abaixo de 1 µm, isto pode não ser suficiente para uma verdadeira descrição ultraestrutural. Uma limitação mais técnica é a precisão do palco usado no SEM para automatizada de imagem. Devido a isto, é necessário escolher um ROI maior do que as especificações de precisão do palco para garantir que a área de destino completo é fotografada.
Comparado a SBF-SEM e FIB-SEM como métodos de imagem de cara-de-bloco, o correlativo AT tem a desvantagem definitiva de voxels anisotrópicos, conforme descrito acima. Com FIB-SEM, voxels isotrópicos de 5 x 5 x 5 nm3 podem ser obtidos quando uma correção adequada deriva está no local.
Lacunas no volume reconstruído devido à perda de seções durante a preparação de matrizes podem também ser uma preocupação que não é encontrada com a SBF-SEM ou FIB-SEM. Com a estabilização de bom da fita pela colagem, geralmente é apenas um problema para a última seção de uma fita: pode ser danificado quando liberá-lo do fio do navalha, usando o cílio. No entanto, em nossa experiência, a perda de uma seção em todas as seções de 20 – 50 não influi registro de imagem.
Por outro lado, a possibilidade de pós-manchar matrizes confere bom sinal e contraste para a imagem latente SEM, mesmo em amostras fracamente metalizadas, tais como a alta pressão congelados dicas de raiz, mostradas aqui. Portanto, não é necessário comprometer óptima preservação ultraestrutural por numerosos fixação química e passos de metalização. Além disso, amostras de rotina do laboratório de patologia com graus intermédios de metalização entregam dados excelente10. Tal um realce de contraste pós-incorporação não é possível para SBF-SEM e FIB-SEM em geral. Além disso, desde que estes métodos são destrutivos, ou seja, consumindo a amostra durante a geração de imagens, hierárquica em sites e diferentes resoluções de imagem ou imagens repetidas em pontos mais tarde no tempo é impossível. Em princípio, volumes ilimitados, consistindo de grandes FOVs (por exemplo, até vários milímetros para cérebro de rato inteiro em connectomics) criado por mosaicos de costura, e um número enorme de seções pode ser adquirido por AT, enquanto na FIB-SEM, FOVs além de 100 µm x 100 µm são difíceis de alcançar com instrumentos de rotina.
Mais automação de fluxo de trabalho-AT descrito seria uma vantagem definitiva, desde que os métodos acima mencionados SBF-SEM e FIB-SEM realizar tanto de seccionamento e de imagem dentro o mesmo instrumento de forma totalmente automatizada. Existe um tipo de automação de corte: ATUMtome The12 pode gerar e coletar milhares de seções, mas o uso de fita Kapton como um substrato faz com que tais matrizes difíceis de imagem em um FLM. Sobre as lamelas ITO-revestido usadas aqui, imagem de super-resolução até deve ser possível. Um alvo mais longe, muito desejável para automação seria a gravação de pilhas de dados FLM. Por outro lado, automação pode ser cara e exceto o titular do substrato, o fluxo de trabalho aqui apresentado baseia-se (em termos de hardware) apenas na instrumentação geralmente disponível em uma rotina EM laboratório ou núcleo facilidade, tornando-o baixo nível de acesso.

Para grandes volumes de tecido na resolução ultraestrutural de reconstruir um número de diferentes abordagens de imagens baseado em SEM ter sido usado1: avaliações abrangentes são disponíveis por exemplo., SBF-SEM2, FIB-SEM3e matriz Tomografia computadorizada (no)4. Enquanto para o último método material de amostra é preservado como uma matriz de seriais seções sobre um substrato, SBF-SEM e FIB-SEM são métodos destrutivos, trabalhando no bloco de amostra e consumi-la durante a imagem latente. Devido a carga da resina no SEM, eles também dependem fortemente metalizado amostra blocos5.
Por outro lado, identificar certas células ou estruturas de interesse dentro de uma amostra de tecido pode lucrar particularmente correlativo luz e microscopia eletrônica de varredura (CLEM)6,7,8. Usar o FLM para direcionamento impede a aplicação de grandes quantidades de metais pesados desde que isto iria saciar a fluorescência sinal9. Para tais apenas amostras ligeiramente metalizadas, AT é o método de escolha como matrizes podem ser facilmente pós-manchadas com heavy metal depois da imagem latente de LM. Além disso, quase qualquer tipo de amostra pode ser usado para a AT, amostras de rotina nem do patologista tesouro peito10.
Outra grande vantagem da AT é o potencial para hierárquico11 ou multi resolução de imagem12: não é necessário para tudo em alta resolução de imagem, como alvos podem ser selecionados em uma modalidade diferente (por exemplo, FLM) ou em imagens de baixa resolução SEM. Somente as regiões interessantes de uma população de tecido ou célula em alta resolução de imagem economiza espaço de armazenamento de dados digitais e produz pequenos conjuntos de dados de imagem, que são mais fáceis de lidar. Aqui, o fluxo de trabalho AT é demonstrado usando uma amostra bastante fracamente metalizada: alta pressão congelado as raízes das plantas (Arabidopsis thaliana) incorporado em resina hidrofílica.
Como as matrizes são preparadas, manchadas e fotografadas em FLM e SEM, e como as pilhas de imagem são registradas são explicados. Além disso, como a reconstrução 3D do volume FLM pode ser usada para selecionar células específicas para a imagem latente no SEM em nanoescala resolução é ilustrada.

<table><tbody><tr><td>Instrumentação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC</td><td>PT-PC</td><td>Alternativa: Leica UC7</td></tr><tr><td>Suporte de substrato</td><td>RMC</td><td>ASH-100</td><td>Alternativa: limpador de plasma construído em casa</td></tr><tr><td></td><td>Diener</td><td>Zepto 40kHz</td><td>Alternativas: Ted Pella Pelco ou outro limpador de plasma de bancada Exemplo de parâmetros para Diener Zepto com gerador de 40kHz (0-100W); 0,5 mbar, 5 sccm (Ar), 10% de desempenho</td></tr><tr><td>Microscópio de luz de fluorescência de campo amplo</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td>Alternativas: Leica, Nikon, Olympus</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros de fluorescência</td><td>Zeiss</td><td>43 HE (Cy3/DsRed)</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Neofluar 40x</td><td>&nbsp; 0,75 NA</td></tr><tr><td>Estação de trabalho decente capaz de lidar com dados</td><td></td><td></td><td></td>de imagem do tamanho de GB</tr><tr><td>FESEM</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td>Alternativas: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Seccionamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Plano</td><td>T585-V</td><td></td></tr><tr><td>Faca de diamante para aparar 45&deg;</td><td>Diatome</td><td>DTB45</td><td></td></tr><tr><td>Faca de diamante para aparar 90&deg;</td><td>Diatome</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>Jumbo faca diamantada para seccionamento</td><td>Diatome</td><td>DUJ3530</td><td></td></tr><tr><td>Bolacha de silício (peças)</td><td>Si-Mat</td><td>Custom</td><td>Made Doping: P/Bor, orientação: < 100>, espessura: 525 &plusmn; 25 &micro; m, resistividade: 1-30 &Omega;-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td></tr><tr><td>lamínulas revestidas com ITO</td><td>Balzers</td><td>Tipo Z</td><td>22 &vezes; 22 &vezes; 0,17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td></tr><tr><td>Transportador de alumínio</td><td>Feito sob medida</td><td>76 &vezes; pinça</td>de wafer de <td></td> 26 mm</tr><tr><td></td><td>Ideal-tek</td><td>34A.SA</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de tocos</td><td>Dumont</td><td>0103-2E1/2-PO-1</td><td>Dumoxel-H 2E 1/2</td></tr><tr><td>Diamante scriber</td><td>Plano</td><td>T5448</td><td></td></tr><tr><td>Pestanas / pêlos de gato muito macios</td><td>Selfmade</td><td></td><td>Alternativa: Plano</td></tr><tr><td>Brush</td><td>Selfmade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adesivo de contato Pattex</td><td></td><td>Pattex PCL3C</td><td>Kraftkleber Classic (o amarelado)</td></tr><tr><td>Fixogum</td><td>Marabu</td><td>290110001</td><td>para fixação de substrato ao transportador</td></tr><tr><td>Fita adesiva</td><td>3M</td><td>851</td><td>para fixação de substrato ao transportador</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Bernd Kraft</td><td>07029.4000</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Carl Roth</td><td>4436</td><td>diluente para mistura de cola</td></tr><tr><td>Rotihistol</td><td>Carl Roth</td><td>6640</td><td>alternativa, diluente à base de limoneno</td></tr><tr><td><forte>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Processamento de imagens</td><td>Open source</td><td>Fiji (http://fiji.sc/#download)Aquisição</td><td></td></tr> <tr>de <td>imagens</td><td>Zeiss</td><td>Atlas 5 AT (módulo para Zeiss SEM)</td><td>Alternativa para aquisição automatizada de imagens: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Coloração</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodeto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Solução de estoque: 1,5 mM em azida de sódio a 0,1% de</td></tr><tr><td>uranilacetato</td> Serviços <td>de</td> Ciência <td>E22400</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de chumbo (II)</td><td>Merck</td><td>107398</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de Trissódio Dihidratado</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de NaOH</td><td>Merck</td><td>106469</td><td></td></tr><tr><td>Solução de NaOH 1M</td><td>Bernd Kraft</td><td>01030.3000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidro</td><td>Duran</td><td>23 755 56</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Montagem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stubs</td><td>Plano</td><td>G301F</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de carbono</td><td>Plano</td><td>G3347</td><td></td></tr><tr><td>Fita de cobre</td><td>Plano</td><td>G3397</td><td>adesivo dupla face, condutor</td></tr><tr><td>Tinta prateada</td><td>Plano</td><td>G3692</td><td>Acheson Elektrodag 1415M</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Soluções/misturas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mistura adesiva para blocos</td><td></td><td></td> de revestimento <td>Adesivo de contato Pattex / xileno como diluente, proporção 1: 3, (Alternativa para xileno: Rotihistol)</td></tr> <tr><td>Citrato</td><td></td><td></td> de chumbo Reynolds <td>50 mL: Dissolver 1,33 g de nitrato de chumbo (II) em 10 mL de dH2O. Dissolver 1,76 g de citrato trissódico di-hidratado em 10 ml de mistura de dH2O. e adicionar hidróxido de sódio 1 M até que a solução esteja límpida. Encher com dH2O até 50 ml.</td></tr><tr>Solução de <td></td><td></td><td>coloração de iodeto de propídio</td><td>Prepare a diluição 1:1500 do estoque em dH2O. Vortex para mistura adequada.</td></tr><tr>Acetato <td></td><td></td><td>de uranilo aquoso</td><td>Dissolver acetato de uranilo a 3 % em dH2O (homogeneizar).</td></tr></tbody></table>

multimodal imaging hierárquica das seções serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes volumes

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Direcionamento de células específicas na resolução ultraestrutural dentro de uma população mista de célula ou um tecido pode ser conseguida de imagem hierárquica usando uma combinação de luz e microscopia eletrônica. Amostras embutidas resina são seccionadas em matrizes consiste em fitas de centenas de seções ultra-finas e depositadas em pedaços de bolacha de silicone ou lamelas feito revestidas. Matrizes são imagens em baixa resolução usando um consumidor digital como a câmera do smartphone ou microscópio de luz (LM) para uma visão geral rápida de grande área ou um microscópio de fluorescência de campo largo (luz a microscopia de fluorescência (FLM)) após a rotulagem com fluorophores. Depois da pós-coloração com metais pesados, matrizes são fotografadas em um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Seleção de alvos é possível partir de reconstruções 3D geradas por FLM ou reconstruções 3D feitas das pilhas SEM imagem em resolução intermediária se sem marcadores fluorescentes estão disponíveis. Para análise ultraestrutural, alvos selecionados são finalmente gravou no SEM em alta resolução (pixels de imagem de alguns nanômetros). Uma ferramenta de manipulação de fita que pode ser adaptada para qualquer ultramicrotome é demonstrada. Ajuda com produção de matriz e remoção de substrato do barco faca corte. Uma plataforma de software que permite a imagem automatizada de matrizes na SEM é discutida. Em comparação com outros métodos de geração de dados de grande volume EM, tais como SEM rosto-bloco serial (SBF-SEM) ou feixe de íon focalizado SEM (FIB-SEM), essa abordagem tem duas vantagens principais: (1) a amostra de resina-incorporado é conservada, embora em uma versão cortada. Pode ser manchado de maneiras diferentes e fotografada com diferentes resoluções. (2) uma vez que as seções podem ser manchadas de pós, não é necessário usar amostras fortemente manchada de bloco com metais pesados para introduzir o contraste para a imagem latente SEM ou processar blocos o tecido condutor. Isto torna o método aplicável a uma grande variedade de questões biológicas e materiais. Materiais particularmente prefixado por exemplo, de bancos de biópsia e laboratórios de patologia, pode diretamente ser incorporado e reconstruído em 3D.

O fluxo de trabalho descrito aqui (Figura 1) começa com uma amostra incorporada em um bloco de resina. Durante a preparação da amostra, alguns metais pesados devem ser introduzidas no tecido, mas não é necessário usar protocolos otimizados para metalização bastante forte. A figura 1A mostra uma raiz de planta (agrião) bloco-manchado convencionalmente com 1% OsO4 e 1% de acetato de uranilo, enquanto a raiz de Arabidopsis na figura 1B é apenas fracamente metalizado usando acetato de uranilo 0,5%. O tipo de amostra este último é mais adequado para abordagens correlativas como alguns metais pesados tendem a saciar a fluorescência. Com um suporte dedicado do substrato (Figura 2), matrizes de várias centenas de seções podem ser produzido (Figura 1). Depois etiquetando fluorescente, como matrizes é fotografado em um FLM de campo amplo padrão (Figura 1), em seguida, corado com soluções de heavy metal e fotografado em um SEM em resoluções diferentes (Figura 1E–G).
Ferramentas importantes para a geração reprodutível de matrizes, particularmente quando colocando várias fitas de barco de faca do micrótomo sobre um substrato, são o titular do substrato (Figura 2A, personalizados em laboratório dos autores) e um diamante de Jumbo faca com um barco suficientemente grande para acomodar corrediças do microscópio (Figura 2B). Um menisco plano, permitindo que a boa observação das fitas, é necessário e pode ser alcançado por plasma limpeza do substrato: uma pequena gota de água destilada não deve formar uma estrutura de lente sobre o substrato, como na Figura 2 (substrato não tratado), Mas uma película fina (Figura 2D, substrato de plasma ativado). Nestas condições, fitas anexadas à parte seca de uma lamela ITO-revestido são facilmente visualizados (Figura 2E) e podem ser observadas e controladas durante o elevador do substrato da água.
Por exemplo, matrizes manchados com iodeto de propidium para rotular a parede celular das plantas foram fotografadas com um padrão amplo campo FLM (Figura 3A). Uma vez que as seções são apenas 100 nm grossa, nem excessivamente manchando conforme mostrado aqui introduz pouco ofuscamento. Após o registo, selecionaram-se as duas células completamente fechadas no volume reconstruído da pilha de imagem (Figura 3B) para geração de imagens de alta resolução em 3D (Veja também Suplementar filme S1). Após coloração adicional com citrato de acetato e chumbo de uranilo, as matrizes foram fotografadas no SEM. Figura 3 C mostra uma visão geral, gravada com 60 pixels da imagem do nm; o quadrado escuro no centro da imagem indica a posição onde as funções de autofocus foram executadas, e a dose adicional levou à contaminação ligeira. Adequado de ROIs em secções seriais (fatias 51 para 248 de 435 fatias no total) que contém as células de dois alvo selecionadas na pilha de FLM então foram gravadas com um tamanho de pixel de imagem nm 5 (Figura 3D; ver também Suplementar filme S2).
Imagem hierárquica automatizada das matrizes no SEM descrito aqui foi feita com a solução de plataforma de software e de hardware ZEISS Atlas 5. Primeiro, uma visão geral de todo o conjunto foi criada usando o detector SE, com muito grandes (1.000 nm) imagem pixels e tempo de permanência muito baixa (Figura 4A). Um ROI descrevendo apenas o tecido foi colocado na primeira seção e propagado para todas as outras seções da matriz. Este conjunto de seção foi então gravado com 60 pixels de imagem nm usando um longo tempo de interrupção (Figura 4B). Finalmente, um conjunto de site, que contém as células dois alvo mais um "camada" de em torno de células para contabilizar a imprecisão do palco, foi criado com os seguintes parâmetros: detector de ESB (Backscatter seletiva de energia), imagem de nm 5 pixels, muito longos (40 µs) habitam o tempo ( Figura 4). Aumentar o zoom em uma imagem tão mostra detalhes subcellular (Figura 4), tais como vacúolos (V), mitocôndria (M), núcleo (N) e retículo endoplasmático (setas). Veja também o S3 suplementar do filme para aumentar o zoom em de uma visão geral da matriz de todo o detalhe subcellular de uma célula-alvo.
A matriz mostrada aqui (200 seções) e mais um adicional de 250 seções levou cerca de 8 h para produzir, uma noite a mancha para LM e um dia para gravar (manualmente) para o FLM. Pós-coloração leva cerca de 1-2h, no total, dependendo do número de matrizes individuais. Para a gravação de SEM, algumas horas são necessárias para configurar a execução do Atlas, e gravação automatizada foi 3 – 4 h para o conjunto de seção intermediária da resolução (tamanho de pixel de 60 nm) (200 seções, 450 x 200 µm2) e a cerca de 5 dias para o de alta resolução (5 nm pixel tamanho) ROI contendo as células dois alvo (200 seções, 55 x 30 µm2). Note que devido ao baixo teor de metal da amostra mostrado aqui, tinha uma velocidade de digitalização muito lenta ser usado para alcançar uma boa detecção de sinal-ruído, que implicou (para o detector atualmente disponível) um tempo de interrupção de 40 µs para o ROI de alta resolução.
Existem várias etapas do fluxo de trabalho inteiro propenso a armadilhas: idealmente fitas devem ser mais ou menos em linha reta e colocados na ordem correta (Figura 5A). No entanto, dobrada (Figura 5B), curvas (Figura 5) ou fitas mesmo quebradas muitas vezes são produzidas. Isso pode resultar devido a remoção incorreta (líder e extremidade posterior não é exatamente paralela) ou adesivo não uniformemente aplicado, mas também de uma amostra desigualmente infiltrada ou assimétrica. São particularmente problemáticas amostras contendo componentes macios e muito difícil. Estes componentes podem ser difíceis de se infiltrar como a parede de pilha das raizes da planta mostrada aqui (Figura 5). Nesse caso, dobras (setas) facilmente podem ser causadas por compressão variável e relaxamento durante o corte. Para automatizada de imagem no SEM, fitas curvas não são um grande problema, desde o ROIs podem ser girado para acomodar a curvatura da faixa de opções.
Outro passo crítico no protocolo é de coloração: lavagem inadequada pode levar a resíduos na seção (Figura 5E, F) e na pior das hipóteses, cobrir a área mais interessante (círculo em uma das células dois alvo na Figura 5F). Além disso, a poeira (Figura 5, as partículas de espalhamento de luz fortemente) introduzida no barco de faca, por exemplo, com um portador de substrato sujo, pode causar sérios problemas: no FLM, a poeira pode ser altamente fluorescente (cf. algumas fatias em filme suplementar S1) a tal ponto que alguns algoritmos de registro não funcionam. A função de "Alinhar" em TrakEM17 , no entanto, pode manipular tais pilhas conforme demonstrado no Supplemental filme S1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> Figura 1: fluxo de trabalho para a imagem hierárquica correlativa. A partir de uma amostra incorporado em um bloco de resina (A, amostra fortemente metalizada), a amostra é primeira aparada (B, amostra fracamente metalizada) e em seguida matrizes aqui consistindo de várias fitas de seriais seções (C), colocado em um ITO-revestido lamela, são produzidos usando um ultramicrotome. Após coloração com um corante fluorescente, pilhas de imagens são gravadas em um campo amplo FLM (D). Depois sais de coloração mais rodadas com heavy metal, pilhas são fotografadas em um SEM (E–G) em diferentes resoluções (tamanho do pixel de imagem). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> Figura 2: ferramentas para a preparação de matrizes. Titular de substrato montado de Micromanipuladores com sete eixos de movimento ligado a um padrão ultramicrotome (A): os parafusos, destacados com círculos, são para (2) movimento horizontal e vertical (1) e inclinação (3) da transportadora substrato . A faca enorme diamante com um tamanho grande barco para acomodar grandes substratos (seta), aqui com um pedaço de bolacha de silício ativado plasma montado sobre um portador de alumínio tamanho slide (B). 20 gotas de µ l de água destilada colocada em uma carcaça de bolacha de silício não tratada (C) ou em um substrato de plasma está ativado (D). Quatro fitas flutuando no barco a faca, anexado a uma lamela ITO-revestido por suas extremidades inferiores. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> Figura 3: correlação dos dados com dados SEM LM. Súmulas (A, C) e nas células-alvo (B, D), gravado com o FLM (A, B) e SEM (C, D). (B) é um software de zoom, e os dados originais foram gravados com uma lente de objetiva X 40 em um chip de 1.388 x 1.040 pixel câmera, enquanto (C) é gravado com 60 nm tamanho de pixel da imagem e (D) com 5 nm pixel tamanho da imagem, ilustrando o verdadeiro aumento da resolução no SEM. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> Figura 4: hierárquica de imagem no SEM usando ZEISS Atlas 5 em Visão geral de uma matriz gravada com 1.000 pixels de imagem nm usando o detector SE (A). Seção define com o ROI colocados no tecido em cada seção e gravou com 60 pixels de imagem nm (B). Local define com um ROI serial colocado sobre células-alvo e gravou com pixels de imagem 5 nm (C). Ao aumentar o zoom em tais imagens de alta resolução (D), compartimentos de membrana intracelular como vacúolos (V), núcleo (N), mitocôndria (M) e retículo endoplasmático (setas) tornam-se visíveis. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> Figura 5: problemas típicos. 1. decorrentes do processo de corte: fitas colocadas no ITO-revestido lamelas são idealmente reta (A), mas irregular compressão durante o corte podem causar dobrados (B) ou fitas curvas (D) ou até mesmo dobras (C). 2. causada pelo tratamento de substrato e fitas na água, por exemplo, durante o corte e coloração: luz espalhamento de partículas em substrato (D), borda de gotículas na seção (círculo em mi), ou sujeira esfregaste fora tecido devido à inadequada lavagem após coloração (F). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Suplementar filme S1: pilha de imagem FLM. 435 imagens alinhadas em Fiji16 usando TrakEM17 e salvo como arquivo de filme (. avi). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementar filme S2: pilha de imagem SEM. 210 imagens alinhadas em Fiji16 usando TrakEM17. A pilha original (300 imagens) deste conjunto de dados foi de 15 GB. Para reduzir o tamanho da pilha de 3.3 GB (após o alinhamento e o corte de apenas as duas células-alvo), foi reduzida em x e y por um fator de 0.2 usando Fiji e salvo como. avi filme. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementar filme S3: zoom com níveis diferentes de resolução na SEM. Filme criado em e exportados a partir do software Atlas 5 no formato. mp4. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo visa células específicas no tecido para a imagem latente em nanoescala resolução usando um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Um grande número de seções seriais de resina-incorporado material biológico é primeiro fotografado em um microscópio de luz para identificar o alvo e então em uma maneira hierárquica na SEM.

Multimodal Imaging hierárquica das seções Serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

O objetivo geral deste fluxo de trabalho é identificar certos alvos para imagens ultraestruturais dentro de um tecido usando microscopia de luz seguida de imagens 3D em um MEV em resolução muito alta. O fluxo de trabalho de imagem apresentado aqui pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a ultraestrutura celular ou tecidual em vários campos, como biologia celular, biologia do desenvolvimento, neurociência ou mesmo patologia. A principal vantagem da técnica, que na verdade é baseada na tomografia de matriz, é que o corte do tecido em matrizes de seções seriais facilita a identificação das estruturas-alvo, mesmo quando inicialmente elas estão enterradas dentro do volume da amostra original.A tomografia de matriz foi originalmente introduzida em um contexto de neurociência, mas também pode ser aplicada a uma ampla gama de outros sistemas, incluindo bactérias, plantas, animais e até amostras de pacientes em um ambiente de patologia. Indivíduos novos neste método terão dificuldades porque coletar muitas seções em série é muito difícil. Trabalhar sem suporte adicional pode causar perda de seções ou desarranjo das fitas.Usando uma pequena escova formada por alguns fios de cabelo fixados a um palito, cubra cuidadosamente os lados dianteiro e traseiro de um bloco pré-aparado com uma mistura adesiva. Execute esta etapa rapidamente porque o solvente dessa mistura evapora em segundos. Enquanto as amostras secam, corte pedaços de pastilhas de silício em um tamanho que caiba no barco da faca e marque-os com um riscador de diamante.Em seguida, limpe o wafer de silício manualmente com isopropanol e tecido sem fiapos. Fixe o substrato em uma extremidade da placa de suporte usando um adesivo removível. Uma vez endurecido, o plasma ativa o substrato usando descarga incandescente com ar para obter uma superfície hidrofílica.Com o substrato montado mais próximo do fio da navalha, insira o suporte no clamp do suporte do substrato. Em seguida, insira uma faca de diamante jumbo no porta-faca e ajuste o ângulo de folga para zero grau. Em seguida, encha o barco de facas com água destilada.Aproxime-se da faca de forma que fique a um a dois milímetros da amostra. Em seguida, abaixe o substrato na água usando os parafusos de um a três do suporte do substrato. Verifique se a linha de água está localizada no terço superior do substrato.Como é difícil ver a distância ao solo ao usar um wafer de silício, abaixe o substrato até sentir que ele toca o chão. Em seguida, levante um pouco o substrato. Certifique-se de que nem o substrato nem o transportador toquem no barco da faca durante o corte.Em seguida, use uma seringa ou pipeta para ajustar o nível da água no barco. Enquanto observa através do binóculo, adicione ou remova água até que toda a área da superfície da água mostre um reflexo homogêneo da iluminação da luz superior do ultramicrótomo. Quando a configuração estiver concluída, comece a seccionar a amostra.Quando várias seções tiverem sido cortadas, interrompa o processo de corte e solte a fita do fio da faca acariciando suavemente o fio da faca com um cílio ou um pêlo de gato muito macio. Manipule a fita em direção ao substrato e empurre suavemente a primeira seção da fita para prendê-la à parte seca do substrato. Continue seccionando a amostra e anexando as fitas ao substrato.Comece de um lado do substrato e mova-se gradualmente em direção ao outro a cada nova fita. Quando o substrato estiver completamente coberto com fitas, levante suavemente o substrato do barco da faca usando os parafusos do micromanipulador do suporte do substrato. Deixe o conjunto de fitas secar e guarde-o em um ambiente livre de poeira.Após a secagem, remova o substrato montado com adesivo o mais rápido possível do suporte. Em seguida, core sua amostra para microscopia de luz conforme descrito no protocolo de texto que acompanha e realize imagens. Em seguida, core a amostra para microscopia eletrônica e monte-a em pontas de alumínio com uma almofada de carbono pegajosa.Agora imagine essas matrizes no microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo. Para evitar o carregamento, use energias de elétrons primários de três kV ou menos e uma corrente de feixe entre 50 e 800 picoamperes. Ao usar lamínulas de vidro revestidas com ITO, conecte a superfície condutora ao suporte do microscópio com fita de cobre e tinta prateada.O primeiro passo na cascata de imagens hierárquicas é gerar uma visão geral da matriz de forma que as seções individuais possam ser reconhecidas. Primeiro, defina os quatro cantos de sua matriz representando graficamente uma imagem de cada canto com baixa ampliação, cerca de 100x, e crie um ROI envolvendo toda a matriz. Atribua um protocolo de imagem a esse ROI com os seguintes parâmetros.Use o detector de elétrons secundário para imagens de alta velocidade usando um tempo de permanência curto de cerca de 0,2 microssegundos. Escolha um tamanho de pixel de imagem grande e um tamanho de bloco de 2000 por 2000 pixels. O resultado é uma imagem muito ruidosa, mas mesmo aqui, o tecido dentro da seção é visível.Em seguida, gere um conjunto de seções criando uma região de interesse, delineando apenas o tecido na primeira seção. Clone-o em todas as seções subsequentes usando a ferramenta de carimbo. Gire as regiões de interesse quando necessário para acomodar fitas dobradas.Atribua um protocolo à seção que melhor exibe a subestrutura do tecido. Aqui, um tamanho de pixel intermediário de 60 nanômetros, um tamanho de bloco de 12000 por 12000 pixels e um tempo de permanência de 3,2 microssegundos foi usado. Devido à baixa qualidade, um segundo conjunto de seções descrevendo algumas células selecionadas foi criado usando um tamanho de pixel menor e um detector mais sensível.Agora é possível reconhecer muito bem as duas células-alvo. Crie um conjunto de locais dentro do conjunto de seções que contém a estrutura de destino para imagens SEM de resolução mais alta. Torne a região de interesse grande o suficiente para levar em conta a precisão em etapas.Verifique e ajuste as posições dos sites. O ajuste automático é necessário quando muitas seções são fotografadas. É importante colocar as regiões de interesse para que o centro não fique sobre material vazio sem detalhes estruturais, por exemplo, vacúolos.Em seguida, defina as configurações de foco automático e verifique o desempenho da imagem ao longo do comprimento de uma fita em uma pequena região de interesse próxima ao local que será fotografado. Em seguida, defina um protocolo de imagem para a aquisição de MEV de alta resolução. Para ver os compartimentos da membrana, escolha um tamanho de pixel de imagem entre três e cinco nanômetros.Selecione um tempo de permanência dependendo do detector para que a imagem não fique muito barulhenta. Como o estágio precisa percorrer uma grande distância entre a gravação desta e desta seção, defina os valores de foco em pelo menos a primeira seção de cada faixa de opções usando a opção de protocolo de verificação. Em seguida, inicie a imagem SEM automatizada em toda a série de regiões-alvo de interesse.Quando terminar, exporte os dados adquiridos como uma série de imagens, de preferência no formato TIF. Importe séries de imagens para Fiji como uma pilha virtual. Em seguida, corte a pilha para processamento posterior, aparando a área o mais próximo possível da estrutura de interesse.Além disso, ajuste o brilho e o contraste e salve a pilha. Uma vez cortado e otimizado, abra um novo TrakEM no menu Arquivo. Clique com o botão direito do mouse no campo da imagem e importe a pilha para o TrakEM como uma fatia por camada.Ao clicar com o botão direito, escolha Alinhar camadas. Escolha mínimos quadrados como modo, defina o intervalo do primeiro ao último e escolha nenhum como referência. Em seguida, selecione os valores de configuração padrão e escolha Rígido como a transformação desejada.Quando o registro estiver concluído e satisfatório, salve o conjunto de dados alinhado clicando com o botão direito do mouse e escolhendo Exportar. Faça uma imagem plana, defina o intervalo da primeira à última imagem e deixe o software mostrar a pilha resultante. Quando terminar, salve a pilha no formato TIF.Após a preparação, a matriz de seção aparece como uma matriz que consiste em várias faixas de seções seriais. Esta seção mostra uma visão geral de uma ponta de raiz de arabidopsis, corada com iodeto de propídio. As seções sequenciais desta amostra foram alinhadas conforme descrito no protocolo e combinadas para mostrar a amostra em 3D como um único arquivo de filme.Aqui, pode-se ver as duas células-alvo que mais tarde serão fotografadas em resolução nanométrica no SEM. Após coloração adicional com acetato de uranila e citrato sanguíneo, as matrizes foram fotografadas no microscópio eletrônico. Esta imagem estática mostra a seção da amostra fotografada pela primeira vez com resolução de 20 nanômetros e na segunda rodada de imagens, com resolução de cinco nanômetros.Aqui, 210 imagens sequenciais do microscópio eletrônico foram alinhadas e cortadas conforme descrito no protocolo. O vídeo tem como alvo apenas duas células e mostra como os vacúolos dentro das células são organizados e às vezes conectados em 3D. A imagem hierárquica automatizada das matrizes no SEM mostrado aqui pode fornecer mapeamento contínuo em diferentes níveis de resolução, desde uma visão geral de toda a matriz até detalhes subcelulares.Na maior ampliação, vacúolos, mitocôndrias, núcleo e retículo endoplasmático são reconhecíveis. Uma vez dominado, a colocação de fitas de seção lado a lado em um substrato típico pode ser feita em poucas horas se for executada corretamente. Isso pode fornecer centenas de seções em um substrato para imagens.O tempo de imagem para um número tão grande de seções pode variar de um microscópio para outro, ainda mais se seus instrumentos de imagem favoritos tiverem diferentes níveis de automação. É interessante notar que o fluxo de trabalho geral pode ser facilmente combinado com outras técnicas de imagem, como coloração histo padrão ou mesmo candoluminescência, ou simplesmente pode ser usado como ferramenta autônoma para imagens artoestruturais de grandes volumes. Outro aspecto desse fluxo de trabalho é a fácil acessibilidade.Os estudos iniciais são viáveis sem ferramentas adicionais ou automação, o que significa sem grandes investimentos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia sobre o fluxo de trabalho e como a imagem multimodal e hierárquica pode ser usada para direcionar e criar imagens de estruturas interessantes em um grande volume 3D em diferentes níveis de resolução.

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