Um Método de Imagem Óptica Compatível com Microscopia Eletrônica de Varredura para Mapeamento Cerebral Mesoscópico de Todas as Células

Nossa pesquisa foca em conectômica. Desenvolvemos metodologias de aquisição óptica ou de imagem eletrônica de alto rendimento, permitindo a análise de um circuito neuro e de características de conectividade sináptica para decifrar a lógica fundamental de conexão dos circuitos neuro. A conectômica original de alta revolução é limitada a pequenos volumes cerebrais devido à aquisição de dados custosas e precisamente, enquanto a análise microscópica rápida e o estudo microscópico direcionado oferecem potencial para conectômica cerebral inteira.

Comparado a outras abordagens microscópicas, como vários microscópios Larsens, o OMLIT captura imagens de todos os neurônios com informações de preocupação com dendritos e axônios. Além de sua compatibilidade com microscópio eletrônico, há imagens adicionais de resolução nanométrica sob EF. O OMLIT ajuda a construir modelos cerebrais abrangentes, mapeando todas as projeções de longo alcance, incluindo sua direção, intensidade e tipo, junto com os microcircuitos locais em combinação com o tema serial. Ele oferece uma visão sobre a arquitetura estruturada e o fluxo de informações em todo o cérebro.

Estamos desenvolvendo imagens automatizadas de OMLIT e aquisição de dados EM guiadas por RIs definidas por OMLIT, permitindo coleta e análise eficiente de dados conectômicos em volumes grandes ou inteiros do cérebro. Para começar, selecione um filme capton ou D50 com espessura de 50 micrômetros e montado no sistema motorizado de enrolamento. Usando um sistema de sputtering magnetron de cabeça dupla, deposite uma película fina uniforme de cromo ou outros metais, como alumínio, prata ou cobre, sobre a superfície da fita.

Posicione a fita a uma distância de 80 milímetros do alvo que engasga. Realize o processo sob corrente contínua e a uma pressão de um pascal regulada por 99,99% de gás argônio. Agora, ajuste a velocidade de enrolamento da fita para 0,6 milímetros por segundo para alcançar uma espessura do revestimento metálico de 50 nanômetros.

Após a deposição, retire a fita do sistema assim que ela esfriar até a temperatura ambiente. Avalie a espessura e uniformidade do revestimento, utilizando um perfilador de stylus, microscopia de força atômica ou microscopia eletrônica de varredura. Para uma estratégia de baixa refletividade, limpe e torne a fita hidrofílica usando um limpador de plasma a 80 watts de potência enquanto a fita se move a sete milímetros por segundo.

Após o tratamento, coloque gotas de água na superfície da fita para confirmar que elas se espalham rapidamente em uma película fina. Usando um pequeno moedor ou ferramenta de corte similar, corte grosseiramente a resina do lado da amostra para remover a resina em branco ao redor e expor a área da amostra. Coloque o bloco embutido na resina no suporte da amostra e aperte para fixar firmemente o bloco.

Monte o suporte da amostra no braço móvel do micrótomo. Instale uma faca de vidro ou de corte de diamante em um ângulo de 45 graus no suporte da faca. Ao microscópio, corte a superfície da amostra em formato de pirâmide e a alise, depois apare e alise os quatro lados do bloco da amostra para remover o excesso de resina.

Gire o botão para alinhar as bordas dianteira e traseira do bloco em posição horizontal. Remova a faca de corte e substitua por uma faca de diamante, posicionada em um ângulo de 45 graus. Ajuste o ângulo de inclinação da base do microtomo para seis graus e mova o suporte da faca lentamente usando o botão até que a borda frontal da faca esteja entre um e dois milímetros da superfície da amostra.

Observe a faixa brilhante entre a superfície da amostra e a lâmina da faca, e ajuste o ângulo de inclinação para que a faixa fique uniforme de cima para baixo e de um lado para o outro. Agora, injete água destilada na ranhura da faca de diamante para molhar a lâmina. Remova um pouco de água com uma seringa até o nível do líquido cair e o reflexo parecer prateado.

Em seguida, defina a espessura da seção, a velocidade de corte e a janela de corte na unidade de controle. Ajuste a velocidade de corte para 0,6 milímetros por segundo e a espessura da seção para 60 nanômetros, dependendo da qualidade da amostra. Comece a seccionar com o micrótomo.

Uma vez produzidas seções estáveis e uniformes, pause o processo. Depois, use um pincel fino para remover partes cortadas e detritos. Agora instale tanto o carretel de fita revestida quanto um carretel vazio de recolha no sistema automático de coleta de seção ultra fina.

Fixe o mecanismo de travamento e realize um teste para confirmar o movimento suave da fita em velocidade constante e a coleta adequada no carretel de recolha. Mergulhe a cabeça de coleta do dispositivo de coleta com fita no banho-maria da faca de diamante e ajuste a cabeça para ficar paralela à lâmina da faca a 1,5 vezes o comprimento da fatia da amostra. Segure o dispositivo de coleta e retome a seção enquanto executa simultaneamente o dispositivo de coleta de fita.

Após coletar seções contínuas suficientes, pause a secção. Corte a fita em uma área sem seções. Execute o dispositivo de coleta de fita até que toda a fita esteja enrolada no carretel.

Em seguida, remova o carretel e coloque-o em um forno eletrônico de secagem. Limpe o dispositivo de coleta de fita e o microtomo e devolva todos os acessórios aos seus lugares corretos. Para montagem em uma pastilha de silício, remova a película protetora transparente da fita condutora dupla.

Aplique a fita paralelamente à fita condutora dupla, colocando até três segmentos de fita em cada peça. Coloque a pastilha de silício no palco do microscópio óptico e prenda-a com fita adesiva anti-resíduos. Use uma lente objetiva de cinco X para obter uma imagem geral da pastilha de silício, da fita e da amostra.

Na imagem de visão geral, delinee cada seção e ordene-as, depois adicione pontos de foco e exposição para realizar imagens automáticas com ampliação de 20 ou 50 X em toda a pastilha. Após a imagem, salve as imagens e verifique sua qualidade, refocando e reimaginando se alguma estiver fora de foco ou de baixa qualidade. Importe a pilha de imagens TIFF para o VAST 22 selecionando importar, seguido de importar volume de imagem das imagens para o arquivo VSV.

Conecte um tablet externo e use a ferramenta pincel e o modo de segmentação para segmentar e traçar manualmente as estruturas. Use as teclas de atalho A e Z para navegar entre fatias de imagem. Agora, visualize a estrutura segmentada em três dimensões selecionando janela, seguida de visualizador 3D, visualize e atualize.

Por fim, salve os resultados da segmentação após selecionar o arquivo e salvar a segmentação. Nas imagens de alta refletividade, as regiões do lúmen citoplasmático e vascular apresentaram maior intensidade em comparação com as áreas ao redor, enquanto nas imagens de baixa refletividade, as regiões do lúmen citoplasmático e vascular apresentaram menor intensidade. Resultados quantificados demonstraram que as estratégias de alta e baixa reflectividade demonstraram.

Cada um tinha vantagens em termos de contraste e entropia da informação. A microscopia óptica da OMLIT permitiu a identificação de axônios, vasos sanguíneos, corpos celulares e dendritos. A segmentação manual de imagens de omeletas, usando VAST, mostrou numerosos corpos celulares, dendritos e axônios bem organizados.

Os resultados segmentados foram combinados com a imagem original para produzir uma visualização tridimensional. Imagens OMLIT ampliadas mostraram resolução insuficiente para revelar estruturas mais finas. Imagens de microscopia eletrônica da mesma região revelaram sinapses, mitocôndrias, núcleos celulares e vesículas.