Microscopia confocal revela agregação de receptores de superfície celular através de espectroscopia de correlação de imagem

O objetivo geral deste protocolo de espectroscopia de correlação de imagem é fornecer uma metodologia acessível para a quantificação de eventos de agrupamento que ocorrem na superfície da célula. Anticorpos que se ligam a receptores na superfície celular podem conferir alterações de confirmação e agrupamento. Análises desses processos dinâmicos são importantes para a caracterização de alvos de drogas.

A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma metodologia acessível para a quantificação de eventos de agrupamento na superfície celular usando aparelhos de imagem de fácil acesso. Para começar, semeie 10.000 células de carcinoma epidermóide A431 em cada poço de uma lâmina de imagem de oito câmaras. No dia seguinte, adicione 100 nanogramas por mililitro de ligante EGF imediatamente às células para estimular a agregação do receptor EGF.

Incube as células com o ligante em temperatura ambiente por 10 minutos antes de fixá-las. Em seguida, siga o protocolo de imunocitoquímica e imagens confocais no protocolo de texto que o acompanha, prestando muita atenção às configurações usadas durante a coleta e carregue os conjuntos de dados adquiridos em Fiji. A saturação excessiva deve ser evitada.

As imagens finais devem conter tamanhos de pixel inferiores a 1 mícron ao quadrado. Além disso, capture uma superfície plana na superfície apical ou basal, bem como uma região livre de células para posterior normalização da amostra. Comece identificando a região apical ou basal da membrana da superfície celular de interesse na primeira imagem.

Selecione um tamanho de pixel de 2 elevado a n no intervalo de 256 por 256, 128 por 128 ou 64 por 64. Em seguida, vá para o menu de imagem e selecione duplicar. Em seguida, vá para analisar e desça para as medições.

Calcule a intensidade média da área de interesse recortada. Agora, identifique uma região de fundo do mesmo tamanho da imagem original. Duplique-o como antes.

E calcule a intensidade média da área de interesse recortada de fundo. Com a área de interesse e o plano de fundo medidos, vá para processar e selecione calculadora de imagens. Coloque a área de interesse como Imagem 1 e a imagem de fundo como Imagem 2 e selecione subtrair como a operação.

Em seguida, vá para o menu de processo. Vá até FFT e selecione FD Math. Na caixa de diálogo matemática FFT, selecione inserir as imagens como mostrado aqui e defina a operação como correlacionada.

Certifique-se de que a transformação inversa esteja ativada. Normalize a imagem resultante selecionando processo, rolando para baixo até matemática, selecionando dividir e inserindo o número total de pixels na caixa de diálogo. Em seguida, normalize novamente dividindo pela intensidade média da área recortada normalizada ao quadrado.

Em seguida, desenhe uma linha através da função de propagação de pontos. Plote o perfil desta linha para calcular o valor de pico indo para analisar e selecionando perfil de plotagem. Calcule os agrupamentos por área de viga transferindo o valor de pico para uma planilha.

Em seguida, defina os clusters por área de feixe igual a um sobre o valor de pico menos um. Para processar as imagens em lote, é recomendável que uma macro Fiji seja estabelecida. Isso permite uma análise consistente e rápida de várias imagens confocais para análise de espectroscopia de correlação de imagem.

Para estabelecer uma macro para o fluxo de trabalho da espectroscopia de correlação de imagem, configure o programa para registrar cada comando de menu no protocolo. Para isso, vá para plug-ins, até marcos, e selecione gravar. Em seguida, volte para a janela principal e execute o protocolo descrito na seção anterior deste vídeo.

Quando terminar, retorne à janela de macro e selecione criar para gerar uma macro. Em seguida, na janela de edição de macro, certifique-se de selecionar o idioma como macro LJ1. Se não for selecionado, o programa não poderá ser executado.

Por fim, salve a macro. A função de transferência óptica de um microscópio garante que mesmo objetos de tamanho molecular apareçam como imagens entre 200 e 300 nanômetros no plano XY. Ao obter imagens de esferas de fresina de sub-resolução da mesma forma que as células, conforme descrito neste protocolo, a área da função de propagação de pontos do microscópio pode ser calculada.

Essas imagens representam células de carcinoma epidermóide A431 aderentes estimuladas e não simuladas com EGF marcadas com um anticorpo primário cetuximabe direcionado ao receptor EGF da superfície celular. As caixas amarelas representam a membrana celular contendo regiões de corte com dimensões de pixel de 64 por 64. Essas imagens foram usadas para realizar análises de espectroscopia de correlação de imagem.

Após a normalização da função de autocorrelação, a função de propagação de pontos pode ser medida usando a ferramenta de linha. O perfil dessa função de linha é plotado para detectar o valor de pico. Usando esses métodos, observou-se que a estimulação com EGF induz uma diminuição de 2,56 vezes nos clusters de EGFR detectados por área de feixe em comparação com células não estimuladas.

Uma vez dominada, a análise de suas imagens confocais levará apenas alguns minutos por imagem. Ao tentar este procedimento, é importante coletar várias réplicas de cada condição experimental usando as configurações descritas neste protocolo. Seguindo este procedimento, a espectroscopia de correlação de imagem pode ser expandida para explorar as mudanças temporais de eventos de agrupamento em células vivas usando microscopia de lapso de tempo.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem estados de agregação de ordem superior usando ICS de fotobranqueamento enquanto a co-localização de duas proteínas baseadas em membrana usando metodologias de espectroscopia de correlação cruzada de imagem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como calcular o estado de agrupamento de sua molécula de superfície celular de interesse.