Name: Microscopia confocal revela agregação de receptores de superfície celular através de espectroscopia de correlação de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprenda a quantificar agregação de receptores na superfície celular usando microscopia confocal e espectroscopia de correlação de imagem. Este protocolo acessível auxilia pesquisadores em farmacologia e biologia celular.

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Os autores reconhecem o apoio financeiro de NHMRC (1084178 de bolsa de estudo e subsídios 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), câncer Austrália, Ludwig Cancer Research, John T Reid confia, cura cérebro Cancer Foundation, La Trobe University e a agência de câncer Victoria. Financiamento do programa de infra-estrutura de apoio operacional fornecido pelo governo de Victorian, Austrália também é reconhecida.

1. semeadura de linhas de células aderentes para experimento de imagem
<ol><li>Semente 10.000 células de carcinoma epidermoide A431 por bem durante a noite (O/N) em 300 µ l de mídia de Dulbecco modificado águia médio/nutriente mistura F-12 (DMEM/F-12) contendo 10% de soro Fetal bovino, 1% penicilina-estreptomicina e 1% GlutaMAX em um 8 compartimentado de imagem slide apropriado para lentes de objetivas de imersão de óleo de alta resolução (por exemplo, laboratório de NuncTM-TekTM septadas lamela).</li>
	<li>Estimule a agregação de receptores nas células A431 com adição de ligante de EGF 100 ng/mL na mídia por 10 min à temperatura ambiente (RT).</li>
</ol>2. incubação do anticorpo primário
<ol><li>Remova a mídia e lavar as células com 300 µ l de solução salina tampão fosfato de temperatura (RT) (1X PBS) duas vezes.</li>
	<li>Consertar as células com 200 µ l de paraformaldeído 4% em PBS durante 10 minutos a RT Nota: Para explorar as mudanças temporais de agregação do alvo, esta etapa de fixação deve ser omitida.</li>
	<li>Remover o PFA e lavar as células com 300 µ l de PBS da temperatura de quarto duas vezes.</li>
	<li>Incubar as células com 200 µ l de PBS contendo anticorpo primário em uma concentração de 10 µ g/mL pelo menos 2 h a 4 ° C. Nota: Para cálculos de ICS seja válida, todos os receptores presentes na superfície da célula devem ser rotulados com o anticorpo primário. Isto requer experimentos preliminares com uma série de diluição de cada anticorpo primário (01:10, 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 500 1:1, 000, etc) a ser executada. Concentração de anticorpo primário ideal é determinada através da análise da intensidade de fluorescência versus densidade do aglomerado. A concentração principal selecionada ocorre quando a densidade do aglomerado platôs com aumentando as concentrações do anticorpo primário antes de um novo aumento na densidade de cluster como resultado da ligação de anticorpo específico. O anticorpo primário pode ser diluído em meios livres de soro se realizando um experimento de tempo-curso de imagem.</li>
	<li>Após a conclusão do tempo de incubação desejado, lavam-se células com 300 µ l de PBS RT duas vezes.</li>
	<li>Bloquear a amostra com 5% albumina de soro bovino (BSA) em PBS pelo menos 2 h a 4 ° C. Nota: Amostras fixas são rotineiramente bloqueadas durante a noite (O/N), a 4 ° C.</li>
</ol>3. incubação do anticorpo secundário
<ol><li>Prepare um estoque de µ g/mL 10 de fluorescente etiquetado anticorpo secundário (por exemplo, Alexa Fluor 488 IgG) em PBS. 2 µ g/mL de Hoechst 33342 podem ser incluídos nesta diluição para permitir a descoberta de amostra melhorada no microscópio. Nota: Para experimentos de lapso de tempo, PBS podem ser trocados por meios livres de soro.</li>
	<li>Remover 5% BSA/PBS a partir das células e incubar com a solução de anticorpo secundário para 2 h a 4 ° C, ao proteger as amostras de luz ambiente.</li>
	<li>Após a conclusão do tempo de incubação do anticorpo secundário, lavar as células com 300 µ l de PBS (duas vezes) e armazenar a 4 ° C, proteger da luz ambiente.</li>
	<li>Para evitar a evaporação, enrole as bordas do slide câmara com parafilme.</li>
</ol>4. confocal microscopia de amostras
Nota: As configurações usadas para análise confocal serão diferente dependendo do equipamento e fluorophores usado na experiência individual. Instrumentos confocal modernos fornecem mecanismos para salvar todos os parâmetros de imagem utilizados no experimento no formato de arquivo de imagem nativa do instrumento. É importante que essas configurações são gravadas para fornecer para replicação apropriada das condições experimentais em diferentes períodos de aquisição de dados.
<ol><li>Durante a imagem latente de sinais fluorescentes, evite excesso de saturação. Usar uma imagem procure tabela fornece uma representação falsa cor de saturação de pixel e reduzir o ganho de detector e poder do laser em conformidade. Mais confocal instrumentos incluem uma configuração "indicador de intervalo" ou a opção análoga do software de aquisição para este.</li>
	<li>Minimize a exposição do fluoróforo de interesse para o poder do laser. O uso de uma mancha de DNA-rotulagem como Hoechst 33342 fornece um mecanismo fácil para detectar e posicionar a amostra no campo de visão antes da coleta.</li>
	<li>Executar os exames iniciais da amostra em uma resolução baixa e se o software permite uma rápida velocidade de digitalização. Isto limitará o fotobranqueamento possível da amostra.</li>
	<li>Aumentar a resolução de captura e diminuem a velocidade de varredura quando estiver pronto para coletar dados de imagem.</li>
	<li>Se o instrumento confocal permite, colete dados usando um fóton de modo a contar. Nota: Se a contagem de fótons não está disponível no instrumento: Certifique-se de níveis de cinza são lineares durante a aquisição de imagens.</li>
	<li>Defina o pinhole para cada linha de laser usada para 1 unidade arejada (AU).</li>
	<li>Linha de uso ou o quadro em média durante a aquisição de imagens (x4) para reduzir o detector associado ruído. Nota: Nesta variante de ICS como é capturado apenas um ponto do tempo-tempo de aquisição não é experimental fator de limitação.</li>
	<li>Para selecionar de coleção de imagem uma alta ampliação, objectivo de abertura numérica elevada, tais como um objectivo de plano-Apochromat, para fornecer a máxima resolução e correção de aberrações esféricas e cromáticas (exemplos incluem plano-Apochromat 100x ou 63 X /1.40 Objectivos de óleo).</li>
	<li>Oversample o tamanho dos pixels capturados contido dentro da imagem. É recomendável cada pixel capturar uma região de nm 50 x 50. Para ICS eficaz, tamanho do pixel deve ser menos de 0,1 x 0,1 µm2 por pixel. Isto é conseguido por uma combinação de aumentar o zoom em uma área relativamente pequena de digitalização e selecionar um formato de imagem relativamente grande (por exemplo, 1024 x 1024 ou 2048 x 2048 pixels).</li>
	<li>Concentre-se na superfície apical ou basal da célula em uma região tão plana quanto possível. Várias células podem ser coletadas nas regiões de interesse processados individualmente durante a análise ICS e uma imagem.</li>
	<li>Capture uma região de fundo livre de célula usando as mesmas configurações do instrumento a ser utilizado para normalização de amostra.</li>
</ol>5. cálculo de espectroscopia de correlação de imagem
Nota: A plataforma de processamento de imagens open-source, Fiji, uma distribuição do programa ImageJ, é necessário para executar a autocorrelação e funções matemáticas essenciais para ICS. Esta distribuição de ImageJ é recomendada, pois inclui inúmeros plugins pré-instalados e uma arquitetura de atualização mais fácil que pode executar operações em várias experiências de imagens.
<ol><li>Instale o programa de Fiji (http://fiji.sc/Downloads).</li>
	<li>Carrega os conjuntos de dados adquiridos.</li>
	<li>Identifica a região de superfície da membrana apical ou basal da célula de interesse e duplicar de tamanho de pixel de 2n (256x256, 128x128, 64x64). "Menu de: imagem &gt; Duplicar..."</li>
	<li>Calcular a intensidade média da área recortada de interesse "Menu: analisar &gt; medidas."</li>
	<li>Identificar uma região de fundo e duplicar para o mesmo tamanho de pixel da superfície da membrana celular de captura (2n: 256x256, 128x128, 64x64). "Menu de: imagem &gt; Duplicar..."</li>
	<li>Calcule a intensidade média do fundo cortada a área de interesse. "Menu de: analisar &gt; medidas."</li>
	<li>Subtrai a intensidade média do plano de fundo da imagem que contém a região de interesse. "Processo &gt; Calculadora de imagem &gt; subtrair."</li>
	<li>
Execute cálculos de autocorrelação. Este cálculo está contido dentro da estrutura de Menu: "processo &gt; FTT &gt; FD matemática."
	<ol>
<li>Na matemática a FD de diálogo caixa selecione: imagem 1: nome da imagem recortada, operação como correlação, imagem 2: nome da imagem recortada, transformação inversa na.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalize a imagem resultante dividindo pelo número total de pixels. "Menu de: processo &gt; matemática &gt; dividir..." (ou seja: 64 x 64 pixéis = 4096)</li>
	<li>Normalize novamente dividindo pela intensidade média do normalizado cortadas ao quadrado de área. "Menu de: processo &gt; matemática &gt; dividir..." Nota: Isto pode ser conseguido, dividindo a imagem pelo valor de intensidade média, duas vezes.</li>
	<li>Desenhe uma linha através da função de ponto de espalhar.</li>
	<li>Traça o perfil desta linha para calcular o valor de pico. "Menu de: analisar &gt; traçar perfil."</li>
	<li>Calcular os clusters por área do feixe, transferindo o valor de pico (resultado de 5.12) para uma planilha e executar o seguinte cálculo (Eq 6): <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq7v2.jpg">
</li>
</ol>6. processamento de conjuntos de dados ICS em lotes
Nota: Recomenda-se a criação de uma macro de FIJI/ImageJ para replicar os procedimentos descritos no protocolo acima. Isto permite a análise rápida e consistente de vários arquivos de imagem durante a análise de espectroscopia de correlação de imagens.
<ol><li>Estabelecer um fluxo de trabalho do ICS de macro gravando cada comando de menu no protocolo ICS "Menu de: Plugins &gt; Macros &gt; registro...".</li>
	<li>Selecione "Criar" para gerar a Macro.</li>
	<li>Selecione "Language &gt; Macro IJ1."</li>
	<li>Salve a Macro.</li>
	<li>
Adicione caixas de diálogo para várias etapas da macro, fornecendo lembretes para os operadores de cada função. Caixas de diálogo também servem como um método para pausar o processo de análise para permitir seleções apropriadas ser feita antes do tratamento subsequente (i.e., região de cultura)
	<ol>
<li>Código de Macro de caixa de diálogo title = "Título da caixa de diálogo"; MSG = "Mensagem de passo de protocolo/caixa de diálogo"; waitForUser (título, msg); Nota: Eficiências adicionais podem ser estabelecidas, assinando o site de atualização do BAR dentro o Atualizador de FIJI (instruções https://imagej.net/BAR). Isto fornece FIJI com "uma coleção de rotinas amplamente aplicáveis" 14. Um tal rotina é encontrar picos. Estrutura de menus: "BAR &gt; análise de dados &gt; localizar picos." Esse script fornece que um rápido meio de calcular que o valor de pico no perfil do ponto de espalhar a função.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. protocolo extensões: Cálculo da área do feixe do microscópio
Nota: A função de transferência óptica do microscópio garante que objetos de mesmo tamanho molecular aparecem como imagens com um raio de aproximadamente 200-300 nm no plano x-y. O protocolo ICS permite a determinação da função de ponto-propagação, realizando as etapas 4 a 5 em grânulos fluorescentes resolução sub. Especificamente:
<ol><li>Montar a resolução sub (ou seja, &lt; 100 nm de diâmetro) grânulos fluorescentes para um 8 de câmara slide de imagens.</li>
	<li>Grânulos de imagem conforme protocolo descrito usando microscópio confocal utilizado para experiências ICS.</li>
	<li>Calcule a função do ICS da imagem resultante como por etapas protocolo 5.1-5.13.</li>
	<li>Do perfil plotado, calcule o raio de raio (r) como a largura total a metade do valor máximo da função ICS.</li>
	<li>Calcule a área do feixe (BA) como (Eq 7):<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq8v2.jpg">
</li>
</ol>8. protocolo extensões: Cálculo de agregados por unidade de área
<ol><li>Calcule a densidade do aglomerado (CD) por unidade de área como (Eq 8): <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq9v2.jpg"> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq10v2.jpg">
</li>
	<li>Divida os clusters por área de feixe (resultado de 5.13) pela área do feixe (resultado de 7.5).</li>
</ol>

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<li>Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Drug+Conjugates+for+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy.</a> Biomedicines. 4 (3), 14(2016).</li>
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</ol>

Andrew M Scott tem pesquisa apoio financeiro de AbbVie Pharmaceutics, EMD Serono e Daiichi Sankyo Co e tem uma consultoria e posse conservada em estoque de produtos farmacêuticos de Ciências da vida. Os autores não têm outras filiações pertinentes ou envolvimento financeiro com qualquer organização ou entidade com um interesse financeiro em ou conflito financeiro com o assunto ou materiais discutidos no manuscrito para além dos divulgados.

A técnica de espectroscopia de correlação de imagem (ICS) que descrevemos neste protocolo usa microscópios confocal padrão sem a necessidade de detectores especializados. A técnica ICS descrita utiliza métodos de imunocitoquímica bem estabelecida para fornecer para amostragem rápida de várias condições de tratamento para a análise estatística aumentada. Esta metodologia faz isso com uma ligeira diminuição absoluta precisão em comparação com técnicas de molécula única alternativa com base na correlação das flutuações de f...

O desenvolvimento de anticorpos terapêuticos demonstrou notável sucesso no tratamento de vários tipos de tumor1. Os avanços recentes da droga-anticorpo o cojugado (ADC) como mecanismos de entrega para compostos citotóxicos expandiu-se os requisitos para a compreensão da dinâmica de interações de anticorpo: receptor na célula superfície2. Após a bem sucedida como alvo de um anticorpo para o receptor de superfície celular, estes complexos podem induzir padrões de agregação semelhantes às observadas em ligante: anticorpo interações3. Alterações na agregação do receptor podem induzir alterações da membrana e resultado na internalização do receptor e sua remoção da superfície celular. No contexto de um conjugado anticorpo-droga, esse processo posteriormente libera a carga citotóxica em endossomos interiorizados e, posteriormente, o citoplasma, resultando na morte de célula eficaz.
Microscopia confocal forneceu um meio eficaz de visualizar estes importantes interações de anticorpos e seu alvo receptores4. Para explorar as mudanças da agregação da molécula alvo na superfície da célula, este protocolo utiliza pós-processamento de imagens de microscopia confocal, através de uma imagem espacial correlação espectroscopia (ICS) técnica 5,6,7 .
A base da espectroscopia de correlação de imagem é a observação que as flutuações de intensidade de fluorescência espacial compartilham um relacionamento para o estado de densidade e agregação das estruturas etiquetadas. Essa relação é estabelecida após o cálculo de uma função de autocorrelação espacial de uma imagem capturada5.
Todas as variantes de espectroscopia de correlação de imagem requerem o cálculo de uma imagem de autocorrelação. Isto é seguido por encaixe essa função a uma curva gaussiana bidimensional para a extração de parâmetros de estado de agregação quantitativos contidos dentro da imagem. Em termos simples, o cálculo de uma imagem de autocorrelação envolve comparando todos os pares possíveis pixel contidos em uma imagem e calcular a probabilidade que ambos igualmente tão brilhante quanto o outro. Isto é visualizado como uma função da distância e direções de pixel separação8.
O quadro teórico para a espectroscopia de correlação de imagem foi estabelecido e definido por Petersen e Wiseman et al. 5 , 6. no presente protocolo, os cálculos de autocorrelação serão executados em Fiji/ImageJ, bem como um aplicativo de planilha, a base para a função de autocorrelação espacial de flutuação de intensidade pode ser descrita como (Eq. 1):
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq1v2.jpg">     
onde F representa a transformada de Fourier; F− 1 a inversa de Fourier transform; F * seu conjugado complexo; e a defasagem espacial variáveis ε e η. Em espacial ICS, conforme descrito no presente protocolo, a função de autocorrelação pode ser calculada usando um 2D fast Fourier transform algoritmo7,9. A autocorrelação no zero separação espacial, também conhecida como zero lag, g11(0,0), fornece o inverso número médio de partículas presentes por área de feixe do microscópio. Pode ser obtido por encaixe a função de autocorrelação espacial para uma função gaussiana bidimensional (Eq. 2):
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq3v2.jpg">     
Como os pixels capturados dentro de uma imagem estão contidos dentro de uma área definida, e estas medidas não se estendem ao infinito, o termo g∞ é usado como um deslocamento para dar conta de longo alcance correlações espaciais contidas dentro da imagem. Para agregados de tamanho molecular, ω é a função de ponto-propagação do microscópio e descrito pela largura total no metade-máximo da função de autocorrelação espacial. A área contida dentro da função de ponto de espalhar do instrumento pode ser calibrada com o uso de grânulos fluorescentes resolução sub.
Para o protocolo espectroscopia de correlação imagem aqui descrito, a autocorrelação e funções matemáticas necessárias para completar o ICS são executadas usando a plataforma de processamento de imagem de código-fonte aberto, Fiji10, uma distribuição do ImageJ programa11,12. Fiji/ImageJ utiliza a transformação de Fourier rápida pré-instalado na função matemática de FFT. Esta função reduz o tempo de computação necessário deste cálculo, reduzindo o intervalo de dados por um fator de dois em cada dimensão13. Como a função de autocorrelação 2D é aproximadamente simétrica em x, eixo y, uma única linha perfil trama através da imagem de autocorrelação pode ser usada para medir a autocorrelação cru como uma função do GAL espacial. Qualquer ruído zero lag é removido antes da mais cálculo, com a amplitude resultante de autocorrelação (valor de pico, g(0)T) corrigido para plano de fundo com a expressão (Eq. 3):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq4v2.jpg">     
onde eub é a intensidade média de uma região de fundo, excluindo a célula. A densidade do aglomerado, ou densidade de objetos fluorescentes, é definida por (Eq. 4):
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq5v2.jpg">    
O protocolo descrito neste documento, estamos mais simplesmente o cálculo da densidade do aglomerado (CD), com a suposição, baseada na observação de que uma função de autocorrelação normalizado irá decair para um valor de 1.0 com o aumento da defasagem espacial aproximando-se. Com lag espacial máxima, há já não qualquer correlação de fluorescência valores de intensidade e, portanto, sem uma correlação os cálculos nesta região são computação do valor de uma intensidade multiplicada por essa intensidade que é posteriormente dividida pela Praça de que a intensidade, que, por definição, é igual a 1.0. Assim, a densidade do aglomerado de uma função de autocorrelação normalizado pode ser calculada subtraindo 1.0 da função de autocorrelação normalizado antes de tomar sua recíproca (Eq. 5):
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq6v2.jpg">     
Calibração mais da área do feixe pode ser realizada para quantificar o número de clusters contidas dentro da área da função de ponto de espalhar do instrumento. Esta calibração deve ser executada usando as mesmas condições ópticas usadas durante a análise de espectroscopia de correlação de imagens.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek II Lamínula com Câmara - 8 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1x), sem vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Suplemento ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário de IgG Humano (H+L) Cross-Adsorbed Anticorpo, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck Microsphere Fluorescente Padrões 0.1&micro; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>Cetuximab</td><td>Merck Serono</td><td>3023715501</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 38mx100mm</td><td>Merck Millipore</td><td>BRND701605</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído (formaldeído) solução aquosa</td><td>ProSciTech</td><td>C004</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante EGF</td><td>R& D Sistema</td><td>236-EG</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia confocal revela agregação de receptores de superfície celular através de espectroscopia de correlação de imagem

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Microscopia confocal fornece uma metodologia acessível para capturar sub celulares interações críticas para a caracterização e desenvolvimento de agentes pré-clínicos rotulado com sondas fluorescentes. Com recentes avanços em drogas citotóxicas anticorpo com base em sistemas de distribuição, compreendendo as alterações induzidas por esses agentes dentro do Reino da agregação do receptor e internalização é de importância crítica. Este protocolo utiliza a metodologia bem estabelecida de imunocitoquímica fluorescente e a distribuição de FIJI de fonte aberta do ImageJ, com sua inerente autocorrelação e funções matemáticas de imagem, para realizar a correlação espacial de imagem espectroscopia (ICS). Este protocolo dosa a intensidade fluorescente de receptores rotuladas como uma função da área do feixe do microscópio confocal. Isto fornece uma medida quantitativa do estado de agregação de molécula alvo na superfície da célula. Esta metodologia está voltada para a caracterização de estáticas células com potencial para expandir em investigações temporais de agregação do receptor. Este protocolo apresenta uma metodologia acessível para fornecer a quantificação dos eventos que ocorrem na superfície da célula, utilizando bem estabelecida não especializada aparelhos de imagem e técnicas de clustering.

Um experimento de espectroscopia de correlação de imagem bem sucedida é dependente a correcta aplicação dos controles de tratamento. Estes grupos de tratamento incluem a análise da fluorescência em nenhum anticorpo primário e nenhum grupo de tratamento do anticorpo secundário. Uma vez que as configurações do laser confocal ideal são estabelecidas para um experimento, imagens devem ser capturadas desses grupos de controle para confirmar a ausência de fluorescência não-específica dentro da ...

Anticorpos que se ligam a receptores de alvo na superfície da pilha podem conferir alterações clusterização e conformação. Estas mudanças dinâmicas têm implicações para caracterizar o desenvolvimento de drogas em células-alvo. Este protocolo utiliza a microscopia confocal e espectroscopia de correlação de imagem através do ImageJ/FIJI para quantificar a extensão do receptor na superfície das células de clustering.

Microscopia confocal revela agregação de receptores de superfície celular através de espectroscopia de correlação de imagem

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

O objetivo geral deste protocolo de espectroscopia de correlação de imagem é fornecer uma metodologia acessível para a quantificação de eventos de agrupamento que ocorrem na superfície da célula. Anticorpos que se ligam a receptores na superfície celular podem conferir alterações de confirmação e agrupamento. Análises desses processos dinâmicos são importantes para a caracterização de alvos de drogas.A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma metodologia acessível para a quantificação de eventos de agrupamento na superfície celular usando aparelhos de imagem de fácil acesso. Para começar, semeie 10.000 células de carcinoma epidermóide A431 em cada poço de uma lâmina de imagem de oito câmaras. No dia seguinte, adicione 100 nanogramas por mililitro de ligante EGF imediatamente às células para estimular a agregação do receptor EGF.Incube as células com o ligante em temperatura ambiente por 10 minutos antes de fixá-las. Em seguida, siga o protocolo de imunocitoquímica e imagens confocais no protocolo de texto que o acompanha, prestando muita atenção às configurações usadas durante a coleta e carregue os conjuntos de dados adquiridos em Fiji. A saturação excessiva deve ser

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Neisseria meningitidis (Nm), um patógeno respiratório gram negativas humana específica, pode ligar para a saúde humana α-actinina. Aqui apresentamos um protocolo para visualização de colocalisation da bactéria intracelular com α-actinina após a entrada de bactérias em células do cérebro humano microvascular endotelial (HBMECs).

Visualização e Quantificação de Interações intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos e α-actinina por Imagem Confocal

Uma técnica para sondar o particionamento jangada lipídico de proteínas fluorescentes na membrana plasmática de células vivas é descrito. Leva vantagem da disparidade em tempos de difusão de proteínas localizadas dentro ou fora de jangadas lipídicas. A aquisição pode ser realizada de forma dinâmica em condições de controlo ou após a adição da droga.

Determinação da Raft Lipid Particionamento de Sondas marcadas com fluorescência em células vivas por Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS)

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Nós desenvolvemos uma plataforma de software que utiliza Imaris Neuroscience, ImarisXT e MATLAB para medir as alterações na morfologia de uma forma indefinida retirado tridimensional fluorescência confocal de células individuais. Esta nova abordagem pode ser utilizada para quantificar as alterações na forma da célula após a activação do receptor e, portanto, representa um instrumento adicional possível para a descoberta de drogas.

Uma ferramenta analítica que quantifica Alterações morfologia celular de imagens tridimensionais de fluorescência

Neste vídeo, demonstramos a técnica para medir as interações transcelulares entre moléculas de adesão celular sináptica por meio do ensaio de agregação de células HEK. Neste ensaio, um número igual de células HEK expressando uma molécula de adesão celular pré-sináptica desejada e uma proteína fluorescente são misturadas com células HEK expressando uma molécula de adesão celular pós-sináptica e outra proteína fluorescente. A interação entre as moléculas de adesão celular força as células a se...

Ensaio de agregação celular para detectar interações trans entre moléculas de adesão celular

Este vídeo demonstra a técnica de espectroscopia de flutuação de fluorescência (FFS) para estudar a homo-oligomerização de proteínas. As proteínas marcadas com fluorescência em uma amostra são dimerizadas usando um agente ao estudar a oligomerização de proteínas usando FFS. Usando um microscópio confocal, à medida que as proteínas se movem para dentro e para fora do pequeno volume de observação, a análise das flutuações no brilho das moléculas fluorescentes é realizada para determinar o estado...

Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Homo-Oligomerização de Proteínas

Nós descrevemos um método de imagem ao vivo de células que fornece insights sobre a dinâmica de proteínas durante o processo de ativação de células-T. Nós demonstramos a utilização combinada de a célula T-ensaio espalhamento, microscopia confocal e análise de imagens para se obter resultados quantitativos para seguir a formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T.

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

A comunicação inter-celular é crítico para controlar várias actividades fisiológicas dentro e fora da célula. Este documento descreve um protocolo para avaliar a natureza espaço-temporal de secreção das células individuais. Para conseguir isso, uma abordagem multidisciplinar é usado que integra livre-label nanoplasmonic sentindo com imagens de células vivas.

A técnica de livre-Label para a imagem espaço-temporal do Secreções única célula

Este protocolo descreve uma abordagem de baseados em espectroscopia de flutuação de fluorescência para investigar interações entre proteínas mediando as interações célula-célula, ou seja, as proteínas localizadas em cruzamentos de célula, diretamente em células vivas. Nós fornecemos orientações detalhadas na calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise, incluindo correcções de fontes possível artefato.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

Descrevemos uma abordagem de imagem para a determinação do estado oligomérico médio de oligomeros de receptores marcados por mEGFP induzidos pela ligação de ligand na membrana plasmática das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&amp;B).

Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

Aprenda a quantificar agregação de receptores na superfície celular usando microscopia confocal e espectroscopia de correlação de imagem. Este protocolo acessível auxilia pesquisadores em farmacologia e biologia celular.

Microscopia confocal revela agregação de receptores de superfície celular através de espectroscopia de correlação de imagem

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