Size Matters: Medição do diâmetro da cápsula em Cryptococcus neoformans

O objetivo geral deste procedimento é corar a cápsula polissacarídica de cepas de C. neoformans para a visualização e medição do diâmetro da cápsula. Esses métodos podem ajudar os pesquisadores na indução, imagem e medição do tamanho da cápsula em Cryptococcus neoformans. A principal vantagem das técnicas de coloração e imagem é que elas são simples, rápidas e permitem uma medição precisa do diâmetro da cápsula.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas do software podem ser confusas na primeira vez que ele é usado. O diâmetro da cápsula de Cryptococcus neoformans é frequentemente usado como uma medida de virulência. A capacidade de automatizar esse processo pode economizar um tempo significativo de análise.

Para induzir a produção de cápsulas, primeiro incube uma colônia de C. neoformans em caldo de levedura peptona dextrose a 37 graus Celsius com agitação por 18-36 horas até que a cultura esteja na fase logarítmica. No final da cultura, descasque a levedura por centrifugação e lave a levedura três vezes em PBS. Após a última lavagem, ressuspenda a levedura em duas vezes 10 elevado à quinta célula por dois mililitros de concentração de DMEM e incube a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 18 horas.

No dia seguinte, colete as células por centrifugação e remova todos, exceto os últimos 10 microlitros do sobrenadante. Para corar a levedura com tinta nanquim, ressuspenda o pellet no sobrenadante restante e transfira quatro microlitros da suspensão celular e quatro microlitros de tinta nanquim para uma lâmina de microscópio de vidro. Misture delicadamente a solução resultante sem criar bolhas.

Em seguida, coloque uma lamínula de vidro número 1,5 de espessura de 13 milímetros sobre a amostra da célula e sele as bordas com um selante não tóxico. Para corar a levedura com um corante fluorescente, ressuspenda o pellet de cultura durante a noite em 50 microlitros de PBS suplementado com 1% de soro bovino e incube as células em 55-60 microlitros de calcofluor-white e anticorpo monoclonal 18B7 de cápsula conjugada Alexa Fluor 488 por 30 minutos a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, coletar as células por centrifugação e ressuspender o pellet em 10 microlitros de PBS mais albumina de soro bovino.

Em seguida, transfira oito microlitros de células para uma lâmina de microscópio de vidro, cubra a amostra de células com uma lamínula de vidro de 13 milímetros de espessura número 1,5 e sele as bordas com um selante não tóxico. Para corar a levedura com ambos os corantes, primeiro incube as células com uma cápsula fluorescente e uma coloração da parede celular, conforme demonstrado. Em seguida, adicione quatro microlitros de células coradas com fluorescência e quatro microlitros de tinta nanquim em uma lâmina de vidro e coloque uma lamínula selada sobre a amostra de células fúngicas, conforme demonstrado.

Para obter imagens das células por microscopia de luz, selecione a objetiva de 100X e visualize pelo menos 50 células não sobrepostas por condição com tempos de exposição otimizados para maximizar o contraste da imagem e minimizar o desfoque causado por movimentos de células pequenas. Para obter imagens das células por microscopia de fluorescência, abra o software de imagem do microscópio e selecione os comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados para os fluoróforos usados. No painel de controle da pilha Z, selecione a primeira última opção.

Usando o controle de foco fino no microscópio, primeiro foque abaixo do ponto mais largo do corpo celular de uma única célula de levedura e as cápsulas para todas as células dentro do campo de visão atual e clique em definir primeiro. Em seguida, use o controle de foco fino para focar acima do ponto mais largo do corpo celular da mesma célula e da cápsula para todas as células dentro do campo de visão atual e clique em definir por último. Em seguida, abra a guia de aquisição e clique em iniciar experimento para adquirir a pilha Z para a posição atual.

Para medir manualmente os diâmetros da cápsula e da célula, abra um programa de medição de célula apropriado e selecione a imagem a ser medida. Selecione medir e use o cursor para desenhar uma linha reta através do ponto mais largo de toda a célula para medir o diâmetro total da célula. Clique em medir novamente e desenhe uma linha reta através do corpo celular para medir o diâmetro do corpo celular e abrir a próxima célula.

Quando todas as células tiverem sido medidas, salve as imagens. Para medição automatizada dos diâmetros da cápsula e da célula, primeiro abra um programa de edição de imagem apropriado e inverta todas as imagens de células manchadas com tinta nanquim. Em seguida, para importar as imagens originais e invertidas para o software de medição de células, abra o menu de arquivo no programa de medição e selecione importar sequência, carregar imagem, definir sequência manualmente, canal de dimensões, importar e aplicar.

Para detectar e mascarar o corpo celular, selecione o protocolo de fluorescência do analisador de colônias para a primeira imagem invertida de interesse e clique em aplicar. Selecione o protocolo de fluorescência do analisador de colônias novamente para segmentar as imagens invertidas do corpo celular de C.neoformans de suas cápsulas e clique em aplicar novamente para criar uma máscara de contagem. Clique com o botão direito do mouse para renomear o corpo celular da máscara de contagem e use o protocolo de proliferação celular na imagem original para detectar e mascarar a cápsula.

Clique em aplicar para criar uma máscara de contagem para a imagem original e renomeie a cápsula da máscara de contagem. Para criar uma nova máscara sobre a imagem original para particionar as cápsulas adjacentes umas das outras, selecione partição de cápsula e cápsula para a região da cápsula. Para exportar os dados, clique na planilha e, em seguida, clique no ícone exportar para planilha.

Selecione as medidas que deseja exportar e, finalmente, salve os dados. Um aumento no tamanho da cápsula é aparente na maioria das cepas pós-indução, embora algumas cepas exibam cápsulas naturalmente pequenas. Neste experimento representativo, uma diferença significativa no tamanho da cápsula foi consistentemente observada entre a maior cepa e as duas cepas menores.

Diferenças no tamanho da cápsula também podem ser detectadas usando corantes fluorescentes. A captura de imagem da pilha Z garante que o diâmetro máximo da cápsula e do corpo celular seja adquirido para cada célula. As pilhas podem então ser processadas para produzir projeções de intensidade máxima para a medição manual da cápsula celular de levedura e do diâmetro da célula.

Não há diferença significativa intra-experimento entre as medições da cápsula usando qualquer método de coloração, embora uma maior variabilidade entre experimentos seja observada ao usar tinta nanquim para medir os diâmetros das cápsulas em comparação com a coloração com corante fluorescente. Diferenças significativas nas medições do diâmetro da cápsula entre diferentes pesquisadores normalmente não são observadas, independentemente do método usado, enquanto diferenças pequenas, mas significativas, no tamanho da cápsula podem ser detectadas usando o método de medição automatizado. Para uma medição automatizada bem-sucedida, as células devem estar em foco, ter uma cápsula de médio a grande porte e não estar excessivamente agrupadas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como induzir a cápsula em Cryptococcus neoformans, corá-la usando tinta nanquim ou coloração fluorescente, obter imagens da cápsula e medi-la por meio de software automatizado.