Preparação de Microcápsulas Multifuncionais à Base de Seda Carregadas com Plasmídeos de DNA Codificadores de RNA Aptamers e Riboswitches

O significado deste protocolo é que ele fornece um meio para manter os sensores codificados em DNA funcionais, imobilizando modelos de plasmídeo de DNA em microcápsulas biocompatíveis semipermeáveis. A técnica de imobilização de DNA proposta é versátil. Permite a fabricação de biossensores multifuncionais com diferentes mecanismos de ativação in vitro.

Prevemos que essas microcápsulas, juntamente com os elementos sensores adequados, possam ser usadas para estudar diferentes processos biológicos, incluindo a liberação de moléculas de sinalização em diferentes ambientes, como biofilmes e órgãos. Essa técnica pode fornecer informações sobre os sistemas biológicos em microescala, particularmente como a imobilização do DNA e a aglomeração molecular podem afetar a cinética e o mecanismo de ativação gênica. Comece com a deposição da camada primária de polietilenoimina nas micropartículas de sílica sacrificial, ou SiO2, adicionando um mililitro de solução de polietilenoimina a 300 microlitros das micropartículas em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.

Agite a mistura em um ThermoMixer a 800 rotações por minuto em condições ambientes. Colete as micropartículas por centrifugação a 0,2 g por um minuto à temperatura ambiente e remova cuidadosamente o sobrenadante. Após 15 minutos, lavar as micropartículas quatro vezes com um mililitro de água deionizada isenta de DNase e RNase por centrifugação a 0,2 g por um minuto à temperatura ambiente, descartando o sobrenadante após cada centrifugação.

Em seguida, ajuste a concentração de plasmídeos de DNA de 50 a 200 nanogramas por microlitros com água destilada livre de DNase e RNase e use um mililitro das soluções preparadas para depositar o DNA nas micropartículas preparadas com polietilenoimina Agite suavemente a mistura de micropartículas em um ThermoMixer a quatro graus Celsius e 800 rpm por 15 minutos e, em seguida, colete as micropartículas por centrifugação a 0,2 g por um minuto. Marque os tubos para plasmídeos de DNA que codificam o riboswitch de teofilina, acoplados a GFPa1 como ThyRS-GFPa1, e plasmídeos de DNA que codificam o aptâmero de brócolis como BrocApt.

Remova cuidadosamente o sobrenadante e lave as micropartículas quatro vezes com um mililitro de água destilada livre de DNase e RNase, conforme demonstrado anteriormente, descartando o sobrenadante após cada centrifugação. Para depositar a camada de fibroína de seda, adicione um mililitro da solução aquosa de fibroína de seda reconstituída às micropartículas absorvidas pelo DNA e agite suavemente a mistura no ThermoMixer a 750 rpm por 15 minutos a 10 graus Celsius. Colete as micropartículas por centrifugação e lave-as uma vez com um mililitro de água destilada sem DNase e RNase, conforme explicado anteriormente.

Repita a centrifugação e descarte o sobrenadante. Adicione 0,5 mililitros de água destilada DNase e RNase e misture as micropartículas por vórtice. Em seguida, trate as micropartículas com 0,5 mililitros de metanol a 100% a 10 graus Celsius por cinco minutos em um ThermoMixer.

Após coletar as micropartículas por centrifugação, trate as partículas com 100% de metanol no ThermoMixer a 750 rotações por minuto por 10 minutos a 10 graus Celsius para formação de folha beta. Centrifugue a mistura a 0,2 g por um minuto a quatro graus Celsius para coletar micropartículas antes de lavá-las duas vezes com um mililitro de água destilada livre de DNase e RNase, conforme demonstrado anteriormente. Dissolva os núcleos de SiO2 das micropartículas adicionando solução de ácido fluorídrico a 8% às micropartículas do núcleo peletizado.

Transfira as soluções de partículas dissolvidas para dispositivos de diálise e dialisa-as contra água deionizada em um béquer. Em seguida, use uma pipeta de um mililitro para coletar a suspensão de microcápsulas de seda dos dispositivos de diálise em novos tubos de microcentrífuga de dois mililitros. Transfira 100 microlitros da amostra da microcápsula para um único poço de lâminas de vidro com câmara de oito poços e deixe as cápsulas sedimentarem por 20 a 30 minutos antes da imagem usando um microscópio confocal de varredura a laser, ou CLSM.

Pipetar 100 microlitros da suspensão de cápsulas em cada poço de uma lâmina de vidro com câmara. Para cada poço, adicione sequencialmente 300 microlitros da solução de fluoróforo de pesos moleculares variados, do mais baixo ao mais alto. Misture a mistura pipetando para cima e para baixo e deixe a mistura incubar por uma hora em temperatura ambiente até que a difusão das soluções de fluoróforo atinja o equilíbrio.

Mais tarde, transfira a lâmina para um CLSM para obter imagens de cada poço usando uma objetiva de imersão em óleo de 100x em um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros. Identifique a área de interesse ajustando o plano focal e concentre-se nas cápsulas que aparecem na forma de círculos de maior diâmetro. Realize a reação de transcrição/tradução in vitro adicionando sequencialmente os componentes livres de células a uma amostra de microcápsulas e incubando o tubo a 30 graus Celsius por quatro horas.

Verifique a fluorescência em um leitor de placas usando o comprimento de onda de excitação em 488 nanômetros e a emissão para o filtro GFP/FITC em cerca de 510 nanômetros. Finalmente, obtenha imagens das microcápsulas de seda no sistema CLSM usando lasers em 488 e 561 nanômetros. No estudo, foram produzidas microcápsulas robustas de fibroína de seda com um tamanho homogêneo de cerca de 4,5 micrômetros e uma espessura de casca de aproximadamente 500 nanômetros.

A permeabilidade das conchas ocas da cápsula de fibroína de seda foi analisada seguindo o método de corte de peso molecular. Um aumento na concentração de uma camada primária de polietilenoimina leva ao aumento da estabilidade coloidal de microcápsulas com conchas mais permeáveis, enquanto a eliminação da camada primária causa agregação de cápsulas com membranas de casca menos permeáveis. A cinética de expressão de GFPa1 durante a ativação de ThyRS revelou maior ativação do gene GFPa1 a partir de plasmídeos de DNA carregados em microcápsulas de seda do que o DNA não encapsulado de controle.

Na análise representativa, são exibidas imagens CLSM de cápsulas de fibroína de seda carregadas com 32 cópias de DNA por cápsula antes e depois da incubação no sistema de transcrição in vitro, tradução. Os perfis de intensidade transversal das cápsulas de fibroína de seda demonstraram a expressão de GFPa1. A cinética de transcrição de 20 microcápsulas de seda em camadas carregadas com 30 cópias de DNA por cápsula foi comparada com o DNA não encapsulado de controle.

O sinal de saída mais alto das microcápsulas de seda do que as amostras de DNA não encapsuladas de concentrações equivalentes confirmou a efetividade das microcápsulas de seda. Seguindo este protocolo, várias técnicas de microscopia de alta resolução podem ser aplicadas para emaranhamento de DNA de imagem no estado imobilizado e processo de ativação gênica desacoplada in vitro. Essa técnica pode ser aplicada para responder à dinâmica em nível molecular em células artificiais mínimas.

Especificamente, quando acopladas a elementos genéticos adequados, as microcápsulas podem ser usadas para estudar a comunicação célula a célula.