Um procedimento abrangente para avaliar o desempenho In Vitro da neovascularização de Hemangioblastoma putativo usando o Spheroid brotando do ensaio

O objetivo geral deste experimento é avaliar o desempenho da possível neovascularização do hemangioblastoma usando o ensaio de brotamento esferóide in vitro. O método pode ajudar a responder às principais questões no campo angiogênico, como a angiogênese tumoral. A principal vantagem desta técnica é que o produto de um procedimento abrangente para avaliar in vitro onde a angiogênese tumoral clássica existe no hemangioblastoma e cresce no hemangioblastoma.

A implicação dessa técnica se estende à terapia do hemangioblasto e da vasculatura, pois o resultado destaca a complexidade do hemangioblasto ou da neovascularização, o que sugere que essa forma comum de angiogênese é apenas um mecanismo complementar. Portanto, este método pode fornecer informações sobre o estudo do hemangioblasto ou neovascularização. Também pode ser aplicado a tumores, angiogênese e aplicação relacionada à vasculogênese em alguns tumores sólidos, como mimetismo vasculogênico tumoral em tumor de vidro.

A demonstração real deste método é crítica, pois a geração dessas etapas esferóides de células endoteliais manipuladas é difícil de aprender. Porque a condição adequada é importante. Primeiro, cultive as células endoteliais HUVEC em meio de cultura DMEM suplementado com dez por cento de soro fetal bovino, penicilina e estreptomicina.

Em seguida, mantenha a cultura na incubadora a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono. Em seguida, para sintetizar o fragmento de shRNA, digerir o plasmídeo com enzimas de restrição ApaI e EcoRI. Em seguida, ao plasmídeo digerido, adicione os oligos direto e reverso, tampão NEB 10x e água destilada dupla para um volume final de 50 microlitros.

Depois de adicionar todos os reagentes, aqueça a mistura a 98 graus Celsius por quatro minutos. Em seguida, esfrie gradualmente até a temperatura ambiente em um período de algumas horas. Use a ligase T4 para ligar os oligos recozidos e o plasmídeo.

Incube o tubo a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione cinco microlitros de mistura de ligação a 25 microlitros de células competentes para DH5alfa. Em 500 microlitros de meio DMEM, adicione o vetor lentiviral ou o vetor embaralhado, juntamente com outros plasmídeos de embalagem.

Em seguida, incube a mistura lentiviral por 25 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione 7 mililitros do meio DMEM à solução misturada ou lentiviral. Cultive as células de 293FT em meio DMEM sem soro fetal bovino em uma placa de cultura de 10 centímetros.

Adicione um mililitro da solução lentiviral ou mexida às células de 293 pés na placa de cultura. Após seis horas, aspire o meio antigo do prato de cultura. Em seguida, substitua o meio antigo por meio DMEM fresco contendo 10% de soro bovino fetal.

Após 48 horas, colete o meio. Transferir as células endoteliais HUVEC para o meio lentiviral e conservar durante 72 horas. Em seguida, adicione dois microgramas por mililitro de puromicina ao meio de cultura de células HUVEC.

Por fim, incube a cultura por mais 24 horas. No dia seguinte, adicione um mililitro de tripsina EDTA para tripsinizar as células HUVEC. Em seguida, ressuspenda a suspensão de células tripsinizadas em meio DMEM com soro bovino fetal a 10%.

Conte o número de células usando um contador de células. Após a contagem, semeie as células em uma placa de fundo redondo 3D de 96 poços. Após a semeadura, incube as células a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono por 72 horas continuamente.

Após 36 horas, substitua metade do meio de cultura por meio fresco. Primeiro, descongele a solução de gel a quatro graus Celsius e, em seguida, dilua-a na proporção de um para cinco com o meio de soro reduzido. Aspire os esferóides do meio DMEM usando uma micropipeta.

Em seguida, lave os esferóides com cinco mililitros de meio de soro reduzido. Transfira cuidadosamente os esferóides suspensos e o gel diluído. Em uma placa de 15 poços, embeba 300 microlitros do líquido misturado de esferóides e gel diluído.

Incube a placa a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, adicione 400 microlitros de meio de soro reduzido a um único poço. Para evitar a evaporação, encha o entorno do poço com água estéril.

Em seguida, cultive as células a 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono e 100 por cento de umidade por uma hora. Após a incubação, aspire o meio antigo e adicione 600 microlitros de meio de soro reduzido com um por cento de suplemento de crescimento de células endoteliais ao poço e incube por um dia. Capture imagens usando um microscópio de luz invertida.

Aqui, o brotamento esferóide das células é capturado usando microscópio de luz invertida para estudar o efeito do silenciamento do gene VHL no potencial angiogênico das células endoteliais. Um esferóide é visto brotando 12 horas após o tratamento lentiviral nas células endoteliais silenciadas de controle e VHL. Em seguida, é realizada análise estatística para quantificar o comprimento dos brotos gerados pelos esferoides silenciados do gene VHL.

O comprimento médio dos brotos parece ser de cerca de 125 micrômetros nos grupos silenciados da VHL, enquanto é de apenas cerca de 65 micrômetros no grupo controle. O comprimento médio acumulado de brotos do grupo silenciado VHL é de aproximadamente 1250 micrômetros, enquanto o do grupo controle é de 680 micrômetros. Esses resultados indicam um aumento de duas vezes no comprimento dos brotos nos grupos silenciados da BVS.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 48 horas se for executada corretamente. Seguindo este procedimento e método, como ensaio de formação capilar, pode ser realizado para responder a perguntas adicionais. Como explorar a capacidade angiogênica das células endoteliais vasculares.

Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da angiogênese explorarem a vasculorização interna do tumor. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de quais genes perdem uma função em células endoteliais manipuladas usadas para ensaio de explosão.