Name: Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprenda a desenvolver dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de células vegetais de ponta-cultivo, como tubos polínicos e protonemas de musgo, em espaços confinados de micrometragem.

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Agradecemos Tsutsui H. e m. Kurihara fornecendo-nos com plantas transgénicas, incluindo o T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato e a linha do UBQ10pro::H2B-amor da. thaliana , respectivamente. Este trabalho foi financiado pelo Instituto de transformadora Bio-moléculas de Universidade de Nagoya e a rede de ciência avançada planta Japão. Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido por subvenções do Japão de ciência e tecnologia agência (projeto ERATO conceder n. JPMJER1004 por T.H.), um subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (n º s. JP16H06465 e JP16H06464 por T.H.) e da sociedade para a promoção da ciência (JSPS) Grants-in-Aid para pesquisa exploratória desafiador (concessão n. º 26600061 para N.Y. e grant n 25650075 e 15 K 14542 para Y.S.) Japão.

1. fabricação do Microdevice PDMS para examinar crescendo tubos de pólen e musgo Protonemata
Nota: Usamos um instrumento photolithography maskless preparar moldes PDMS em pastilhas de silício. Os detalhes sobre a operação do sistema são omitidos neste manuscrito. Uma técnica de fotolitografia padrão9 usando uma Fotomáscara também pode ser usado para criar os moldes PDMS descritos neste manuscrito.
<ol><li>Despeje a 11 g de mistura de pré-polímero PDMS (elastômero base: cura agente na proporção de 10:1) em cada molde de 4 polegadas.</li>
	<li>Desgaseifica o molde preparado no passo 1.1 por 20 min em uma câmara de vácuo.</li>
	<li>Após a cura a 65 ° C por 90 min em um forno de convecção não, descasque a camada PDMS fora do molde e fazem furos de acesso nos canais de fluídico usando socos de biópsia. Nota: Para o dispositivo de tubo de pólen, o tamanho do furo deve ser ajustado para refletir o diâmetro do pistilo. Este valor irá variar, portanto, por espécie. Neste experimento, nós socou um furo de 1 mm para as entradas de pistilo e furos de 1,5 mm para reservatórios de líquido médios. Para o dispositivo de protonemata de musgo, utilizou-se um buraco de 4mm para o reservatório de amostra.</li>
	<li>Expor a camada PDMS e um prato fundo de vidro (3,5 a 5 cm de diâmetro) para ar de plasma de 50 s.</li>
	<li>Pressione a camada PDMS em prato de vidro inferior e calor a 65 ° C por 30 min em um forno de convecção não para selar completamente fora da rede microfluidic.</li>
</ol>2. fabricação do Microdevice PDMS para cabelos de raiz
<ol><li>Repita os passos usando os moldes para preparar duas camadas PDMS para a raiz e a raiz do cabelo microdevices 1.1-1.3. Nota: Utilizamos um buraco de 2 milímetros para os reservatórios médios líquidos em microdevice a raiz.</li>
	<li>Expor as duas camadas PDMS para ar plasma para 50 s.</li>
	<li>Monte as duas camadas PDMS sob um estereomicroscópio usando um alinhador de área de trabalho sob medida. Nota: Os microcanais sobre essas camadas PDMS devem enfrentar uns aos outros. Antes da montagem, certifique-se de que as marcas de alinhamento em ambas as camadas igualar-se.</li>
	<li>Aqueça a 65 ° C por 30 min em um forno de convecção não para selar completamente fora da rede microfluidic.</li>
	<li>Remova o microdevice construído o deslizamento da tampa e coloque o aparelho sobre um prato fundo de vidro que é de 5 cm de diâmetro.</li>
</ol>3. preparação do meio de cultura In Vitro e celular para tubos de pólen (Torenia fournieri)
<ol><li>Prepare a meio do Nitsch modificados conforme descrito anteriormente,15 e autoclave o suporte a 121 ° C por 20 min. Nota: A composição do meio do Nitsch o modificado é NH4não3 (80 mg/L), KNO3 (125 mg/L), Ca (NO3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2PO4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), O (0,5 mg/L), ZnSO4‧7H2H3BO3 (10 mg/L), O (0,025 mg/L), at2MoO4‧2H2O (0,025 mg/L), CuSO4‧5H2 sacarose (50.000 mg/L) e a caseína (500 mg/L). O médium preparado pode ser armazenado a 4 ° C por 4 meses pelo menos.</li>
	<li>Preparar o glicol de polietileno 26% (p/v) usando água destilada esterilizada e filtrar a solução com um filtro de porosidade de 0,3 µm. Nota: O meio preparado pode ser armazenado a 4 ° C, durante 1 mês.</li>
	<li>Misture os reagentes preparados na etapa 3.1 e 3.2 na proporção de 1:1 (v/v). Nota: Este meio deve ser preparado fresca para cada uso.</li>
</ol>4. preparação de meio de cultura In Vitro celular para cabelos de raiz (Arabidopsis thaliana)
<ol><li>Prepare uma solução de sacarose a 1% (p/v) Murashige & Skoog médio, 0,05% (p/v) MES, 0.215% (p/v) e ágar de 1% (p/v) em água desionizada. Autoclave a solução a 121 ° C por 20 min.</li>
</ol>5. preparação do meio de cultura In Vitro e celular para Protonemata Moss (Physcomitrella patens)
<ol><li>Pre-incube a protonemata de musgo no médio BCDAT16 em uma placa de Petri. Nota: A composição do meio BCDAT é 1 mM de MgSO4, 10mm KNO3, 45 µM Filipa4, 1.8 mM KH2PO4 (pH ajustado para 6.5 com KOH), oligoelemento solução (0,22 µM CuSO4, 0,19 µM ZnSO4, 10 µM H3BO 3, 0.1 µM Na2MoO4, 2 µM MnCl2, 0.23 µM CoCl2e 0.17 µM KI), 1 mM CaCl2e 5 mM diamónio (+)-tartarato.</li>
	<li>O musgo no meio de BCDATG na microdevice de cultura. Nota: O meio BCDATG é médio BCDAT com glicose 0,5% (p/v). O médium preparado pode ser armazenado a 4 ° C para 1 mês.</li>
</ol>6. Culturing in Vitro de T. fournieri tubos de pólen na Microdevice
<ol><li>Coloque o tubo do pólen microdevice em uma câmara de vácuo e desgaseificar por 20 min.</li>
	<li>Remover o microdevice da câmara de vácuo e introduzir o meio de crescimento para a entrada de pistilo utilizando uma micropipeta com uma ponta muito fina. Encha os poços restantes para as blusas com o mesmo meio. Espere por alguns minutos até que todos os microcanais são preenchidos com o médio pelo vácuo criado dentro de microcanais.</li>
	<li>Coloque uma toalha de papel molhada no prato fundo vidro para manter a umidade no prato.</li>
	<li>Transferir os grãos de pólen de um selvagem-tipo T. fournieri 'azul e branco' flor seu estigma usando uma agulha de dissecação. Nota: Também realizamos esta experiência com um transgénico T. fournieri 'Coroa violet' flor (o RPS5Ap::H2B-tdTomato linha17), com tubos de pólen, contendo células de esperma fluorescente etiquetadas e núcleos vegetativos.</li>
	<li>Corte o estilo polinizado (1 cm de comprimento) com uma lâmina.</li>
	<li>Insira o corte estilo na entrada do dispositivo, como mostrado na Figura 2.</li>
	<li>Colocar uma tampa sobre o prato e selá-lo com fita adesiva.</li>
	<li>Coloque o dispositivo em uma incubadora a 28 ° C durante 5-6 h na escuridão.</li>
</ol>7. Culturing in Vitro de cabelos de raiz da . thaliana na Microdevice
Nota: Os passos 7.1-7,9 (exceto 7.3 e 7.5) devem ser realizados numa vizinhança de fluxo laminar.
<ol><li>Esterilizar as sementes da . thaliana Columbia (Col-0) e os transgênicos linha UBQ10pro::H2B-do amor (que contém o marcador fluorescente nuclear), embebendo-os no líquido estéril (5% (v/v) de alvejante doméstico e 0,02% (v/v) Triton X-100) por 5 min.</li>
	<li>Lave as sementes esterilizadas com água esterilizada.</li>
	<li>Armazene as sementes enxaguadas em água por 2 dias a 4 ° C na escuridão.</li>
	<li>Esterilize o microdevice sob luz UV durante a noite.</li>
	<li>Coloque o microdevice em uma câmara de vácuo e desgaseificar por 20 min.</li>
	<li>Introduza o meio de crescimento para os poços no dispositivo usando uma micropipeta. Aguarde alguns minutos até que o vácuo preenche todos os microcanais com o meio.</li>
	<li>Toalha de papel molhada autoclavado de lugar no prato fundo vidro para manter a umidade no prato.</li>
	<li>Transferi uma semente esterilizada na entrada do dispositivo.</li>
	<li>Colocar uma tampa sobre o prato e selá-lo com fita adesiva.</li>
	<li>Coloque o dispositivo na vertical em uma incubadora a 22 ° C, sob luz branca contínua.</li>
	<li>Verifica o crescimento da raiz do cabelo depois de 4-10 dias de incubação. Obter campo brilhante e imagens fluorescentes, utilizando um microscópio invertido.</li>
</ol>8. Culturing in Vitro de patenas p. (musgo) Protonemata no dispositivo Microfluidic
Nota: Passos 8,2-8,6 (exceto 8.3) devem ser realizados em uma capa de fluxo laminar.
<ol><li>Preculture p. patenas estirpe Gransden 200418 na BCDAT médio coberto com papel celofane em uma placa de Petri para uma semana sob luz branca contínua a 25 ° C.</li>
	<li>Esterilize o microdevice sob a luz UV durante a noite em uma capa de fluxo laminar.</li>
	<li>Coloque o microdevice em uma câmara de vácuo e desgaseificar por 20 min.</li>
	<li>Introduza o meio de crescimento para os poços utilizando uma micropipeta. Aguarde alguns minutos até que o vácuo preenche todos os microcanais com o meio.</li>
	<li>Adicione água esterilizada para o prato em torno do microdevice para manter a umidade no prato.</li>
	<li>Transferir uma pequena porção de musgo protonemata tecido para a entrada da microdevice e a cultura do tecido em uma incubadora a 25 ° C, sob luz branca contínua.</li>
	<li>Verifica o crescimento de protonemata de musgo após 2-3 semanas de incubação. Obter imagens de campo claro, usando um microscópio.</li>
</ol>9. Time-Lapse por imagens do crescimento de pólen tubo T. fournieri
<ol><li>Coloque o microdevice em um microscópio de fluorescência invertido equipado com hardware de aquisição de imagens (ex., uma câmera CCD) e software. Encontre os locais de microgap. Nota: Para o software de aquisição de imagem, foi utilizado um produto comercialmente disponível (Tabela de materiais). Software open source de microscopia como µManager também está disponível on-line (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Recomendamos a instalação de um condensador de microscópio no microscópio para obter imagens de alta resolução.</li>
	<li>Capturar imagens de campo claro cada 10 s usando software de aquisição de imagem de microscópio.</li>
	<li>Para observar as células de esperma fluorescente etiquetadas e núcleo vegetativo no tubo do pólen da linha RPS5Ap::H2B-tdTomato , a amostra a irradiação com laser de nm 561 e usar um filtro ótico de passa-banda (578/105 nm). Nota: Embora as lapso de tempo imagens de pólen tubo crescimento foram capturadas com frequência, imagem não pareceu afetar o crescimento. No entanto, é sempre recomendável para minimizar a intensidade do laser, tempo de exposição e intervalo de lapso de tempo, para minimizar a fototoxicidade e fotobranqueamento do fluoróforo.</li>
	<li>Ajustar o brilho e o contraste das imagens e preparar um arquivo de vídeo usando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Vários passos críticos no protocolo precisam ser seguido precisamente para obter os resultados apresentados acima. Em primeiro lugar, as superfícies PDMS camada e vidro fundo prato devem ambos ser tratadas com plasma para uma quantidade suficiente de tempo antes de ligação. Caso contrário, a camada PDMS localmente pode desanexar da superfície de vidro enquanto ponta crescimento células estão atravessando o microgaps. Mais um passo crucial no protocolo de protonemata de pelos radiculares e moss é a esterilização do microd...

Depois de grãos de pólen germinam em um estigma, cada grão produz um único tubo de pólen que transporta os espermatozoides para a célula-ovo e a célula central no óvulo para fertilização dupla. Tubos de pólen alongar através do estilo e eventualmente atingir o óvulo por sensoriamento várias pistas de orientação ao longo de seu caminho1. Durante o alongamento, tubos de pólen encontram uma série de barreiras físicas; a faixa de transmissão está repleto de células, e tubos de pólen deve entrar a abertura micropylar minuto do óvulo para chegar a seu destino (figura 1A)2. Portanto, tubos de pólen devem ter a capacidade de penetrar obstáculos físicos, enquanto tolerando o esforço compressivo de seus arredors. Pelos radiculares são outro tipo de célula de planta ponta-crescente que deve suportar os obstáculos físicos no ambiente, na forma de partículas de solo compactado (figura 1B).
Diversas propriedades mecânicas do tubo pólen têm sido estudadas, incluindo a pressão de turgor e rigidez da região apical da célula, que pode ser medido usando o método de Plasmólise incipiente3,4 e microscopia de força celular (CFM) 5 , 6, respectivamente. No entanto, estes métodos sozinhos não revelar se os tubos de pólen são capazes de prolongar-se por meio de barreiras físicas ao longo de seus caminhos de crescimento. Uma técnica alternativa que permite o alongamento de pólen tubo ser monitorado na vivo é dois fótons microscopia7. No entanto, com este método, é difícil de observar as mudanças morfológicas em tubos de pólen individuais dentro do tecido do ovule. Além disso, crescimento de pelos radiculares no solo pode ser visualizado usando tomografia de radiografia computadorizada (CT) e ressonância magnética (MRI)8, embora com baixa resolução. Aqui, apresentamos um método que pode ser usado para adquirir imagens de alta resolução do processo de deformação da célula em um microscópio convencional.
O objectivo geral do método descrito aqui é para visualizar a capacidade de alongamento das células vegetais crescendo de ponta, incluindo tubos de pólen, pelos radiculares e musgo protonemata, em espaços extremamente pequenos. Como os poli-dimetilssiloxano (PDMS) microdevices apresentados neste manuscrito são opticamente transparentes e ar permeável, podemos cultura de células vivas no interior do aparelho e observar seus comportamentos de crescimento sob um microscópio. Também é possível criar micro ~ espaços de escala nanométrica pelo macio litografia técnica9 , com o uso de moldes. Esses recursos nos permitem estudar a capacidade de alongamento das células de planta ponta-crescendo em um ambiente fisicamente confinado.
Neste trabalho, nós construído 1 µm Largura lacunas (4 µm de altura) em dispositivos microfluídicos e examinada a capacidade dos tubos de pólen de penetrar esses obstáculos artificiais que são muito menores do que o diâmetro do tubo cilíndrico pólen (aproximadamente 8 µm). Esta plataforma experimental nos permite visualizar a resposta do tubo pólen para microgaps e capturar imagens lapso de tempo de resposta, que acompanhar o processo de deformação da célula. Também desenvolvemos o microdevices que pode ser usado para investigar a capacidade de penetração de pelos radiculares e musgo protonemata. Foram relatados vários microdevices para data que permitem a visualização da raiz10,11,12,13 e musgo protonemata14 crescimento da planta em alta resolução. Em nosso dispositivo, uma série de canais de crescimento de pelos radiculares perpendicularmente estão ligados a uma câmara de crescimento de raiz, e cabelos de raiz individuais (aproximadamente 7 µm de diâmetro) são guiados para canais fluídico com 1 µm larga distância. Nós também cultivadas musgo protonemata (aproximadamente 20 µm de diâmetro) em um microdevice contendo microgaps para examinar suas respostas a estas barreiras físicas. A abordagem proposta microfluidic-baseado nos permite explorar a capacidade de várias células vegetais crescimento dica para alongar através de espaços extremamente pequenos, que não podem ser analisados por qualquer outro método atualmente disponível.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>392-00591</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Prato com fundo de vidro de 50 mm</td><td>Matsunami Prato</td><td>com</td> fundo de vidro D210402 <td></td></tr><tr><td>35 mm</td><td>Iwaki&nbsp;</td><td>3971-035</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica</td><td>Feather</td><td>No.11</td><td></td></tr><tr><td>perfuradores de biópsia</td><td>Harris</td><td></td><td>Uni-Core</td></tr><tr><td>Gel dicas de carregamento</td><td>Bio-Bik</td><td>124-R-204</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>Não O número de catálogo está disponível para este microscópio personalizado</td></tr><tr><td>Software de imagem MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, células de planta ponta-crescendo precisam superar uma série de barreiras físicas; no entanto, os pesquisadores faltam a metodologia para visualizar o comportamento celular em tais condições restritivas. Para resolver esse problema, nós desenvolvemos câmaras de crescimento para células vegetais crescimento dica que contêm uma série de aberturas estreitas, microfabricada (~ 1 µm) em um substrato de poli-dimetilssiloxano (PDMS). Este material transparente permite que o usuário monitorar processos de alongamento de ponta em células individuais durante a penetração de microgap pela imagem latente de lapso de tempo. Usando esta plataforma experimental, observamos mudanças morfológicas em tubos de pólen como penetraram o microgap. Nós capturamos as mudanças dinâmicas em forma de um núcleo vegetativo fluorescente etiquetada e espermatozoides em um tubo de pólen durante este processo. Além disso, temos demonstrado a capacidade dos cabelos de raiz e musgo protonemata para penetrar a 1 µm lacuna. Esta plataforma em vitro pode ser usada para estudar como individual células respondem aos espaços fisicamente restrito e pode fornecer insights sobre mecanismos de ponta-crescimento.

Conforme ilustrado na Figura 1, células de planta ponta-crescendo encontram uma série de barreiras físicas ao longo de seus caminhos de crescimento em vivo. As microfluidic em vitro celular cultura plataformas apresentadas neste estudo permitiu o exame a cultura dica do processo em três tipos de células vegetais (tubos de pólen, pelos radiculares e musgo protonemata) através de aberturas artificiais de 1 µm (Figura 3</st...

Nós descrevemos um método para investigar a capacidade de crescimento dica células de vegetais, incluindo tubos de pólen, pelos radiculares e musgo protonemata, para alongar através de aberturas muito estreitas (~ 1 µm) em um dispositivo microfluidic.

Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular vegetal, como como as células vegetais que crescem na ponta penetram nas barreiras físicas celulares. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de adquirir imagens de alta resolução que reconstroem o processo de deformação de uma célula na lacuna de escala micrométrica sob um microscópio convencional. Para fazer um dispositivo para exame dos tubos polinários em crescimento e protonemas de musgo, primeiro faça aproximadamente 11 gramas de um PDMS e carregue-o em um molde de quatro polegadas.Em seguida, desgaseifique o molde por 20 minutos em uma câmara de vácuo. Em seguida, cure o molde a 65 graus Celsius por 90 minutos. Depois de curado, retire a camada de PDMS do molde e abra os orifícios de acesso ao canal dentro do PDMS usando uma ferramenta de punção de biópsia.Em seguida, exponha o PDMS e o prato de vidro de cinco centímetros ao plasma de ar por 50 segundos. Para selar a rede microfluídica, pressione a camada PDMS no prato de vidro e cure-o por 30 minutos a 65 graus Celsius. Para fazer um microdispositivo projetado para exame de cabelo radicular, dois moldes são carregados e curados.Ao perfurar os orifícios do canal, use um punção de dois milímetros. Depois de expor as duas camadas ao plasma de ar por 50 segundos, junte-as, incluindo uma lamínula, sob um estereomicroscópio. Use a ferramenta de alinhamento personalizada para fazer isso.Cure o conjunto por 30 minutos no forno para vedar a rede microfluídica. Após a cura, remova a lamínula do dispositivo e transfira-a para um prato de vidro de cinco centímetros. Antes de usar o microdispositivo do tubo polínico, desgaseifique-o em uma câmara de vácuo por 20 minutos.Adicione meio de crescimento à entrada do pistilo usando uma micropipeta de ponta fina. Carregue os outros poços com o mesmo meio. Aguarde alguns minutos para que os canais sejam preenchidos.Enquanto isso, coloque uma toalha de papel úmida no prato para ajudar a manter a umidade local. Agora, colete grãos de pólen de uma flor azul e branca de T.fournieri. Transfira os grãos para o estigma usando uma agulha de dissecação.Em seguida, corte um estilo polinizado de um centímetro de comprimento no sentido do comprimento e, em seguida, insira o estilo de corte na entrada do dispositivo microfluídico. Quando o estilo de corte é inserido na entrada do dispositivo microfluídico com uma pinça, é importante não segurar o estilo com muita força, pois pode danificar o estilo. Em seguida, prenda uma tampa no prato usando fita adesiva e transfira o prato para uma incubadora a 28 graus Celsius, onde deve permanecer no escuro por cinco a seis horas.Trabalhando sob uma capela de fluxo laminar, comece esterilizando as sementes transgênicas de A.thaliana Columbia. Mergulhe-os em solução de limpeza por cinco minutos. Em seguida, enxágue bem as sementes em água autoclavada.Depois de esterilizadas, armazene as sementes a quatro graus Celsius na escuridão por 48 horas. Alguns dias depois, desgaseifique o microdispositivo por 20 minutos antes de usá-lo. Em seguida, carregue o meio de crescimento apropriado nos poços do dispositivo usando uma pipeta de ponta fina e aguarde alguns minutos para que a solução seja puxada por todos os canais.Além disso, coloque um pouco de papel toalha úmido no prato para manter a umidade. Agora, transfira uma semente preparada para a entrada do dispositivo. Em seguida, prenda a tampa com fita adesiva e transfira o prato para uma incubadora de 22 graus Celsius com luz contínua.Antes de seu uso, esterilize o microdispositivo sob UV durante a noite. No dia seguinte, desgaseifique o microdispositivo por 20 minutos. Uma vez desgaseificados, carregue os micropoços com o meio de crescimento apropriado.Enquanto os canais se enchem gradualmente, envolva o microdispositivo com um pouco de água autoclavada para manter a umidade. Transfira um pequeno pedaço de tecido de protonema de musgo para a entrada do microdispositivo. Agora, cultive o dispositivo a 25 graus Celsius sob luz contínua.Após duas a três semanas de crescimento, tire imagens de campo claro dos resultados ao microscópio. As células vegetais que crescem na ponta encontram uma série de barreiras físicas ao longo de seus caminhos de crescimento in vivo, como no trato transmissor e na micrópila, sem mencionar o caminho dos pêlos radiculares no solo. As plataformas de cultura de células microfluídicas in vitro apresentadas permitem o exame do processo de crescimento da ponta em três tipos de células vegetais, tubos polínicos, pêlos radiculares e protonemas de musgo.A visualização é realizada por meio de lacunas de um mícron nos dispositivos. Como as micro-lacunas desse tamanho são frágeis, às vezes elas se fecham, especialmente após o uso repetido. Assim, é importante verificar se as lacunas estão intactas antes de realizar os experimentos.Para o estudo do tubo polínico, a imagem de células vivas foi usada para monitorar as mudanças morfológicas na região apical dos tubos polínicos, bem como no núcleo vegetativo e nos espermatozóides em resposta ao encontro de um espaço extremamente pequeno. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular vegetal explorarem a capacidade de alongamento de células vegetais que crescem na ponta, como tubos polínicos, pêlos radiculares e protonemas de musgo em um espaço extremamente pequeno.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós descrevemos um protocolo para a fabricação de dispositivos microfluídicos que pode permitir a captura de células e cultura. Nesta abordagem padronizada microestruturas, tais como sulcos dentro de canais microfluídicos são usados ​​para criar regiões de cisalhamento de baixa tensão dentro do qual célula pode encaixar.

Um dispositivo micro com padrões Groove para estudar o comportamento celular

Apresenta-se um método simples para a produção de dispositivos microfluídicos capazes de aplicar semelhantes condições dinâmicas de múltiplas linhagens distintas, sem a necessidade de uma sala de limpeza ou de litografia suave.

Um dispositivo micro para o Estudo múltiplas linhagens distintas

Fonte: Cabeen, M. T., et al. Análise Microfluídica de célula única de Bacillus subtilis. J. Vis. Experiência (2018)O vídeo demonstra o uso de um dispositivo microfluídico para observar o crescimento bacteriano em nível de célula única. Ele mostra como células bacterianas não móveis, confinadas em trincheiras em microescala, são continuamente nutridas e visualizadas sob um microscópio de fluorescência. A configuração permite visualização em tempo real da divisão celular e do rastreamento de...

Monitorando o crescimento bacteriano em resolução de célula única em um sistema microfluídico

Neste protocolo, é introduzida a fabricação, configuração e operação básica de um biorreator picoliter microfluídico (PLBR) para análise de célula única de microrganismos procarióticos. Microrganismos industrialmente relevantes foram analisados como prova de princípio, permitindo insights sobre taxa de crescimento, morfologia e heterogeneidade fenotípica ao longo de certos períodos de tempo, dificilmente possíveis com métodos convencionais.

Biorreator Picoliter Microfluídico para Análise Microbiana de Célula Única: Fabricação, Configuração do Sistema e Operação

Nós demonstramos um ensaio baseado em microfluídica para medir a escala de tempo para que as células de trânsito através de uma seqüência de constrições em escala mícron.

A técnica de microfluídica para sondar Deformabilidade celular

Dispositivos microfabricados integrados com componentes fluídicos fornecem uma plataforma in vitro para estudos celulares que imitam o microambiente in vivo. Desenvolvemos chips microfluídicos à base de polimetilmetacrilato para estudar as respostas celulares sob estímulos de estresse químico/elétrico/de cisalhamento únicos ou coexistentes.

Projetando microfluídicos para Estudar respostas celulares Sob único ou coexistindo Chemical / Elétrica / tensão de cisalhamento Estímulos

Apresentamos um método de análise microfluidic de linhagens de células bacterianas individuais usando Bacillus subtilis como exemplo. O método supera deficiências dos métodos tradicionais de análise em microbiologia, permitindo a observação de centenas de gerações de células sob condições de crescimento firmemente controlável e uniforme.

Célula única Microfluidic análise de Bacillus subtilis

Nós descrevemos um método para construir dispositivos para a cultura 3D e a experimentação com pilhas e os organoids multicelular. Este dispositivo permite a análise de respostas celulares a sinais solúveis em microambientes 3D com gradientes quimioatrativos definidos. Os organóides são melhores do que as células únicas na detecção de entradas barulhentas fracas.

Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

Aqui, fornecemos um chip microfluido e um sistema microfluido de circulação de circulação automaticamente controlado e altamente eficiente que recapitula o microambiente inicial da neovascularização, permitindo que as células endoteliais (CE) sejam estimuladas pelo alto estresse da cisalhamento luminal, nível fisiológico de fluxo transendelial e distribuição de vários fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente.

Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização

Devido à opacidade do solo, as interações entre seus micróbios constituintes não podem ser facilmente visualizadas com resolução celular. Aqui, são apresentadas duas ferramentas microfluidas, que oferecem novas oportunidades para investigar interações fúngicas-microbianas. Os dispositivos são versáteis e simples de usar, permitindo alto controle espesso e imagens de alta resolução no nível celular.

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

Este protocolo detalha o projeto e a fabricação de um dispositivo microfluídico adequado para investigar a mecânica do polímero de microtúbulos. A síntese de técnicas de microfabricação, controle de fluxo automatizado e modelagem computacional permite um sistema flexível ideal para sondar o citoesqueleto celular in vitro.

Desenvolvimento de uma abordagem baseada em microfluídica para investigar a mecânica de polímeros de microtúbulos

Aprenda a desenvolver dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de células vegetais de ponta-cultivo, como tubos polínicos e protonemas de musgo, em espaços confinados de micrometragem.

Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos (Vídeo) | JoVE Journal

Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos

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