Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular vegetal, como como as células vegetais que crescem na ponta penetram nas barreiras físicas celulares. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de adquirir imagens de alta resolução que reconstroem o processo de deformação de uma célula na lacuna de escala micrométrica sob um microscópio convencional. Para fazer um dispositivo para exame dos tubos polinários em crescimento e protonemas de musgo, primeiro faça aproximadamente 11 gramas de um PDMS e carregue-o em um molde de quatro polegadas.

Em seguida, desgaseifique o molde por 20 minutos em uma câmara de vácuo. Em seguida, cure o molde a 65 graus Celsius por 90 minutos. Depois de curado, retire a camada de PDMS do molde e abra os orifícios de acesso ao canal dentro do PDMS usando uma ferramenta de punção de biópsia.

Em seguida, exponha o PDMS e o prato de vidro de cinco centímetros ao plasma de ar por 50 segundos. Para selar a rede microfluídica, pressione a camada PDMS no prato de vidro e cure-o por 30 minutos a 65 graus Celsius. Para fazer um microdispositivo projetado para exame de cabelo radicular, dois moldes são carregados e curados.

Ao perfurar os orifícios do canal, use um punção de dois milímetros. Depois de expor as duas camadas ao plasma de ar por 50 segundos, junte-as, incluindo uma lamínula, sob um estereomicroscópio. Use a ferramenta de alinhamento personalizada para fazer isso.

Cure o conjunto por 30 minutos no forno para vedar a rede microfluídica. Após a cura, remova a lamínula do dispositivo e transfira-a para um prato de vidro de cinco centímetros. Antes de usar o microdispositivo do tubo polínico, desgaseifique-o em uma câmara de vácuo por 20 minutos.

Adicione meio de crescimento à entrada do pistilo usando uma micropipeta de ponta fina. Carregue os outros poços com o mesmo meio. Aguarde alguns minutos para que os canais sejam preenchidos.

Enquanto isso, coloque uma toalha de papel úmida no prato para ajudar a manter a umidade local. Agora, colete grãos de pólen de uma flor azul e branca de T.fournieri. Transfira os grãos para o estigma usando uma agulha de dissecação.

Em seguida, corte um estilo polinizado de um centímetro de comprimento no sentido do comprimento e, em seguida, insira o estilo de corte na entrada do dispositivo microfluídico. Quando o estilo de corte é inserido na entrada do dispositivo microfluídico com uma pinça, é importante não segurar o estilo com muita força, pois pode danificar o estilo. Em seguida, prenda uma tampa no prato usando fita adesiva e transfira o prato para uma incubadora a 28 graus Celsius, onde deve permanecer no escuro por cinco a seis horas.

Trabalhando sob uma capela de fluxo laminar, comece esterilizando as sementes transgênicas de A.thaliana Columbia. Mergulhe-os em solução de limpeza por cinco minutos. Em seguida, enxágue bem as sementes em água autoclavada.

Depois de esterilizadas, armazene as sementes a quatro graus Celsius na escuridão por 48 horas. Alguns dias depois, desgaseifique o microdispositivo por 20 minutos antes de usá-lo. Em seguida, carregue o meio de crescimento apropriado nos poços do dispositivo usando uma pipeta de ponta fina e aguarde alguns minutos para que a solução seja puxada por todos os canais.

Além disso, coloque um pouco de papel toalha úmido no prato para manter a umidade. Agora, transfira uma semente preparada para a entrada do dispositivo. Em seguida, prenda a tampa com fita adesiva e transfira o prato para uma incubadora de 22 graus Celsius com luz contínua.

Antes de seu uso, esterilize o microdispositivo sob UV durante a noite. No dia seguinte, desgaseifique o microdispositivo por 20 minutos. Uma vez desgaseificados, carregue os micropoços com o meio de crescimento apropriado.

Enquanto os canais se enchem gradualmente, envolva o microdispositivo com um pouco de água autoclavada para manter a umidade. Transfira um pequeno pedaço de tecido de protonema de musgo para a entrada do microdispositivo. Agora, cultive o dispositivo a 25 graus Celsius sob luz contínua.

Após duas a três semanas de crescimento, tire imagens de campo claro dos resultados ao microscópio. As células vegetais que crescem na ponta encontram uma série de barreiras físicas ao longo de seus caminhos de crescimento in vivo, como no trato transmissor e na micrópila, sem mencionar o caminho dos pêlos radiculares no solo. As plataformas de cultura de células microfluídicas in vitro apresentadas permitem o exame do processo de crescimento da ponta em três tipos de células vegetais, tubos polínicos, pêlos radiculares e protonemas de musgo.

A visualização é realizada por meio de lacunas de um mícron nos dispositivos. Como as micro-lacunas desse tamanho são frágeis, às vezes elas se fecham, especialmente após o uso repetido. Assim, é importante verificar se as lacunas estão intactas antes de realizar os experimentos.

Para o estudo do tubo polínico, a imagem de células vivas foi usada para monitorar as mudanças morfológicas na região apical dos tubos polínicos, bem como no núcleo vegetativo e nos espermatozóides em resposta ao encontro de um espaço extremamente pequeno. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular vegetal explorarem a capacidade de alongamento de células vegetais que crescem na ponta, como tubos polínicos, pêlos radiculares e protonemas de musgo em um espaço extremamente pequeno.