Name: Microdissection de segmentos de tecido Renal primária e incorporação com tecnologia de construção romance livre de andaime (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a microdissecção de rins murinos para isolar segmentos cortico-medulares com arquitetura renal intacta. Esta técnica permite manter tecido vivo em cultura para aplicações em engenharia de tecidos renais.

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NIH institucional formação pós-doutoral Grant, NIH-HL-007260

Todos os procedimentos cirúrgicos animais descritos abaixo foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e usar Comité (IACUC) na Medical University of South Carolina, antes de qualquer animais cirurgias ou uso de quaisquer tecidos animais.
1. murino nefrectomia
<ol><li>Não uma máscara cirúrgica e tampão bouffant para minimizar o risco de contaminação. Manter a esterilidade durante a configuração da área cirúrgica.<ol>
<li>Coloque cortinas cirúrgicas não-fenestrado na mesa de operação.</li>
		<li>Abre a mochila de instrumentos esterilizados para as cortinas estéril. Os instrumentos necessários para nefrectomia incluem 3 hemostatos pequenos, finas pinças com dentes, pinça fina sem dentes e a tesoura de íris reta.</li>
		<li>Coloque outro não fenestrado cirúrgica drapeja no centro da mesa de operações.</li>
		<li>Prepare-se 5 mL de Dulbecco fosfato Buffered Saline (DPBS) com cálcio e magnésio, suplementado com 1% penicilina/estreptomicina em um tubo cônico estéril 15 mL. Coloque esta solução no gelo ao lado da mesa de operações.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Obter um rato C57BL/6 de 8-12 semanas (masculino ou feminino) em relação ao complexo de alojamento dos animais.</li>
	<li>Posicione o mouse dentro de uma câmara de indução da anestesia e induzir com isoflurano 3,5% inalado. Coloque um cone de nariz do mouse, usando 2% de isoflurano para a anestesia de manutenção.<ol>
<li>Monitor para adequada profundidade de anestesia periodicamente durante todo o procedimento cirúrgico avaliando para pedal reflex (pitada de dedo firme).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova todo o cabelo do tronco ventral usando o creme depilatório. Enxague a área com água destilada para garantir que todo o cabelo foi removido do abdômen.</li>
	<li>Transferi o mouse para a mesa de operações estéril em posição supina sob a cortina não fenestrado superior. Corte uma fenestração de2 2 x 2 cm na cortina sobrejacente apenas o abdômen do mouse.</li>
	<li>Aplica iodo-povidona, seguido por 70% de etanol para o abdômen, usando bolas de algodão ou gaze estéril.</li>
	<li>Usando a pinça fina com dentes e iris tesouras, faça uma incisão de pele abdominal vertical de 3-4 cm paralelo à linha média, 0,5 cm para a esquerda da linha média Nota: Se tentar remover o rim direito, esta será uma incisão de 0,5 cm à direita da linha média.<ol>
<li>Segure o peritônio com pinça fina, sem dentes e cortar com uma tesoura de íris para entrar na cavidade abdominal. Aplica hemostatos as bordas laterais superiores e inferiores, pele e peritônio colocar tensão lateralmente e aumentar a exposição.</li>
		<li>Deslocar o conteúdo intestinal delicadamente para o lado direito do abdômen para expor o rim esquerdo. Coloque delicadamente a tração no rim para elevá-lo fora do abdômen.</li>
		<li>Coloque uma pinça hemostática através do hilo do rim esquerdo. Use tesoura de íris para transecto o ureter e vasos renais.</li>
		<li>Coloque o rim esquerdo no 1% solução de DPBS penicilina/estreptomicina no gelo.</li>
		<li>Transferi o tubo contendo o rim para o bairro de cultura de tecido estéril. Transferi o rim do tubo cônico de 15 mL para um prato de petri de 60-mm (Figura 1). Lave duas vezes com 5 mL DPBS com cálcio e magnésio. Manter o rim suspendido em 5 mL DPBS no prato 60mm.<ol>
<li>Prepare um prato de petri 60mm adicionais com 5 mL DPBS deve ser usado durante o protocolo de microdissection.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eutanásia o mouse por toracotomia e perda de sangue após a aquisição do rim, de acordo com um protocolo de animais IACUC aprovado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. murino rim Microdissection para isolamento de segmento Renal
<ol><li>Continue usando uma técnica estéril para esta parte do protocolo, incluindo luvas estéreis, máscara cirúrgica e shampoo para minimizar o risco de contaminação.<ol>
<li>Lugar estéril cortinas na plataforma de microscópio estéreo também quanto à áreas saiu e direito do microscópio de ter um campo estéril para instrumentos. Coloque folhas de adesivo plástico sobre os botões de foco do microscópio e pulverizar com etanol a 70%. Liga o iluminador de pescoço de cisne dual para iluminar o palco.</li>
		<li>Aberto instrumentos esterilizados (pinça fina sem dentes, alça para bisturi, lâmina de bisturi #15, duas retos hemostatos, duas 30½ calibre agulhas de calibre oco) para cortinas estéril. Lâmina de lugar o #15 no bisturi tratar agora e anexar uma pinça hemostática para cada adaptador de agulha/hub para criar instrumentos de dissecção de agulha para uso posterior, conforme mostrado na Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mova os pratos de petri-60mm, um contendo o rim em DPBS e outros DPBS a única, do bairro cultura de tecidos para a área de microscópio.<ol>
<li>Coloque o prato de petri 60mm no âmbito do objectivo e retire a tampa para expor o rim. Deixe o prato contendo DPBS ao lado no campo estéril para uso posterior.</li>
		<li>Mova o prato para que apenas a superfície anterior ou posterior do rim está em exibição (ou seja, a grande cara lisa do rim, com a outra face, tocar no fundo do prato). Aumentar o zoom 3.2-4x para esta parte do procedimento. Usando a mão não dominante, use pinça fina, sem dentes para perfurar e fixar o rim contra o prato perto dos polos superiores e inferiores do rim.</li>
		<li>Mantenha a mão não dominante no lugar para fixar o rim. Com a mão dominante, utilize a lâmina #15 para remover a camada capsular fibrosa translúcida da superfície exposta. Raspe o mais superficial 0,5 mm da superfície exposta do rim para remover o restante da cápsula.</li>
		<li>Use a lâmina #15 para dissecar uma pirâmide invertida de tecido da área congelada, aproximadamente 2 mm3 no tamanho. Recuperar o prato de 60-mm contendo apenas DPBS e colocar o prato limpo a pirâmide do tecido. Descarte o restante do rim.</li>
		<li>Diminua a ampliação de 1.5-2.0 X para o resto da dissecação. Usando dois instrumentos de pinça hemostática-agulha como instrumentos de corte, fatie o fragmento de tecido em pedaços progressivamente menores até que os segmentos de tecido são menor ou igual ao diâmetro das dicas de agulha. Um tecido renal 2 mm3 no tamanho produzirá mais de 50 segmentos uma vez completamente dissecados.</li>
		<li>Mova o prato de 60-mm com segmentos renais para o capô de cultura de tecidos. Remova DPBS com pipeta de 1000 µ l. Adicione 5 mL DMEM, suplementado com 10% soro Fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina.</li>
		<li>Cultura por 3 dias a 37 ° C em uma incubadora ou implante em construções de celulares imediatamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. renal segmento construção celular fabricação
<ol><li>Cultura normal humanos fibroblastos dérmicos (NHDF) e humanas adiposas microvasculares células endoteliais (HAMEC) durante várias semanas obter a 7,2 x 105 fibroblastos e 1,8 x 105 células endoteliais por construto desejado. O capuz de cultura de tecidos, propagar a relação apropriada dos fibroblastos, células endoteliais (4:1) para poços de forma cilíndrica em agarose moldes para formar o andaime livre pre-vasculares endotelial-fibroblasto construções (SPEC), conforme descritas por Czajka et al 19.</li>
	<li>Obter um hemostat esterilizado, agulha de 30½ G e uma espátula estéril com extremidade plana.<ol>
<li>Remova a maioria dos meios de comunicação da placa de 60-mm contendo segmentos renais, tomando cuidado para não aspirar e remover os segmentos renais.</li>
		<li>Equipe as lupas cirúrgicas para visualizar a implantação dos segmentos.</li>
		<li>Raspe o fim da espátula suavemente ao longo do fundo do prato 60mm para obter segmentos de 10-15, espalhar-se uniformemente ao longo da ponta da espátula. Coloca a ponta da espátula tão próxima quanto possível para o lábio do poço onde o SPEC foi semeada.</li>
		<li>Use um instrumento de agulha pinça hemostática-30½ G na outra mão para mover cada segmento individual desde a ponta da espátula para a borda do poço. Mova cada segmento para o bem usando a ponta da agulha até ligeiramente submerso na suspensão celular previamente semeada.</li>
		<li>Cultura de segmento renal-SPEC em 2:1:1 relação de meio de mutilação genital feminina-2/EGM-2/DMEM (total de volume de 2,5 mL). Mudar a cada 24 h de meios de cultura por 3 dias. Remover as construções de moldes em 72 h e corrigir ou congelam para processamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Jha, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+kidney+disease%3A+global+dimension+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic kidney disease: global dimension and perspectives.</a> Lancet. 382 (9888), London, England. 260-272 (2013).</li>
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<li>Czajka, C. A., Drake, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+prevascular+tissues+from+endothelial+and+fibroblast+cells+under+scaffold-free%2C+nonadherent+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions.</a> Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).</li>
<li>Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin-Based+Therapeutics+and+Tissue+Engineering+Approaches+to+the+Amelioration+of+Chronic+Pancreatitis+and+Type+I+Diabetes%3A+Construction+and+Characterization+of+a+Novel+Prevascularized+Bioartificial+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+diabetes+research%22%5BJournal%5D)">Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas.</a> Journal of diabetes research. 2016, 7262680(2016).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Métodos usados para projetar o tecido renal vivo construções variam bastante no que se refere o tipo de células e biomateriais utilizados e em muitos casos, estão desatualizados ou não bem caracterizadas na literatura7. Enquanto muitos estão usando células-tronco abordagens ou sintetizando os componentes individuais da arquitetura renal isoladamente, é a perspectiva de recriar artificialmente um órgão inteiro com mais de 26 tipos diferentes de células diferenciadas de suspensões celulares esmagado...

Doença renal crônica (DRC) é um do atual saúde pública desafios em todo o mundo1. A prevalência de DRC nos Estados Unidos é mais 14% do total da população, com mais de 600.000 americanos sofrem de forma mais severa, estágio final da doença renal (DRT)2. As atuais opções de tratamento disponíveis para aqueles com DRT incluem transplante renal e diálise. Apesar de aproximadamente 25.000 pacientes submetidos a transplante renal a cada ano, um número significativo de pacientes é adicionado anualmente levando a uma grande disparidade entre aqueles que aguardam um órgão de salvamento e aqueles recebendo transplante3. Além de seus graves efeitos negativos na qualidade de vida e longevidade, diálise está associado um encargo financeiro surpreendente. Em 2014, o Medicare paga reivindicações mais totalizou US $ 30 bilhões para DRT pacientes2. Com um suprimento limitado de órgão e sem aparente tendência de baixa em pacientes que necessitam de diálise, os esforços de investigação visam identificar soluções alternativas para diálise e transplante são sempre importantes. Mesmo um atraso relativamente curto na necessidade de diálise aumenta o número de um paciente dos anos de vida ajustados por qualidade e produtividade substancialmente enquanto adiar custos relacionados com a diálise4,5,6.
Soluções para a perda de tecido funcional, assim na DRT, atualmente estão sendo estudadas na engenharia de tecidos e medicina regenerativa laboratórios, com abordagens amplamente variadas, variando de fabricação baseados em andaime organoides para órgão inteiro usando engenharia decellularized estruturas de órgão para implantação celular7,8,9,10,11. Recapitulando complexas estruturas renais de rins marginais ou descartados foi parcialmente investigado. Na verdade, quase 20% dos rins para transplante são descartados por várias razões12,13. O tecido renal funcional destes enxertos putativos poderia ser utilizado e incorporado uma ou muitas construções de engenharia de tecidos. Estudos prévios têm demonstrado a viabilidade de trabalhar com estes órgãos descartados, utilizando os rins para a matriz extra-celular para engenharia de tecido fins14,15. No entanto, poucos têm usado tecido nephronal primário de rins saudáveis para fins de engenharia de tecidos a16,17,18.
Um método anteriormente descrito por Kim et al envolve isolamento de renais "segmentos" de rins de rato saudável, que em seguida foram semeados em andaimes de (PGA) ácidos poliglicólico para fabricação de construção16. No entanto, pouca informação é dada em relação a metodologia exata de dissecação, e segmentos foram obtidos a partir de uma combinação de picagem fina e filtração. Nós descrevemos uma modificação do presente protocolo, que da mesma forma, produz discretos segmentos renais com arquitetura nephronal intacto, mas em vez disso se baseia em técnicas de microdissection. Nephrectomies são executadas em ratos adultos vivos, depois que os rins são transferidos para o microscópio de dissecação onde é removida a cápsula renal, e o tecido é mais dissecado. Pequeno calibre agulhas 30½ G são usadas como instrumentos de corte e também como guias, ajudando na dissecação, como a agulha de diâmetro é igual ao diâmetro do alvo dos segmentos renais. Os segmentos isolados, neste caso murino, renais mantêm viabilidade em cultura e incorporam com construções celular livre de andaime endotelial-fibroblasto19. Essas construções têm sido utilizadas anteriormente para engenheiro de outros órgãos, incluindo pâncreas artificial bio20.

<table><tbody><tr><td>Descartáveis hospitalares Busse</td> <td>de campo estéreis não fenestrados</td><td>696</td><td></td></tr><tr><td>Descartáveis hospitalares</td><td>estéreis Fenestrados</td><td>697</td><td></td></tr><tr><td>Pinças de mosquito Halsted 5 Miltex</td><td></td><td>Mil-7-4</td> <td>"Hemostat" curvo no manuscrito</td></tr><tr><td>Pinça Graefe extra fina, curvada com dentes</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11155-10</td><td>Pinça fina com dentes</td></tr><tr><td>Pinça Graefe Extra Fina, Serrilhada (sem dentes)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td>Pinça Fina sem dentes</td></tr><tr><td>Tesoura Fina - Carboneto de Tungstênio</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>Tesoura de Íris</td></tr><tr><td>Betadine Esfoliante Cirúrgico com Bomba, Povidona-iodo 7.5%</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-151-17</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de gaze de algodão estéril (4" x 4")</td><td>Fisher Healthcare</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Solução tamponada com fosfato de Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina/estreptomicina, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Fabricante: Piramal, Distribuidor: McKesson</td><td>2254845</td><td></td></tr><tr><td>Removedor de Pêlos</td><td>Nair</td><td>Nair 22600-23307</td><td>Creme de Depilação em texto</td></tr><tr><td>200 Prova de Etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2705</td><td>Diluído a 70% Solução</td></tr><tr><td>de Etanol BioLite 60mm Prato de Cultura de Tecidos</td><td>Themo-Scientific</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>Press'n Seal</td><td>Glad</td><td>12587-70441</td><td>Aplicado ao Estereoscópio</td></tr><tr><td>SZX16 Microscópio Estéreo</td><td>Olympus</td><td>Iluminador de Fibra Óptica SZX16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole Parmer</td><td>41720-20</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Autossustentável de Luz Dupla, 23" L Gooseneck</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-41720-60</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de Bisturi #3</td> Lâmina de Aço Carbono <td>Estéril Miltex</td><td>Mil-4-7</td><td></td></tr>, <tr><td>Tamanho da Lâmina 15</td><td>Bard-Parker</td><td>371115</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de Calibre 31 1/2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-826F</td><td>Becton Dickinson 305106</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Select 100% Soro Bovino</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FS-0500-AD</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos Dérmicos Humanos Normais</td><td>Lonza</td><td>CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Células Endoteliais Microvasculares Adiposas Humanas</td><td>Laboratórios de Pesquisa Sciencell</td><td>7200</td><td></td></tr><tr><td>Lupas cirúrgicas (2,5x)</td> <td>Orascoptic</td> <td>(N / A) Custom Order</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 (Fibroblasto Basal Medium com FGM-2 SingleQuots Adicionados)</td> <td>Lonza</td><td>CC-3131, CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 (Endotelial Basal Medium com EGM-2 SingleQuots Adicionados)</td> <td>Lonza</td><td>CC-3156, CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>Live / Dead Viability / Cytotoxicity Kit para Células de Mamíferos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anticitoqueratina-18</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-camundongo de cabra, Alexa Fluor 633</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21052</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fator de Von Willebrand</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td></td></tr><tr><td>Albumina, isotiocianato de fluoresceína Conjugado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9771-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>BD Pharmingen</td><td>561908</td><td></td></tr><tr><td>Antecedentes Buster</td><td>Innovex Biosciences</td><td>NB306</td><td></td></tr></tbody></table>

microdissection de segmentos de tecido renal primária e incorporação com tecnologia de construção romance livre de andaime

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Transplante de rim é agora uma terapia convencional para o estágio final da doença renal. No entanto, com cerca de 96.000 pessoas na lista de espera e apenas um quarto desses pacientes realizar o transplante, há uma grande necessidade de alternativas para aqueles com falência de órgãos. A fim de diminuir as consequências prejudiciais da diálise juntamente com os custos globais de saúde incorre, investigação está em curso em busca de soluções alternativas para a transplantação de órgãos. Implantáveis engenharia de tecido renais celulares construções são uma tal abordagem viável para substituir a funcionalidade renal perdida. Aqui, descrita pela primeira vez, é o microdissection dos rins murino para isolamento de vida córtico segmentos renais. Esses segmentos são capazes de rápida incorporação dentro de construções de andaime-free endotelial-fibroblasto que lhe permitam conexão rápida com a vasculatura hospedeiro uma vez implantada. Os rins do rato adulto foram colhidos em dadores vivos, seguidos pelo estereoscópio microdissection obter segmentos renais 200-300 µm de diâmetro. Várias construções renais foram fabricadas usando segmentos renais primários, colhidos a partir de apenas um rim. Este método demonstra um procedimento que poderia salvar o tecido renal funcional de órgãos que seria caso contrário serão descartados.

O protocolo descrito produz aproximadamente 50 segmentos renais por seção de3 mm 2 piramidal do tecido renal. Os segmentos renais que foram processados e fotografados tem componentes tubulares e glomerulares em proporções diferentes (ver Figura 2). Os segmentos intactos foram submetidos a um ensaio para determinar a viabilidade de diferentes segmentos de uma vez a cada 24 horas durante três dias. Verde-fluorescente calceína-AM está presente com ati...

Engenharia de tecido renais construções oferecem uma solução para a escassez de órgãos e os efeitos deletérios da diálise. Aqui, descrevemos um protocolo para micro dissecar murino rins para isolamento dos segmentos córtico-medular. Esses segmentos são implantados livre de andaime celular construções, formando organoids renal.

Microdissection de segmentos de tecido Renal primária e incorporação com tecnologia de construção romance livre de andaime

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

O objetivo geral deste procedimento de dissecção microscópica é isolar segmentos discretos de tecido renal vivo com arquitetura renal intacta para aplicações de engenharia de tecidos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da engenharia de tecidos, como: segmentos inteiros de tecido de órgão primário isolado podem ser colhidos estérilmente e mantidos vivos em cultura? A principal vantagem dessa técnica é que os segmentos contêm arquitetura renal intacta, em oposição ao uso de linhagens celulares para recriar um órgão complexo com mais de 26 tipos diferentes de células.As implicações dessa técnica se estendem à terapia da doença renal em estágio terminal, pois essas construções melhorarão a filtração e podem ajudar os pacientes a não fazer diálise. Durante a cirurgia, use equipamento cirúrgico adequado, incluindo máscara e touca, para minimizar o risco de contaminação. Da mesma forma, faça todos os esforços para manter a esterilidade por toda parte.Comece os preparativos cobrindo a mesa de operação. Em seguida, abra o pacote de instrumentos autoclavados nas cortinas estéreis. Eles devem incluir três hemostáticos pequenos, pinças finas com dentes, pinças finas sem dentes e tesouras de íris retas.Cubra o centro da mesa cirúrgica com um segundo campo cirúrgico não fenestrado. Antes de montar a sala de cirurgia, prepare 50 mililitros de DBPS suplementado com antibiótico e alíquota de cinco mililitros em um tubo de 15 mililitros. Agora anestesiar um camundongo C57 preto de seis anos de oito a 12 semanas de idade e monitorar periodicamente o nível de anestesia, avaliando seu reflexo pedal com um beliscão firme do dedo do pé.Em seguida, use um creme depilatório para remover todos os pelos da área ventral do tronco e enxágue o creme e o cabelo com água destilada. Em seguida, transfira o mouse para a mesa de operação e coloque-o em decúbito dorsal sob a cortina não fenestrada. Agora corte uma fenestração quadrada de dois centímetros na cortina sobre o abdômen do rato.Em seguida, esfregue a pele exposta com iodopovidona seguido de etanol 70% três vezes para esterilizar a pele e completar os preparativos para a cirurgia. Comece a cirurgia usando pinças finas com dentes e tesouras de íris. Faça uma incisão na pele de três a quatro centímetros paralela à linha média, meio centímetro à esquerda da linha média.Em seguida, segure o peritônio usando uma pinça fina sem dentes e faça uma incisão com uma tesoura de íris para entrar na cavidade abdominal. Em seguida, aplique hemostáticos nas bordas laterais superior e inferior da pele e no peritônio para colocar a tensão lateralmente e aumentar a exposição. Agora mude delicadamente o conteúdo intestinal para a direita do abdômen para expor o rim esquerdo.Em seguida, coloque suavemente a tração no rim para elevá-lo para fora do abdômen. Agora coloque um hemostático no hilo do rim e use uma tesoura de íris para atravessar o ureter e os vasos renais. Em seguida, transfira o rim para o tubo de DBPS 1% pen-strep no gelo.Leve este tubo a uma capa de cultura estéril para processamento. Lá, transfira o rim para uma placa de Petri de 60 milímetros e enxágue-o duas vezes com cinco mililitros frescos de DPBS contendo cálcio e magnésio. Após a segunda lavagem, suspenda o rim em cinco mililitros frescos de DBPS em um novo prato de 60 milímetros.Em seguida, prepare uma placa de Petri adicional contendo apenas cinco mililitros de DBPS para uso posterior. Continue usando a técnica estéril, incluindo luvas estéreis, máscara cirúrgica e bufante para minimizar os riscos de contaminação. Em seguida, coloque a área do palco e a área ao redor do microscópio estéreo.Em seguida, coloque folhas adesivas de plástico nos botões de foco do microscópio e borrife-as com etanol 70%. Em seguida, ligue o iluminador pescoço de ganso duplo para iluminar o palco. Agora, nas cortinas estéreis, abra um pacote de instrumentos esterilizados contendo pinças finas sem dentes, um cabo de bisturi, uma lâmina de bisturi número 15, dois hemostáticos retos e duas agulhas de calibre 30,5 de calibre oco.Coloque a lâmina número 15 no cabo do bisturi e conecte um hemostático a cada cubo adaptador de agulha para criar instrumentos de dissecção de agulha. Agora transfira os dois pratos, um com o rim em DPBS e o outro apenas DPBS, para a área do microscópio. Remova a tampa da placa renal e concentre o microscópio na superfície anterior ou posterior do rim com ampliação de 3.2 a 4X.Em seguida, com a mão não dominante, use uma pinça fina sem dentes para perfurar e prender o rim contra o prato nos pólos inferior e superior do rim. Em seguida, com a mão dominante, use a lâmina número 15 para remover a camada capsular fibrosa translúcida da superfície exposta. Raspe os 0,5 milímetros mais superficiais da superfície exposta da superfície do rim para remover o restante da cápsula.Continue usando a lâmina número 15 para dissecar uma pirâmide invertida de tecido da área descapsulada que é de aproximadamente dois milímetros quadrados. Em seguida, transfira o tecido para o prato limpo de DBPS e descarte o restante do rim. Agora concentre-se no tecido dissecado e diminua a ampliação para 1,5 a 2,0X.Usando os dois instrumentos de agulha hemostática como ferramentas de corte, corte o fragmento de tecido em pedaços progressivamente menores até que os segmentos de tecido sejam do tamanho das pontas da agulha ou menores. Cerca de 50 segmentos devem ser produzidos. Esta é uma parte crítica do procedimento.Cada segmento precisa se aproximar do diâmetro da ponta da agulha de calibre 30-1/2 para evitar segmentos grandes que possam dificultar a difusão. Retorne o tecido para a capa de cultura de tecidos e remova a DPBS usando uma micropipeta P1000. Em seguida, adicione cinco milímetros de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de caneta-estreptococo.Em seguida, cultive o tecido ou implante-o dentro de construções celulares imediatamente. A viabilidade dos segmentos renais íntegros produzidos pelo procedimento descrito foi examinada ao longo de três dias em cultura usando um ensaio de viabilidade. O AM de cálcio fluorescente verde está presente com atividade de esterase intracelular indicativa de células vivas.O homodímero de etídio-1 fluorescente vermelho é observado com perda de integridade da membrana plasmática. Quando os segmentos renais foram incorporados em construções de fibroblastos endoteliais livres de andaimes, no terceiro dia eles foram incorporados às construções celulares para formar estruturas intactas. Os construtos mantiveram sua rede endotelial pré-vascular mostrada pela marcação com fator de von Willebrand.As células epiteliais renais podem ser vistas em verde marcadas por citoquertain-18. Para testar a funcionalidade renal in vitro, as construções foram incubadas com albumina marcada com FITC. Embora houvesse albumina residual encontrada nos segmentos de tecido renal incorporado, também havia pontos quentes nas células epiteliais tubulares renais.Esses pontos quentes são a albumina que atravessa intraluminalmente, o que se acredita representar a recaptação da albumina na construção celular do segmento renal. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar segmentos renais de rins murinos para aplicações de engenharia de tecidos. Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito em uma a 1-1 / 2 horas.Após este procedimento, outros métodos, incluindo a semeadura de construtos celularizados, podem ser realizados para responder a outras questões relacionadas à fabricação e caracterização do construto renal. Não se esqueça de que trabalhar com instrumentos cirúrgicos e cilindros de oxigênio pressurizados pode ser extremamente perigoso. Tenha cuidado ao trabalhar com objetos pontiagudos e lembre-se de ancorar tanques de oxigênio em uma bancada de laboratório.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este protocolo descreve a descelularização de rins de ratos Sprague Dawley por perfusão anterógrada de detergentes através da vasculatura, produzindo matrizes extracelulares renais acelulares que servem como modelos para repovoamento com células epiteliais renais humanas. A recelularização e o uso do ensaio de perfusão de resazurina para monitorar o crescimento são realizados em biorreatores de perfusão especialmente projetados.

Repovoamento celular epitelial e Preparação de Rodent Matriz Extracelular Andaimes para o desenvolvimento do tecido renal

Uma técnica inovadora de biofabricação foi desenvolvida para projetar construções tridimensionais que se assemelham às características arquitetônicas, componentes e propriedades mecânicas do tecido in vivo. Esta técnica apresenta um material de sacrifício recém-desenvolvido, a borracha BSA, que transfere características espaciais detalhadas, reproduzindo as arquiteturas in vivo de uma ampla variedade de tecidos.

Tridimensional Tecnologia Biomimético: Novel Biorubber Cria Definido micro e macro-escala Arquitecturas em colágeno hidrogéis

Este trabalho descreve dois métodos para estudar o desenvolvimento de órgãos, uma melhor configuração de xenotransplante na membrana corioallantoica (CAM) a partir de embriões aviários que permite a vascularização de órgãos e organóides embrionários cultivados e uma nova direção fixa z método de cultura de órgãos com condições experimentais modificadas que permite imagens confocais de lapso de tempo de alta resolução.

Otimização da Cultura Organóide Renal e Organotípica para Vascularização, Desenvolvimento Estendido e Imagem Microscopia Aprimorada

Descrevemos um protocolo para microdisseção a laser de subsegmentos do rim humano, incluindo o glomerulus, túbulo proximal, membro ascendente espesso, coletor de duto e interstício. O RNA é então isolado dos compartimentos obtidos e o sequenciamento de RNA é realizado para determinar alterações na assinatura transcriômica dentro de cada subsegmento.

Aplicação de microdisseção a laser para descobrir transcrição regional em tecido renal humano

Este protocolo introduz um método para desenvolver um andaime usando rins descelularizados. O protocolo inclui processos de descelularização e recelularização para confirmar a biodisponibilidade. A descelularização é realizada utilizando-se triton X-100 e sulfato de dodecyl de sódio.

Preparação de andaimes renais descelularizados em ratos

Este artigo descreve um protocolo para agregação e encapsulamento de células do baço dentro de uma matriz de membrana basal semissólida. Construções de matriz de membrana basal podem ser usadas em cultura tridimensional para estudar o desenvolvimento de organoides, ou para estudos de transplante in vivo e regeneração tecidual.

Agregação celular encapsulada da matriz da membrana basal para investigação da formação do tecido do baço murino

Os implantes de engenharia de tecidos para cirurgia reconstrutiva raramente progridem além dos ensaios pré-clínicos devido à laboriosa cultura ex vivo , que inclui componentes de andaimes complexos e caros. Aqui, apresentamos um procedimento de estágio único projetado para desvio urinário com um andaime tubular acessível à base de colágeno contendo microenxertos autólogos.

Modelo cirúrgico para tubos uroteliais de engenharia de tecido de estágio único em minipigs

Aqui, apresentamos protocolos que detalham instruções para a implementação de culturas de células 3D usando matrizes de colágeno e colágeno-agarose em um sistema microfisiológico. Esses protocolos suportam a co-cultura de esferoides de túbulo proximal renal e carcinoma de células renais, simulando condições in vivo e permitindo a investigação avançada das interações das células cancerígenas renais.

Co-cultura microfluídica de epitélio renal saudável e tumoral para modelar a progressão do câncer renal

Aqui, descrevemos os protocolos para obtenção de culturas primárias de células epiteliais tubulares renais humanas (HRTEC) do córtex renal para desenvolver monocamadas e culturas tridimensionais em uma matriz extracelular (3D-HRTEC).

Desenvolvimento de culturas primárias de células epiteliais tubulares renais humanas em monocamadas e condições tridimensionais

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Isolamento de células epiteliais primárias do túbulo proximal humano e seu uso na criação de um modelo microfisiológico do túbulo proximal renal

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