Microdissection de segmentos de tecido Renal primária e incorporação com tecnologia de construção romance livre de andaime

Engenharia de tecido renais construções oferecem uma solução para a escassez de órgãos e os efeitos deletérios da diálise. Aqui, descrevemos um protocolo para micro dissecar murino rins para isolamento dos segmentos córtico-medular. Esses segmentos são implantados livre de andaime celular construções, formando organoids renal.

O objetivo geral deste procedimento de dissecção microscópica é isolar segmentos discretos de tecido renal vivo com arquitetura renal intacta para aplicações de engenharia de tecidos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da engenharia de tecidos, como: segmentos inteiros de tecido de órgão primário isolado podem ser colhidos estérilmente e mantidos vivos em cultura? A principal vantagem dessa técnica é que os segmentos contêm arquitetura renal intacta, em oposição ao uso de linhagens celulares para recriar um órgão complexo com mais de 26 tipos diferentes de células.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia da doença renal em estágio terminal, pois essas construções melhorarão a filtração e podem ajudar os pacientes a não fazer diálise. Durante a cirurgia, use equipamento cirúrgico adequado, incluindo máscara e touca, para minimizar o risco de contaminação. Da mesma forma, faça todos os esforços para manter a esterilidade por toda parte.

Comece os preparativos cobrindo a mesa de operação. Em seguida, abra o pacote de instrumentos autoclavados nas cortinas estéreis. Eles devem incluir três hemostáticos pequenos, pinças finas com dentes, pinças finas sem dentes e tesouras de íris retas.

Cubra o centro da mesa cirúrgica com um segundo campo cirúrgico não fenestrado. Antes de montar a sala de cirurgia, prepare 50 mililitros de DBPS suplementado com antibiótico e alíquota de cinco mililitros em um tubo de 15 mililitros. Agora anestesiar um camundongo C57 preto de seis anos de oito a 12 semanas de idade e monitorar periodicamente o nível de anestesia, avaliando seu reflexo pedal com um beliscão firme do dedo do pé.

Em seguida, use um creme depilatório para remover todos os pelos da área ventral do tronco e enxágue o creme e o cabelo com água destilada. Em seguida, transfira o mouse para a mesa de operação e coloque-o em decúbito dorsal sob a cortina não fenestrada. Agora corte uma fenestração quadrada de dois centímetros na cortina sobre o abdômen do rato.

Em seguida, esfregue a pele exposta com iodopovidona seguido de etanol 70% três vezes para esterilizar a pele e completar os preparativos para a cirurgia. Comece a cirurgia usando pinças finas com dentes e tesouras de íris. Faça uma incisão na pele de três a quatro centímetros paralela à linha média, meio centímetro à esquerda da linha média.

Em seguida, segure o peritônio usando uma pinça fina sem dentes e faça uma incisão com uma tesoura de íris para entrar na cavidade abdominal. Em seguida, aplique hemostáticos nas bordas laterais superior e inferior da pele e no peritônio para colocar a tensão lateralmente e aumentar a exposição. Agora mude delicadamente o conteúdo intestinal para a direita do abdômen para expor o rim esquerdo.

Em seguida, coloque suavemente a tração no rim para elevá-lo para fora do abdômen. Agora coloque um hemostático no hilo do rim e use uma tesoura de íris para atravessar o ureter e os vasos renais. Em seguida, transfira o rim para o tubo de DBPS 1% pen-strep no gelo.

Leve este tubo a uma capa de cultura estéril para processamento. Lá, transfira o rim para uma placa de Petri de 60 milímetros e enxágue-o duas vezes com cinco mililitros frescos de DPBS contendo cálcio e magnésio. Após a segunda lavagem, suspenda o rim em cinco mililitros frescos de DBPS em um novo prato de 60 milímetros.

Em seguida, prepare uma placa de Petri adicional contendo apenas cinco mililitros de DBPS para uso posterior. Continue usando a técnica estéril, incluindo luvas estéreis, máscara cirúrgica e bufante para minimizar os riscos de contaminação. Em seguida, coloque a área do palco e a área ao redor do microscópio estéreo.

Em seguida, coloque folhas adesivas de plástico nos botões de foco do microscópio e borrife-as com etanol 70%. Em seguida, ligue o iluminador pescoço de ganso duplo para iluminar o palco. Agora, nas cortinas estéreis, abra um pacote de instrumentos esterilizados contendo pinças finas sem dentes, um cabo de bisturi, uma lâmina de bisturi número 15, dois hemostáticos retos e duas agulhas de calibre 30,5 de calibre oco.

Coloque a lâmina número 15 no cabo do bisturi e conecte um hemostático a cada cubo adaptador de agulha para criar instrumentos de dissecção de agulha. Agora transfira os dois pratos, um com o rim em DPBS e o outro apenas DPBS, para a área do microscópio. Remova a tampa da placa renal e concentre o microscópio na superfície anterior ou posterior do rim com ampliação de 3.2 a 4X.

Em seguida, com a mão não dominante, use uma pinça fina sem dentes para perfurar e prender o rim contra o prato nos pólos inferior e superior do rim. Em seguida, com a mão dominante, use a lâmina número 15 para remover a camada capsular fibrosa translúcida da superfície exposta. Raspe os 0,5 milímetros mais superficiais da superfície exposta da superfície do rim para remover o restante da cápsula.

Continue usando a lâmina número 15 para dissecar uma pirâmide invertida de tecido da área descapsulada que é de aproximadamente dois milímetros quadrados. Em seguida, transfira o tecido para o prato limpo de DBPS e descarte o restante do rim. Agora concentre-se no tecido dissecado e diminua a ampliação para 1,5 a 2,0X.

Usando os dois instrumentos de agulha hemostática como ferramentas de corte, corte o fragmento de tecido em pedaços progressivamente menores até que os segmentos de tecido sejam do tamanho das pontas da agulha ou menores. Cerca de 50 segmentos devem ser produzidos. Esta é uma parte crítica do procedimento.

Cada segmento precisa se aproximar do diâmetro da ponta da agulha de calibre 30-1/2 para evitar segmentos grandes que possam dificultar a difusão. Retorne o tecido para a capa de cultura de tecidos e remova a DPBS usando uma micropipeta P1000. Em seguida, adicione cinco milímetros de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de caneta-estreptococo.

Em seguida, cultive o tecido ou implante-o dentro de construções celulares imediatamente. A viabilidade dos segmentos renais íntegros produzidos pelo procedimento descrito foi examinada ao longo de três dias em cultura usando um ensaio de viabilidade. O AM de cálcio fluorescente verde está presente com atividade de esterase intracelular indicativa de células vivas.

O homodímero de etídio-1 fluorescente vermelho é observado com perda de integridade da membrana plasmática. Quando os segmentos renais foram incorporados em construções de fibroblastos endoteliais livres de andaimes, no terceiro dia eles foram incorporados às construções celulares para formar estruturas intactas. Os construtos mantiveram sua rede endotelial pré-vascular mostrada pela marcação com fator de von Willebrand.

As células epiteliais renais podem ser vistas em verde marcadas por citoquertain-18. Para testar a funcionalidade renal in vitro, as construções foram incubadas com albumina marcada com FITC. Embora houvesse albumina residual encontrada nos segmentos de tecido renal incorporado, também havia pontos quentes nas células epiteliais tubulares renais.

Esses pontos quentes são a albumina que atravessa intraluminalmente, o que se acredita representar a recaptação da albumina na construção celular do segmento renal. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar segmentos renais de rins murinos para aplicações de engenharia de tecidos. Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito em uma a 1-1 / 2 horas.

Após este procedimento, outros métodos, incluindo a semeadura de construtos celularizados, podem ser realizados para responder a outras questões relacionadas à fabricação e caracterização do construto renal. Não se esqueça de que trabalhar com instrumentos cirúrgicos e cilindros de oxigênio pressurizados pode ser extremamente perigoso. Tenha cuidado ao trabalhar com objetos pontiagudos e lembre-se de ancorar tanques de oxigênio em uma bancada de laboratório.