Aplicação de microdisseção a laser para descobrir transcrição regional em tecido renal humano

A microdissecção a laser permite a análise transcriptômica de regiões espacialmente definidas dentro das amostras de tecido renal. Isso nos permite a oportunidade única de identificar estruturas de interesse, mesmo após a ocorrência de mudanças induzidas pela doença. As principais vantagens dessa metodologia são sua complementaridade com outras tecnologias ômicas, como o sequenciamento de RNA de célula única.

Proporciona notável economia de tecidos e até permite a detecção de transcritos pouco expressos. Depois de adquirir a amostra de tecido, use um criostato ajustado para menos 20 graus Celsius para cortar a amostra com uma espessura de 12 micrômetros e use o adaptador de lâmina para fixar a amostra em uma lâmina de microdissecção a laser especializada. Dentro de 10 dias após a criosecção, misture 89,2 microlitros de 10% BSA livre de RNase em PBS com quatro microlitros de faloidina FITC, 1,5 microlitros de DAPI, dois microlitros do anticorpo de interesse diretamente conjugado ao Alexa Fluor 546 e 3,3 microlitros de inibidor de RNase.

Lave a lâmina em menos 20 graus Celsius 100% acetona por um minuto e coloque a lâmina em uma câmara de umidade. Lave a parte superior da lâmina duas vezes com PBS fresco sem RNase por 30 segundos por lavagem, seguido por duas lavagens de 30 segundos com 10% de BSA em PBS sem RNase. Após a última lavagem, trate a amostra com a solução de anticorpos preparada por cinco minutos em temperatura ambiente antes de lavar mais duas vezes com 10% de BSA em PBS livre de RNase.

Após a segunda lavagem, seque a lâmina ao ar por cinco minutos em uma capa de cultura de tecidos antes de carregá-la na plataforma de corte de microdissecção a laser. Instale tubos de coleta de microcentrífuga de 500 microlitros autoclavados, apropriados para trabalhos de PCR, contendo 50 microlitros de tampão de extração de um kit de isolamento de RNA no dispositivo. Após o carregamento, identifique as regiões de interesse dentro da amostra por coloração, morfologia e localização.

Use imunofluorescência para delinear pelo menos 500.000 segmentos quadrados de micrômetro de interesse. Em seguida, inicie a microdissecção a laser para extirpar a região usando uma potência de laser superior a 40. Após a conclusão do processo de microdissecção a laser, tampe os tubos de coleta da microcentrífuga e agite os tubos vigorosamente para garantir que o conteúdo se mova das tampas para o fundo dos tubos.

Após a centrifugação, incube os tubos em banho-maria a 42 graus Celsius por 30 minutos antes de centrifugar os tubos novamente. Em seguida, transfira os sobrenadantes para novos tubos de 500 microlitros de armazenamento de 80 graus Celsius negativos. A identificação de subsegmentos tubulares no rim é realizada por meio da coloração de anticorpos de marcadores tubulares exclusivos, além da morfologia celular e pontos de referência estruturais.

A marcação de fluorescência em conjunto com as características morfológicas do tecido e o posicionamento espacial das estruturas da imagem facilitam a visualização dos subsegmentos renais com alto grau de confiança. Nesta análise representativa de sequenciamento a jusante, a taxa de sucesso de atender à entrada mínima da área de dissecação foi superior a 90%, resultando em uma alta quantidade total de mRNA disponível para detecção de genes. Nesta análise, 100% das amostras atingiram o limiar mínimo de detecção de, pelo menos, 10 000 genes.

Após a microdissecção a laser, a análise de enriquecimento da expressão gênica de marcadores conhecidos pode ser comparada com as de outros compartimentos. Nesta análise, um marcador para cada subsegmento foi identificado por meio da transcriptômica regional de microdissecção a laser que também produziu uma coloração imuno-histoquímica específica do subsegmento de néfron correspondente. É importante observar que a microdissecção a laser depende muito da experiência do usuário para identificar com precisão as estruturas de interesse a serem dissecadas.

Essa técnica permite o estudo de assinaturas regionais específicas de expressão gênica que podem ser usadas para avaliar possíveis vias envolvidas na progressão da doença, bem como a biologia do tecido saudável.