Microscopia de contraste de fase para avaliação de mutantes de desenvolvimento em Streptomyces

Comece com placas de ágar contendo colônias de cepas selvagens e mutantes de Streptomyces coelicolor, uma bactéria filamentosa do solo.

Coloque uma lamínula estéril sobre uma região de denso crescimento de colônias onde os filamentos aéreos, que são filamentos que se estendem acima da superfície da colônia, são claramente visíveis.

Pressione suavemente a lamínula para transferir os filamentos aéreos e os esporos associados para a superfície da lamínula.

Em seguida, pegue uma lâmina de microscópio com mídia de montagem e monte a lamínula com o lado da célula voltado para baixo para preservar as estruturas bacterianas.

Coloque a lâmina em um microscópio stage, adicione uma gota de óleo de imersão na lamínula e alinhe a objetiva.

Usando microscopia de contraste de fase, adquira imagens dos filamentos aéreos de cepas selvagens e mutantes.

Os filamentos do tipo selvagem exibem esporos de tamanho uniforme e regularmente espaçados.

Em contraste, as cepas mutantes exibem defeitos, como filamentos salientes, esporos irregulares ou esporos lisados, revelando diferenças fenotípicas de desenvolvimento entre o tipo selvagem e os mutantes.

Para preparar uma lamínula de crescimento bacteriano, use uma pinça estéril para pegar uma lamínula estéril e coloque a lamínula em uma placa de ágar MS onde o crescimento bacteriano é denso. Usando uma pinça, pressione suavemente a parte de trás da lamínula para garantir a transferência suficiente de esporos bacterianos e micélio aéreo. Pegue a lamínula da placa e coloque-a em um ângulo de 45 graus com o material da célula voltado para a superfície de uma lâmina de microscópio contendo uma gota de 15 microlitros de 50% de glicerol.

Deixe a lamínula cair sobre o glicerol, o que reduzirá as bolhas de ar. Para realizar a microscopia de contraste de fase em vários intervalos de tempo, coloque a lâmina preparada no estágio do microscópio e adicione uma gota de óleo de imersão no centro da lamínula. Gire a objetiva de fase 100x no lugar e defina a torre do condensador para a configuração de fase correspondente adequada.

Quando a lente objetiva estiver em contato com o óleo, use apenas o botão de ajuste fino para focar a imagem. Examine vários campos de visão para discernir diferenças perceptíveis e consistentes entre as cepas mutantes e o tipo selvagem. Como a capacidade de formar esporos, tamanho e forma dos esporos e o número total de esporos.