Name: Formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores para acessibilidade de cromatina medida em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda o método FAIRE para determinar acessibilidade da cromatina em células de mamíferos usando reticulação com formaldeído e sonicação. Esta técnica reprodutível não requer equipamentos especializados além de um sonicador.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostaria de agradecer Tilman Borggrefe (Universidade de Giessen) gentilmente partilha o dispositivo sonication. O trabalho de M.L.S. é suportado por concessões do programa IMPRS-HLR, SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, a excelência Cluster sistema Cardio-pulmonar (ECCPS, EXC. o 147/2), o Deutsche Krebshilfe (111447) e a Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3) da sociedade Max Planck.

1. dia 1: Cultura de células
<ol><li>Cultura de células a serem analisados para a quantidade desejada. Mídia e as condições de cultura celular depende dos tipos de célula sob investigação. Nota: Em princípio, qualquer célula eucariótica é passível de uma análise de acessibilidade de cromatina de FAIRE. Para este experimento, 4 x 106 HEK-293T células são semeadas em um prato único de 10 cm em meio DMEM suplementado com 10% (v/v) FBS e 1% (p/v) penicilina/estreptomicina e incubados a 5% de CO2 e 37 ° C por 24 h até as células atinjam a confluência de 70-80% (~ 8 x 10 6 células por prato).</li>
</ol>2. dia 2: Reticulação de formaldeído e colheita de célula
Cuidado: Formol é altamente tóxico e deve ser sempre utilizada sob uma coifa. Use roupas de proteção (luvas e jaleco). Descarte os resíduos adequadamente.
<ol><li>Adicione formol diretamente para o meio de cultura celular em uma coifa para atingir uma concentração final de 1% (v/v) (270 µ l de formol 37% (v/v) de 10 mL de meio de cultura celular). Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (20-25 ° C) e matou as placas manualmente cada 2 min. Nota: O tempo de reticulação pode ser ajustado de acordo com o tipo de célula. Para a maioria das linhas celulares, 10 min de reticulação é adequada. Para tecidos, incubação do tempo pode ser necessário para permitir a fixação de todas as células.</li>
	<li>Adicionar glicina a uma concentração final de 0,125 M para saciar o formaldeído (adicionar 500 µ l de um estoque de glicina de 2,5 M a 10 mL de meio de cultura). Incubar durante 5 min à temperatura ambiente e matou a cada 2 min.</li>
	<li>Lavar as células 3 x com gelo frio PBS (8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KCl, 1,44 g/L, Na2HPO4 · 2 H2O, 0,24 g/L KH2PO4, ajustar o pH para 7,4 com HCl ou NaOH). Aspire o meio e lavar diretamente na placa de cultura de células ou frasco, adicionando 10 mL de PBS. Repeti esta etapa duas vezes, sendo muito cuidadoso no caso de células frouxamente aderentes como HEK-293T. Adicione PBS cuidadosamente para o lado do prato para evitar o desprendimento das células.</li>
	<li>Após a terceira lavagem, Ressuspender as células em 1 mL de PBS frio gelo e transferir para um tubo de reação de 1,5 mL no gelo. Use um raspador de célula para separar as células quando necessário. Nota: Ao iniciar com um material limitado, use tubos de ligação a DNA baixos para evitar a perda de amostra durante o procedimento.</li>
	<li>Centrifugue por 5 min a 300 x g a 4 ° C em uma centrífuga de mesa refrigerada. Desprezar o sobrenadante aspirando-lo cuidadosamente.</li>
</ol>3. pilha Lysis e fragmentação da cromatina
<ol><li>Ressuspender as células em tampão de Lise FAIRE de 1 mL (1% (p/v), 10 mM de EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 10 µ g/mL leupeptin, 10 µ g/mL aprotinina, 2 mM PMSF) e ressuspender as células pipetando cuidadosamente subindo e descendo várias vezes. Incube durante 20 min no gelo. Armazene as amostras a-80 ° C a esta etapa, se necessário.</li>
	<li>Proceda à sonicação a quitosana DNA de cisalhamento-lo para um tamanho médio de 200-300 bp. As configurações específicas do sonicador devem ser determinadas para cada fonte de amostras e o dispositivo usado sonication. Em qualquer caso, certifique-se de que o DNA é cortado com eficiência. Um passo de otimização para a tosquia de DNA é descrito no passo 5.14. Fixe as amostras no gelo durante sonication para evitar o aquecimento da amostra.</li>
	<li>Centrifugar a amostra por 15 min e 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Transferi o sobrenadante para um novo tubo de reação. Dividi as amostras em 100 alíquotas µ l. Armazene as amostras a-80 ° C, se necessário. Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto.</li>
</ol>4. de-reticulação de controle DNA
<ol><li>Leve um 100 µ l alíquota da etapa 3.4 para reverter o crosslink e para ser usado como uma referência para o DNA total. Adicionar 10 µ l de RNase-A (10 mg/mL) e incubar durante 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de Proteinase K (20 mg/mL). Use um thermo-bloco programável para incubar por 4 h a 37 ° C e em seguida para 6 h a 65 ° C para decompor as proteínas e inverter as ligações cruzadas. Finalmente, mantenha as amostras em 4 ° C até que o protocolo seja retomado e em seguida, avance para o passo 5. Nota: Outros protocolos FAIRE usam cromatina amostras de células que não tenham sido quitosana como referência, abolindo assim a necessidade de reticulação11. O fato de que estas amostras não são quitosana poderia levar a diferenças na eficiência sonication ou na estabilidade do DNA, portanto, o uso de amostras de referência totais do DNA que sofreram o mesmo procedimento como as amostras de teste é mais preciso.</li>
</ol>5. dia 3: Fenol: clorofórmio purificação do DNA
<ol><li>A não-de-ligação cruzada leve alíquota da etapa 3.4. Adicionar 10 µ l de RNase-A (10 mg/mL) e incubar durante 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>O passo do formulário alíquota não-de-quitosana 5.1 e a amostra de quitosana da etapa 4.2 e prosseguir em paralelo. Adicione H2O para alcançar um volume final de 300 µ l.</li>
	<li>Adicione 300 µ l de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio (25:24:1) em uma coifa e vórtice vigorosamente. Cuidado: O fenol é corrosivo e tóxico e deve ser utilizado sempre sob uma coifa. Usar roupas de proteção (luvas e jaleco), verifique se os tubos de reação são bem fechados e descartar os resíduos adequadamente.</li>
	<li>Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Transferi com cuidado, 280 µ l da fase aquosa superior para um novo tubo de reação. Certifique-se para não levar todos os restos do período do intérfase, que também contém proteínas. Descarte a fase inferior restante como resíduos de solventes orgânicos.</li>
	<li>Repita as etapas de 5.3 a 5.5 e transferir cuidadosamente 270 µ l da fase aquosa superior para um novo tubo de reação.</li>
	<li>Adicione 270 µ l de clorofórmio em uma coifa e vórtice vigorosamente. Nota: Este passo é usado para eliminar qualquer fenol restante da amostra.</li>
	<li>Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Transferi com cuidado, 250 µ l da fase aquosa superior para um novo tubo de reação, tomando cuidado para não carregar todos os restos da interfase. Descarte a amostra restante como resíduos de solventes orgânicos.</li>
	<li>Adicione 25 µ l de 5 M de NaCl e 250 µ l de isopropanol. Adicione 5 µ l de glicogênio (20 mg/mL) como o portador de DNA. Misture bem invertendo-se os tubos e incube por 20 min em temperatura ambiente. Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C, para precipitar o DNA.</li>
	<li>Lave o sedimento de DNA com 400 µ l de etanol 70% (v/v). Centrifugação por 10min a 13.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante cuidadosamente e deixar o sedimento secar por 10 min à temperatura ambiente. Resuspenda em buffer de TE 100 µ l (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Incube a amostra de DNA não-de-quitosana grátis por 4 h a 65 ° C para remover as referências cruzadas entre ADN. Armazenar as amostras a-20 ° C.</li>
	<li>Quantificar a quantidade de DNA usando um espectrofotômetro e executar uma alíquota para verificar o tamanho do fragmento em um gel de agarose 2% (p/v). Ajustar o tempo de corte e intensidades, dependendo dos resultados da análise de tamanho de DNA por agarose gel eletroforese, para obter um tamanho médio de 200-300 bp.</li>
</ol>6. determinação do livre Versus Total DNA por PCR em tempo Real quantitativo (qRT-PCR)
<ol><li>A proporção de DNA livre nucleossoma (na seguir referida como DNA gratuito) versus total de DNA é determinada por qRT-PCR17,18. As amostras também podem ser analisadas quantitativamente por microarray hibridização ou sequenciamento profundo para determinações de todo o genoma.</li>
	<li>Projeto qPCR cartilhas para as regiões a serem testadas e para controles positivos e negativos. Nota: Controlos positivos apropriados são primeiras demão situadas no promotor dos genes transcritos ativamente das tarefas domésticas tais como ACTB, GAPDH, TPI1 ou TUBA1A (codificação β-actina, GAPDH, TPI ou α-tubulina). Apropriados controles negativos são encontrados em regiões de heterocromatina ou gene desertos. Outros controles negativos apropriados podem ser projetados em regiões genômicas adjacentes para o locus dinamicamente regulamentado sob investigação de Controlarar para diferenças de número de cópia local (tabela 1).</li>
	<li>Diluir as amostras de DNA para uma concentração final de 10 ng / µ l de tampão TE e considerar o fator de diluição para os cálculos finais (ver passo 6.5).</li>
	<li>Configurar uma reação qPCR em triplica em uma placa de 96 poços, com o seguinte mix de reação por alvéolo: modelo DNA: 20 ng (2 µ l), para a frente da primeira demão 200 nM (0,4 µ l de um estoque de 5 µM), primer reverso 200 nM (0,4 µ l de um estoque de 5 µM) , um comercial pronto para usar a mistura de reação contendo corante verde (5 µ l de um estoque de 2 x) e H2O a 10 µ l.</li>
	<li>Executar em um dispositivo de qPCR em tempo real, usando o modo de quantificação absoluta e determinar o Ct das amostras com os pares diferentes da primeira demão. Calcule a taxa de recuperação do DNA livre de DNA total para cada primeira demão usando a seguinte fórmula, tendo em conta os factores de diluição da etapa 6.3: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57272/57272eq1.jpg"> Resultados representativos e um cálculo de exemplo são dadas na tabela 2.</li>
	<li>Para compensar as diferenças entre as amostras, normalize para a taxa de recuperação do controle positivo: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57272/57272eq2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Struhl, K., Segal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determinants of nucleosome positioning.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?</a> Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+ends+of+Drosophila+heat+shock+genes+in+chromatin+are+hypersensitive+to+DNase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I.</a> Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).</li>
<li>Yuan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+nucleosome+positions+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae.</a> Science. 309 (5734), 626-630 (2005).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomewide+demarcation+of+RNA+polymerase+II+transcription+units+revealed+by+physical+fractionation+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).</li>
<li>Nagy, P. L., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-assisted+isolation+of+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).</li>
<li>Krinner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+domains+downstream+of+TSSs+promote+high+levels+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression.</a> Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).</li>
<li>Gomez, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+Chromatin+Accessibility+at+Repetitive+Elements+Links+Stem+Cells+with+Human+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer.</a> Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).</li>
<li>Gaulton, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+open+chromatin+in+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A map of open chromatin in human pancreatic islets.</a> Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).</li>
<li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAIRE+%28Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements%29+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).</li>
<li>Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXA1+is+a+key+determinant+of+estrogen+receptor+function+and+endocrine+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response.</a> Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).</li>
<li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li>
<li>Davie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+transcription+factors+and+regulatory+regions+driving+in+vivo+tumor+development+by+ATAC-seq+and+FAIRE-seq+open+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling.</a> PLoS Genet. 11 (2), e1004994(2015).</li>
<li>Meyer, C. A., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+mitigating+bias+in+next-generation+sequencing+methods+for+chromatin+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+variation+associated+with+liver+metabolism+is+mediated+by+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements.</a> Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28(2016).</li>
<li>Skinner, D. Z. <a target="_blank" href="https://dl.sciencesocieties.org/publications/cs/abstracts/54/1/455">Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications.</a> Crop Sci. 54 (1), 455(2014).</li>
<li>Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. <a target="_blank" href="http://www.gene-quantification.com/national-measurement-system-qpcr-guide.pdf">Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR).</a> Natl. Meas. Syst. , 50(2013).</li>
<li>Rodríguez-Gil, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCR4-NOT+complex+contributes+to+repression+of+Major+Histocompatibility+Complex+class+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription.</a> Sci. Rep. 7 (1), 3547(2017).</li>
<li>Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MHC+class+II+expression+by+interferon-gamma+mediated+by+the+transactivator+gene+CIITA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA.</a> Science. 265 (5168), 106-109 (1994).</li>
<li>Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+major+histocompatibility+complex+class+II+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of major histocompatibility complex class II genes.</a> Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).</li>
<li>Ting, J. P. -Y., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+MHC+class+II+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic control of MHC class II expression.</a> Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).</li>
<li>Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+open+chromatin+with+formaldehyde-assisted+isolation+of+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements.</a> Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).</li>
<li>Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+formaldehyde-assisted+isolation+of+regulatory+elements+%28FAIRE%29+to+isolate+active+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA.</a> Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).</li>
<li>Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+protocol+for+formaldehyde-assisted+isolation+of+regulatory+elements+%28FAIRE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE).</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).</li>
<li>Giresi, P. G., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+active+regulatory+elements+from+eukaryotic+chromatin+using+FAIRE+%28Formaldehyde+Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements).</a> Methods. 48 (3), 233-239 (2009).</li>
<li>Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+Chromatin+Accessibility+in+Gene-Regulatory+Regions+from+Transcriptomics+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data.</a> Sci. Rep. 7 (1), 4660(2017).</li>
<li>Pique-Regi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+inference+of+transcription+factor+binding+from+DNA+sequence+and+chromatin+accessibility+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data.</a> Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

FAIRE é um método robusto e de baixo custo, permitindo a identificação de regiões livres de nucleossoma. É baseado no princípio de que o DNA enrolado nucleosomes pode ser facilmente quitosana para as histonas. Uma extração de fenol: clorofórmio é usada para separar o DNA de proteínas, que se encontra na fase de fenol inferior e até certo ponto no período do intérfase (Figura 1) o não-quitosana e fragmentos de DNA livre de proteína. Portanto, as regiões nucleossoma-free estão sobre-representados na fração de DNA livre na fase aquosa. Um número de publicações descreve protocolos detalhados de FAIRE método23,24,25,26, que pode ser consultada para complementar o procedimento descrito aqui.
Semelhante a outros métodos usados para determinar a estrutura da cromatina, o método FAIRE criticamente também depende de tosquia ideal do DNA. Se os fragmentos são muito longos, qualquer região livre de nucleossoma será mascarada adjacentes ligados a cromatina DNA. Se os fragmentos são muito pequenos, a deteção por qPCR ou sequenciamento profundo torna-se muito difícil. Por esta razão, o sonication do DNA é um parâmetro crucial que deve ser controlado e otimizado para obter fragmentos em torno de 200-300 comprimento de bp, que representam os nucleosomes 1-2 (Figura 4).
Outro parâmetro que pode afetar o resultado final é a reticulação da amostra. Embora o procedimento de fixação descrito aqui é válido para a maioria das linhas de celular, o pesquisador deve avaliar cuidadosamente este passo para a amostra particular sob estudo, especialmente quando usando tecidos, onde tempos mais longos de fixação podem ser necessários para permitir que o formaldeído para atingir as células em todas as amostras de tecido.
Ao contrário de outros métodos, tais como a DNase I ou hipersensibilidade micrococcal nuclease, ChIP ou ATAC, FAIRE não depende de uma atividade enzimática ou anticorpos específicos, e, portanto, que não precisa de titulação ou otimização das condições de reação. Isto faz FAIRE um método ideal para medir a acessibilidade de cromatina para laboratórios com pouca experiência no campo da cromatina. Além disso, experimentos piloto só são necessários a fim de otimizar a etapa de corte do DNA e o tempo de reticulação, quando necessário.
O método foi desenvolvido inicialmente em fermento6, mas ele também foi estendido para células de mamíferos. O DNA purificado com o método FAIRE pode ser usado para sequenciamento profundo, permitindo a caracterização de todo o genoma do status da cromatina. Isto já provou útil em um número de estudos8,9,10,11,12,13,19,27, 28.
Resultados de experimentos de FAIRE-seq mostram uma grande sobreposição com os resultados obtidos por outros métodos como DNase-seq14, embora algumas diferenças surgem. Isto é devido a diferenças metodológicas, como por exemplo nucleosomes relaxados ou remodeladas ainda poderiam dificultar a clivagem por DNase eu, enquanto estas regiões de DNA seriam menos propensas a produzir ligações cruzadas do DNA/proteína e, portanto, seria determinadas como nucleossoma-livre regiões usando FAIRE9. Também, a presença de proteínas não-histonas como ARN-polimerase ou proteínas de leitor para marcas epigenéticas poderia resultar em ligações cruzadas do DNA/proteína e, portanto, seria interpretada como regiões de proteína-embalados em experimentos FAIRE. Estas limitações são inerentes a cada método utilizado para a determinação do estado de cromatina, aumentando assim a necessidade de usar uma combinação de diferentes métodos para obter uma visão abrangente.

O DNA genômico das células eucarióticas é hermeticamente embalado para os nucleossomas, que precisa ser removido ou remodelada para permitir a interação com o DNA de outras proteínas. A ativação transcricional de um gene, geralmente, resulta em uma configuração mais aberta da sua estrutura de partícula, particularmente no nucleossoma + 11, para facilitar a transcrição pela RNA polimerase. Também, regiões reguladoras tais como promotores e potenciadores de sofrem mudanças dinâmicas em sua acessibilidade de cromatina para permitir a interação com modificadores de cromatina ou de fatores de transcrição2. Várias abordagens têm sido desenvolvidos para identificar essas regiões livres de nucleossoma. Estes incluem a sensibilidade de nucleases como DNase eu3 ou nuclease micrococcal4, que só pode acessar o DNA quando ele não é firmemente disposto ao redor os nucleossomas. Outros métodos para a identificação da cromatina aberta ou DNA livre incluem a integração mediada por transposase de elementos retrotransposable (ensaio para Transposase-acessível da cromatina, ATAC)5, ou cromatina (ChIP) de imunoprecipitação usando anticorpos contra histonas. O método FAIRE não é baseado na capacidade de uma enzima para alcançar o DNA ou a ligação de um anticorpo para uma proteína em particular, mas em vez disso depende a purificação das regiões nucleossoma-livre por uma extração de fenol: clorofórmio6,7. Neste método, o DNA é covalentemente a proteínas da cromatina pelo formaldeído de agente de reticulação e é depois cortado em pequenos pedaços por sonication. Regiões de cromatina firmemente embaladas terá ligações cruzadas de DNA/proteína abundantes, enquanto regiões de DNA com nenhum ou poucos nucleosomes terá pouca ou nenhuma complexos de DNA/proteína de ligação cruzada. Uma extração de fenol: clorofórmio permite a purificação do DNA livre na fase aquosa, enquanto a quitosana de DNA para as proteínas é capturado na fase orgânica fenol ou interfase aquosa-orgânica juntamente com as proteínas não-quitosana. A quantificação deste DNA livre em comparação com uma referência de amostra de DNA total permite a identificação das regiões da cromatina livre. O método FAIRE pode ser usado para a caracterização das regiões genômicas individuais conforme descrito aqui, mas também é adequado para a identificação de acessibilidade de todo o genoma da cromatina quando acoplado ao sequenciamento profundo, conforme descrito em diferentes modelos8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. os resultados obtidos por outros métodos como ATAC-seq e FAIRE-seq em grande parte se sobrepõem a14. O método FAIRE é um muito robusto, barato e fácil de executar o método para identificar regiões livres de nucleossoma. Ao contrário de outros métodos, que não exige experiências piloto para determinar o nível apropriado de digestão conforme exigido por nucleases (DNase-seq, seq-MNase) ou transposases (ATAC-seq) e discutidos detalhadamente em uma recente revisão de15. Os únicos parâmetros para ser ajustado são o sonication condições e em alguns casos, o tempo de fixação. Este artigo descreve um protocolo simples que é apresentado esquematicamente na Figura 1 , e que não exige qualquer equipamento especial que não seja um sonicador. O protocolo pode ser executado em um tempo razoavelmente curto e faz FAIRE um método fácil e confiável para testar a acessibilidade de cromatina em um número de diferentes tipos de células variando de pulmão de células11 de células primárias, obtidas a partir de fígados de rato16.

<table><tbody><tr><td>Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico 25: 24: 1</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio, 20 mg / ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB1162B</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, 20 mg / ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, 10 mg / ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>milliTUBE 1 ml AFA Fiber</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td></td></tr><tr><td>Suporte milliTUBE 1ml</td><td>Covaris</td><td>500371</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 Ultrassônico focalizado</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR em tempo real StepOnePlus</td><td>aplicado biossistemas</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores para acessibilidade de cromatina medida em células de mamíferos

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Expressão gênica adequadas em resposta a sinais extracelulares, ou seja, específicos do tecido e linhagem genética da transcrição, criticamente depende altamente definidos Estados de organização da cromatina. A dinâmica arquitetura do núcleo é controlada por vários mecanismos e formas dos programas de saída transcricional. É, portanto, importante determinar a acessibilidade de cromatina locus específico de forma confiável de preferência independente de anticorpos, que podem ser uma fonte potencialmente confundimento de variabilidade experimental. Acessibilidade de cromatina pode ser medida por vários métodos, incluindo o ensaio de isolamento Formaldehyde-Assisted de elementos normativos (FAIRE), que permitem a determinação de acessibilidade geral da cromatina em um número relativamente baixo de células. Aqui descrevemos um protocolo FAIRE que permite a identificação simples, confiável e rápida das regiões genômicas com uma ocupação de baixa proteína. Neste método, o DNA é covalentemente ligado às proteínas da cromatina usando formaldeído como agente de reticulação e cortado em pedaços pequenos. O DNA gratuito é depois enriquecido usando extração fenol: clorofórmio. A proporção de DNA livre é determinada pela reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) ou sequenciação de ADN (DNA-seq) em comparação com uma amostra de controle que representa o DNA total. As regiões com uma estrutura mais flexível de cromatina são enriquecidas na amostra grátis do DNA, permitindo assim a identificação de regiões genômicas com baixa compactação da cromatina.

Usamos o método FAIRE para medir diferenças na acessibilidade de cromatina de genes II MHC classe nas células HEK293T como publicado19. MHC classe II codificação genes são expressos em células apresentadoras (APCs), constitutivamente ou em resposta a citocinas sinalização20. A expressão de genes MHCII é impulsionada por um complexo ativador que se liga a elementos específicos de DNA, denominados caixas XY, localizadas no promotor e potenciadores destes genes21,22. Isso se reflete no nível de cromatina, como revelado pela nossa análise FAIRE de regiões selecionadas do MHC classe II HLA-DPB1 e HLA-DMA. Estes experimentos mostraram que a cromatina é aberta nas regiões englobando as caixas XY, enquanto é mais compacto em organismos gene (Figura 2).
Por exemplo, para os cálculos, neste particular experimento, dilui-se o total de DNA 10 vezes (factor de diluição 10), e a amostra de DNA livre não foi diluída (factor de diluição 1) para o qRT-PCR. O Cts obtidos para as diferentes regiões testadas e os cálculos para obter os rácios de recuperação final e recuperação relativa rácios são listados no tabela 2. Estas relações de recuperação relativa foram obtidas usando o promotor ACTB como controlo positivo. Observe que esses cálculos são para um das repetições usadas para gerar os resultados mostrados na Figura 2.
Em um contexto diferente, acessibilidade de cromatina foi testada em um modelo de expressão gênica inducible. Neste caso, mudanças rápidas de compactação da cromatina, em resposta ao fator de necrose tumoral estímulo pró-inflamatórias (TNF) foram medidas. Células HeLa foram deixadas não tratada ou estimulado com TNF por 1h, seguido de FAIRE para medir a compactação da cromatina para a expressão de controle de região promotora do gene da TNF-responsivo citocinas interleucina 8 (IL8) de codificação. Estes resultados mostraram uma acessibilidade de cromatina fortemente aumentado no IL8 promotor de TNF-estimulou as células (Figura 3). A acessibilidade no promotor IL-8 após estimulação TNF é ainda maior do que a encontrada no promotor ACTB mostrando uma remodelação dramática cromatina nesta região reguladora. Como a taxa de recuperação obtida neste caso é maior do que o obtido na região como controlo positivo (promotor ACTB) a proporção relativa de recuperação é maior do que um.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig1.jpg"> Figura 1: fluxo de trabalho The FAIRE. As células são quitosana diretamente no frasco de cultura celular ou prato adicionando formol (A). Após têmpera do formaldeído, as células são lavadas três vezes com PBS frio de gelo (B) e transferidas para um tubo de reação, onde são resuspended em tampão de Lise FAIRE e lisados para distorcer o DNA (C). Uma alíquota da cromatina extraída é de quitosana por aquecimento a 65 ° C, para obter a referência de DNA total (D), e depois o DNA gratuito é extraído usando fenol: clorofórmio, tanto a quitosana e as alíquotas de quitosana (E). Finalmente, o DNA é quantificado, e a razão de livre vs total que DNA é calculada (F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig2.jpg"> Figura 2: determinação da acessibilidade de cromatina no gene MHC classe II cluster em células HEK293T. HEK293T células foram analisadas por FAIRE. A relação entre livre contra DNA total (i. e., a proporção relativa recuperação) foi determinada para o promotor do gene ACTB como um controle positivo, uma região de heterocromatina na Chr. 12 como controle negativo e as regiões reguladoras e corpos de gene do MHC classe II genes HLA-DMA e HLA-DPB1. A parte superior mostra uma representação esquemática do locus e as posições dos primers. Barras de erro representam desvios-padrão de duas repetições biológicas medidas em triplica. A figura foi modificada de um relatório publicado19. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig3.jpg"> Figura 3: alterações de acessibilidade de DNA no promotor IL8 em resposta ao tratamento de TNF. Células HeLa foram estimuladas com TNF (20 ng/mL) para 1 h e analisados por FAIRE. A relação entre livre versus total de DNA foi determinado para o promotor de ACTB (controle positivo), uma região de heterocromatina na Chr. 12 (controle negativo) e o promotor IL8. Barras de erro representam erros-padrão da média (SEM) de três repetições biológicas medidas em duplicatas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig4.jpg"> Figura 4: otimização das condições sonication. Extraído de 293T células de cromatina foi sonified usando um sonicador concentrado com tubos apropriados (Tabela de materiais). A cromatina foi lisada para a hora indicada com repetições de 30 s, com as seguintes configurações: potência de pico 150, factor de serviço de 15, ciclos por explosão 500, seguido de potência de pico de 30 s: 2.5, o factor de serviço de 15, ciclos por explosão 500. A cromatina resultante foi de-quitosana, purificados por extração fenol: clorofórmio e carregado em um gel de agarose 2%. Manchado de gel de brometo de etídio é mostrado, e as posições dos marcadores de peso molecular são indicadas em bp. Neste experimento, obteve-se o tamanho ideal da cromatina (200-300 bp) depois de 20 min de sonication. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primeira demão</td>
			<td>Sequência de</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB-promotor-F</td>
			<td>AAAGGCAACTTTCGGAACGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB-promotor-R</td>
			<td>TTCCTCAATCTCGCTCTCGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>12. Chr. controle negativo-F</td>
			<td>ATGGTTGCCACTGGGGATCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>12. Chr. controle negativo-R</td>
			<td>TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-XY-caixa-F</td>
			<td>CATCAGTCACTGGGGAGACG</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-XY-caixa-R</td>
			<td>GCTTCCCAGCCCAGTTACAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-5'-F</td>
			<td>GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-5'-R</td>
			<td>AGCTGCTATGTGTGGTTGGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-3'-F</td>
			<td>TGGGGACCTAGTTAGGGAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-3'-R</td>
			<td>AGATCCATGGGAGGAGGCTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-XY-caixa-F</td>
			<td>GTCCAATCCCAGGGTCACAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-XY-caixa-R</td>
			<td>TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-5'-F</td>
			<td>GCGTGTTCATGTCTGCATCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-5'-R</td>
			<td>TGATCCTCAGAGCCTGGACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-3'-F</td>
			<td>CCAGCCTAGGGTGAATGTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-3'-R</td>
			<td>GCCTGGGTAGAAATCCGTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IL8 Promotor-F</td>
			<td>GTGATGACTCAGGTTTGCCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>IL8 Promotor-R</td>
			<td>CTTATGGAGTGCTCCGGTGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Primers para qPCR.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57272/57272table2.jpg"> Tabela 2: cálculos de exemplo de FAIRE relativa recuperação rácios. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/Table_2.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

A plasticidade da arquitetura nuclear é controlada por mecanismos epigenéticos dinâmicos, incluindo não-codificantes RNAs, DNA methylation, nucleossoma reposicionamento, bem como composição de histona e modificação. Aqui descrevemos um protocolo de isolamento Formaldehyde-Assisted de elementos normativos (FAIRE) que permite a determinação de acessibilidade de cromatina de forma reprodutível, barata e simples.

Formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores para acessibilidade de cromatina medida em células de mamíferos

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

O objetivo geral deste experimento é determinar a acessibilidade da cromatina de um locus genético por meio da reticulação covalente do DNA às proteínas associadas, seguida de purificação e quantificação do DNA livre. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da cromatina, pois a acessibilidade do DNA pode ser determinada, independentemente do tipo de célula em células não tratadas e também em células submetidas à remodelação da cromatina. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer o uso de enzimas para clivar o DNA ou anticorpos que precisam ser titulados para cada ambiente experimental.Este protocolo tem a vantagem adicional de não exigir nenhum equipamento especial além de um Sonicator. Demonstrando o procedimento estarão Olesja Ritter e Tabea Riedlinger, que são estudantes de doutorado do meu laboratório. Para iniciar o protocolo, adicione formaldeído diretamente ao meio de crescimento das células que foram semeadas um dia antes, para atingir uma concentração final de 1% volume por volume.Incube o meio por 10 minutos em temperatura ambiente e gire as placas manualmente a cada dois minutos. Em seguida, adicione glicina a uma concentração final de 0,125 molar para extinguir o formaldeído. Incubar a solução durante cinco minutos à temperatura ambiente e eliminá-la de dois em dois minutos.Aspire o meio e, em seguida, adicione cuidadosamente PBS gelado na lateral do prato para lavar as células. Aspire o meio e repita cuidadosamente a lavagem duas vezes. Após a terceira lavagem, ressuspenda as células em um mililitro de PBS gelado e use um raspador de células para separar as células, se necessário.Transfira-os para um tubo de reação de 1,5 mililitro no gelo. Centrifugue as células por cinco minutos a 300g e quatro graus Celsius em uma centrífuga de mesa resfriada. Aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante.Ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de lise FAIRE, pipetando cuidadosamente para cima e para baixo várias vezes. Incube as células por 20 minutos no gelo. Após a incubação, sonicar o DNA reticulado para compartilhá-lo com um tamanho médio de 200 a 300 pares de bases e resfriar as amostras durante a sonicação para evitar o aquecimento da amostra.A fragmentação do DNA é crítica para este experimento, pois o tamanho dos fragmentos está afetando a sensibilidade da solução de toda a técnica, por isso é importante estabelecer as condições de sonicação cuidadosamente com antecedência e verificar o tamanho dos fragmentos de cromatina em cada experimento. Centrifugue a amostra por 15 minutos e 13.000g a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de reação.Divida as amostras em alíquotas de 100 microlitros. Utilizar uma alíquota de 100 microlitros para inverter a reticulação e utilizar como referência para o ADN total. Adicione 10 microlitros de RNase A e incube a amostra por uma hora a 37 graus Celsius.Em seguida, adicione 10 microlitros de proteinase K. Use um termobloco programável para incubar a amostra por quatro horas a 37 graus Celsius e depois por seis horas a 65 graus Celsius para clivar as proteínas e reverter as ligações cruzadas. Obtenha uma nova alíquota de 100 microlitros, adicione 10 microlitros de RNase A e incube a amostra por uma hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, prosseguir com a amostra não reticulada e a amostra reticulada da seção anterior em paralelo.Adicione H2O para atingir um volume final de 300 microlitros. Em seguida, adicione 300 microlitros de álcool fenol clorofórmio isoamílico em uma capela e vortex vigorosamente. Centrifugue as amostras por 10 minutos a 13.000g e quatro graus Celsius.Em seguida, transfira cuidadosamente 280 microlitros da fase aquosa superior para um novo tubo de reação. Certifique-se de não retirar nenhum resíduo da interfase, que também contém proteínas, e descarte a fase inferior restante como resíduo de solvente orgânico. Repita o tratamento e transfira cuidadosamente 270 microlitros da fase aquosa superior para um novo tubo de reação.Adicione 270 microlitros de clorofórmio em uma hotte e vortex vigorosamente. Centrifugue a amostra. Após a centrifugação, transfira cuidadosamente 250 microlitros da fase aquosa superior para um novo tubo de reação, tomando cuidado para não transportar detritos da interfase.Rejeitar a amostra restante como resíduo de solvente orgânico. Em seguida, adicione 25 microlitros de cloreto de sódio de cinco molares, 250 microlitros de isopropanol e adicione cinco microlitros de glicogênio como transportador de DNA. Inverta os tubos e incube-os à temperatura ambiente.Após a incubação, centrifugue a amostra para precipitar o DNA. Em seguida, lave o pellet de DNA com 400 microlitros de etanol a 70% volume por volume e centrifugue a amostra. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e deixar o pellet secar durante 10 minutos à temperatura ambiente.Quando o pellet estiver seco, ressuspenda-o em 100 microlitros de tampão TE. Incube a amostra de DNA grátis não reticulada por quatro horas a 65 graus Celsius para remover as ligações cruzadas entre DNA. Finalmente, quantifique a quantidade de DNA usando um espectrofotômetro e execute uma pequena alíquota para verificar o tamanho do fragmento em um gel de agarose de 2% peso por volume.As células HeLA foram estimuladas com TNF por uma hora e analisadas pelo FAIRE. A razão entre o DNA livre versus o total foi determinada para o promotor do ACTB, o gene que codifica a beta-actina e o controle positivo, uma região de heterocromatina no cromossomo 12, o controle negativo e o promotor de IL8. Um gel corado com brometo de etídio com diferentes tempos de sonicação foi gerado e indica que o tamanho ideal da cromatina de 200 a 300 pares de bases foi obtido após 20 minutos de sonicação.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias. Após este procedimento, outros métodos, como sequenciamento profundo, podem ser realizados para determinar a acessibilidade da cromatina em um nível de todo o genoma. Não se esqueça de que trabalhar com formaldeído e fenol clorofórmio pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar em um exaustor, usar luvas e descarte adequado dos resíduos devem ser garantidas com a realização deste procedimento.

formaldehyde-assisted-isolation-regulatory-elements-to-measure

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Os mecanismos moleculares de descondensação da cromatina mitótica altamente compactada são mal definidos. Apresentamos um ensaio livre de células baseado em aglomerados de cromatina mitótica isolados de células HeLa e extrato de ovo de Xenopus laevis que reconstitui fielmente o processo de descondensação in vitro.

A Free Cell Ensaio para estudar Chromatin descondensação no fim da mitose

A identificação de moléculas associadas a regiões genômicas específicas de interesse é necessária para entender os mecanismos de regulação das funções dessas regiões. Este protocolo descreve procedimentos para realizar imunoprecipitação de cromatina mediada por molécula de ligação ao DNA (enChIP) projetada para identificação de proteínas e RNAs associados a uma região genômica específica.

O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.

Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos

Este trabalho descreve um protocolo para a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) usando uma linha de células T de mouse maduras. Este protocolo é adequado para investigar a distribuição de marcas de histonas específicas em locais promotores específicos ou em todo o genoma.

Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) em linhas de células T de mouse

É apresentado um novo protocolo para a preparação da cromatina do músculo esquelético de rato adulto adaptado para o estudo da regulação gênica em fibras musculares por imunoprecipitação da cromatina.

Protocolo melhorado por imunoprecipitação da cromatina do músculo esquelético de rato

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Este é um método para identificar novas proteínas DNA-interagindo em loci de destino específico, baseando-se na captura de sequência-específicos da cromatina de quitosana para análises subsequentes proteomic. Nenhum conhecimento prévio sobre potenciais proteínas obrigatórias, nem modificações de célula são necessários. Inicialmente desenvolvido para o fermento, a tecnologia agora foi adaptada para células de mamíferos.

Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos

Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta poderosa para a compreensão dos mecanismos moleculares da regulação genética. No entanto, o método envolve dificuldades na obtenção de fragmentação cromatina reprodutível por cisalhamento mecânico. Aqui, nós fornecemos um protocolo melhorado para um ensaio da microplaqueta usando a digestão enzimática.

Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

Este protocolo concentra-se na preparação de cromatina a partir de tecidos congelados instantâneos e é adequado para Imunoprecipitação de Cromatina de Reticulação (X-ChIP) seguida de análise quantitativa de PCR (X-ChIP-qPCR) ou abordagens de sequenciamento de próxima geração (X-ChIP-seq).

Extração de cromatina de tecido hepático quimérico congelado para análise de imunoprecipitação de cromatina

Aqui, apresentamos um protocolo ATAC-seq rápido e simples a ser implementado em um verme inteiro de estágio L4 Caenorhabditis elegans usando apenas 30 μL de pellet de verme.

Perfil de Acessibilidade por Cromatina em Larvas Plenas de Caenorhabditis elegans L4

Aprenda o método FAIRE para determinar acessibilidade da cromatina em células de mamíferos usando reticulação com formaldeído e sonicação. Esta técnica reprodutível não requer equipamentos especializados além de um sonicador.

Formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores para acessibilidade de cromatina medida em células de mamíferos

Explorar mais vídeos