Formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores para acessibilidade de cromatina medida em células de mamíferos
2 de abril de 2018
A plasticidade da arquitetura nuclear é controlada por mecanismos epigenéticos dinâmicos, incluindo não-codificantes RNAs, DNA methylation, nucleossoma reposicionamento, bem como composição de histona e modificação. Aqui descrevemos um protocolo de isolamento Formaldehyde-Assisted de elementos normativos (FAIRE) que permite a determinação de acessibilidade de cromatina de forma reprodutível, barata e simples.
O objetivo geral deste experimento é determinar a acessibilidade da cromatina de um locus genético por meio da reticulação covalente do DNA às proteínas associadas, seguida de purificação e quantificação do DNA livre. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da cromatina, pois a acessibilidade do DNA pode ser determinada, independentemente do tipo de célula em células não tratadas e também em células submetidas à remodelação da cromatina. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer o uso de enzimas para clivar o DNA ou anticorpos que precisam ser titulados para cada ambiente experimental.
Este protocolo tem a vantagem adicional de não exigir nenhum equipamento especial além de um Sonicator. Demonstrando o procedimento estarão Olesja Ritter e Tabea Riedlinger, que são estudantes de doutorado do meu laboratório. Para iniciar o protocolo, adicione formaldeído diretamente ao meio de crescimento das células que foram semeadas um dia antes, para atingir uma concentração final de 1% volume por volume.
Incube o meio por 10 minutos em temperatura ambiente e gire as placas manualmente a cada dois minutos. Em seguida, adicione glicina a uma concentração final de 0,125 molar para extinguir o formaldeído. Incubar a solução durante cinco minutos à temperatura ambiente e eliminá-la de dois em dois minutos.
Aspire o meio e, em seguida, adicione cuidadosamente PBS gelado na lateral do prato para lavar as células. Aspire o meio e repita cuidadosamente a lavagem duas vezes. Após a terceira lavagem, ressuspenda as células em um mililitro de PBS gelado e use um raspador de células para separar as células, se necessário.
Transfira-os para um tubo de reação de 1,5 mililitro no gelo. Centrifugue as células por cinco minutos a 300g e quatro graus Celsius em uma centrífuga de mesa resfriada. Aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
Ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de lise FAIRE, pipetando cuidadosamente para cima e para baixo várias vezes. Incube as células por 20 minutos no gelo. Após a incubação, sonicar o DNA reticulado para compartilhá-lo com um tamanho médio de 200 a 300 pares de bases e resfriar as amostras durante a sonicação para evitar o aquecimento da amostra.
A fragmentação do DNA é crítica para este experimento, pois o tamanho dos fragmentos está afetando a sensibilidade da solução de toda a técnica, por isso é importante estabelecer as condições de sonicação cuidadosamente com antecedência e verificar o tamanho dos fragmentos de cromatina em cada experimento. Centrifugue a amostra por 15 minutos e 13.000g a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de reação.
Divida as amostras em alíquotas de 100 microlitros. Utilizar uma alíquota de 100 microlitros para inverter a reticulação e utilizar como referência para o ADN total. Adicione 10 microlitros de RNase A e incube a amostra por uma hora a 37 graus Celsius.
Em seguida, adicione 10 microlitros de proteinase K. Use um termobloco programável para incubar a amostra por quatro horas a 37 graus Celsius e depois por seis horas a 65 graus Celsius para clivar as proteínas e reverter as ligações cruzadas. Obtenha uma nova alíquota de 100 microlitros, adicione 10 microlitros de RNase A e incube a amostra por uma hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, prosseguir com a amostra não reticulada e a amostra reticulada da seção anterior em paralelo.
Adicione H2O para atingir um volume final de 300 microlitros. Em seguida, adicione 300 microlitros de álcool fenol clorofórmio isoamílico em uma capela e vortex vigorosamente. Centrifugue as amostras por 10 minutos a 13.000g e quatro graus Celsius.
Em seguida, transfira cuidadosamente 280 microlitros da fase aquosa superior para um novo tubo de reação. Certifique-se de não retirar nenhum resíduo da interfase, que também contém proteínas, e descarte a fase inferior restante como resíduo de solvente orgânico. Repita o tratamento e transfira cuidadosamente 270 microlitros da fase aquosa superior para um novo tubo de reação.
Adicione 270 microlitros de clorofórmio em uma hotte e vortex vigorosamente. Centrifugue a amostra. Após a centrifugação, transfira cuidadosamente 250 microlitros da fase aquosa superior para um novo tubo de reação, tomando cuidado para não transportar detritos da interfase.
Rejeitar a amostra restante como resíduo de solvente orgânico. Em seguida, adicione 25 microlitros de cloreto de sódio de cinco molares, 250 microlitros de isopropanol e adicione cinco microlitros de glicogênio como transportador de DNA. Inverta os tubos e incube-os à temperatura ambiente.
Após a incubação, centrifugue a amostra para precipitar o DNA. Em seguida, lave o pellet de DNA com 400 microlitros de etanol a 70% volume por volume e centrifugue a amostra. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e deixar o pellet secar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
Quando o pellet estiver seco, ressuspenda-o em 100 microlitros de tampão TE. Incube a amostra de DNA grátis não reticulada por quatro horas a 65 graus Celsius para remover as ligações cruzadas entre DNA. Finalmente, quantifique a quantidade de DNA usando um espectrofotômetro e execute uma pequena alíquota para verificar o tamanho do fragmento em um gel de agarose de 2% peso por volume.
As células HeLA foram estimuladas com TNF por uma hora e analisadas pelo FAIRE. A razão entre o DNA livre versus o total foi determinada para o promotor do ACTB, o gene que codifica a beta-actina e o controle positivo, uma região de heterocromatina no cromossomo 12, o controle negativo e o promotor de IL8. Um gel corado com brometo de etídio com diferentes tempos de sonicação foi gerado e indica que o tamanho ideal da cromatina de 200 a 300 pares de bases foi obtido após 20 minutos de sonicação.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias. Após este procedimento, outros métodos, como sequenciamento profundo, podem ser realizados para determinar a acessibilidade da cromatina em um nível de todo o genoma. Não se esqueça de que trabalhar com formaldeído e fenol clorofórmio pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar em um exaustor, usar luvas e descarte adequado dos resíduos devem ser garantidas com a realização deste procedimento.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para determinar a acessibilidade da cromatina utilizando o método de Isolamento Assistido por Formaldeído de Elementos Regulatórios (FAIRE). A técnica é simples, reprodutível e não requer equipamentos especializados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Epigenética
- Biologia da Cromatina
Contexto
- A acessibilidade da cromatina é fundamental para compreender a regulação gênica.
- Mecanismos epigenéticos dinâmicos influenciam a arquitetura nuclear.
- Os RNAs não codificantes, a metilação do DNA e as modificações das histonas desempenham papéis significativos.
- O protocolo FAIRE permite a análise da estrutura da cromatina em diversos tipos celulares.
Objetivo do Estudo
- Determinar a acessibilidade da cromatina em locos genéticos específicos.
- Fornecer um método confiável para estudar a dinâmica da cromatina.
- Facilitar análises genômicas adicionais após a avaliação da acessibilidade da cromatina.
Métodos Utilizados
- Reticulação covalente do DNA com proteínas associadas utilizando formaldeído.
- Purificação e quantificação do DNA livre.
- Sonicacão para fragmentar o DNA em tamanhos ideais para análise.
- Uso da extração com fenol-clorofórmio para purificar amostras de DNA.
Resultados Principais
- Determinação bem-sucedida da acessibilidade da cromatina em células HeLa.
- Condições ideais de sonicação produzem fragmentos de DNA de 200-300 pares de bases.
- Comparação das razões entre DNA livre e total em promotores gênicos específicos.
- Demonstração da aplicabilidade do método a diversos contextos experimentais.
Conclusões
- O protocolo FAIRE é uma ferramenta valiosa para o estudo da acessibilidade da cromatina.
- Pode ser realizado sem equipamentos especializados e é economicamente eficiente.
- Outras aplicações incluem sequenciamento profundo para análise da cromatina em todo o genoma.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição confiável da acessibilidade da cromatina é essencial para a validação inicial de alvos e a redução de riscos mecanicistas em estudos de regulação gênica. O protocolo FAIRE permite a avaliação quantitativa, independente de anticorpos, dos estados da cromatina em locos específicos, oferecendo confiança preditiva em fluxos de trabalho de descoberta e triagem. Sua simplicidade operacional e reprodutibilidade facilitam a integração em pipelines de P&D em larga escala para pesquisas epigenéticas e transcricionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta da acessibilidade da cromatina em locos genéticos específicos para esclarecer mecanismos regulatórios.
- Apóia a validação funcional de alvos ao distinguir regiões de cromatina aberta versus compactada, sem viés de anticorpos.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao fornecer dados quantitativos e reprodutíveis sobre o estado da cromatina em diferentes tipos celulares e condições.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara perfis validados de acessibilidade da cromatina para ensaios downstream baseados em qPCR ou sequenciamento.
- Padroniza a medição do estado da cromatina, reduzindo a variabilidade experimental e aumentando a reprodutibilidade.
- Permite fluxos de trabalho escaláveis e independentes de plataforma para triagem de compostos ou perturbações genéticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha dados de acessibilidade da cromatina com modelos de regulação gênica relevantes para doenças quando aplicado a sistemas celulares apropriados.
- Permite a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, possibilitando o perfilhamento da cromatina em todo o genoma ou específico por locus.
- Oferece subsídios mecanicistas para decisões de avanço ajustadas ao risco na regulação transcricional.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O protocolo FAIRE insere-se no continuum de descoberta a pré-clínico, permitindo a investigação de cromatina orientada por hipóteses e apoiando fluxos de trabalho de identificação e validação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a abertura da cromatina para testar hipóteses regulatórias e esclarecer mecanismos de controle gênico.
- Triagem: Fornece saídas reprodutíveis e quantitativas de acessibilidade da cromatina adequadas para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Fornece razões de rendimento de DNA e dados de tamanho de fragmento para comparação estatística robusta de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento de biomarcadores e a continuidade mecanicista quando aplicado a modelos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho padronizado e independente de anticorpos, adaptável a diversos tipos celulares e configurações experimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos de regulação gênica e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade por meio de protocolos padronizados e com baixa dependência de equipamentos.
- Valor Estratégico: Aprimora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao fornecer dados robustos sobre o estado da cromatina no início do processo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de alvos epigenéticos e transcricionais.
Considerações sobre a Implementação
- Exige conhecimento especializado em biologia da cromatina e análises de PCR quantitativa ou sequenciamento.
- Requer acesso a um sonicador e instrumentação padrão de biologia molecular.
- Exige padronização rigorosa entre equipes dos parâmetros de sonicação e extração para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos tipos de células de mamíferos e condições experimentais mediante otimização do protocolo.
- Precauções de segurança são essenciais devido ao uso de reagentes perigosos, como formaldeído e fenol-clorofórmio.
