Avaliação do impacto da agregação da proteína no estresse oxidativo celular na levedura

O objetivo geral deste procedimento é determinar a relação entre a formação de agregados proteicos intracelulares e seu impacto no estresse oxidativo celular usando a levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de doenças de dobramento e agregação de proteínas, como distúrbios neurodegenerativos e amiloidoses não neuropáticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, rápida e permite a quantificação dos danos do estresse oxidativo celular em uma grande população de leveduras.

Com este método, podemos fornecer informações sobre a correlação entre o estado intracelular solúvel ou agregado de uma proteína amiloidogênica com os níveis de estresse oxidativo em leveduras. Além disso, também pode ser aplicado a outros organismos modelo que expressam proteínas recombinantes. A demonstrar a análise de citometria de fluxo estará Manuela Costa, técnica do Posto de Citometria de Fluxo da UAB.

Neste estudo, o estado de agregação intracelular de diferentes variantes do peptídeo A-beta-42 é rastreado usando S. cerevisiae transformado com um plasmídeo que codifica para A-beta-42 fundido a GFP sob o controle de um promotor induzível por galactose. Escolha uma colônia das células de levedura transformadas e inocule em 20 mililitros de SC menos meio Ura contendo 2% de glicose. Cultive a cultura a 30 graus Celsius sob agitação durante a noite.

No dia seguinte, inocule 100 microlitros da cultura noturna em cinco mililitros de SC fresco menos meio Ura e cultive as células a 30 graus Celsius por duas a três horas. Quando a cultura estiver em uma densidade óptica de 590 nanômetros ou OD 590 de 0,5, centrifugue a cultura a 3.000 vezes g por quatro minutos, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em cinco mililitros de SC fresco menos meio Ura contendo 2% de rafinose. Incube as células a 30 graus Celsius sob agitação por 30 minutos.

Após 30 minutos, centrifugue as células a 3.000 vezes g por quatro minutos, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em meio SC fresco menos Ura contendo 2% de galactose para induzir a expressão de proteínas recombinantes. Devolva as células à incubadora por 16 horas. Após 16 horas, colher as células transferindo alíquotas de um mililitro da cultura para tubos esterilizados de microcentrífuga e centrifugando a 3 000 vezes g durante quatro minutos.

Comece este procedimento determinando o OD 590 das células de levedura induzidas por 16 horas. Em seguida, dilua as células em PBS estéril para um OD 590 de 0,1. Transfira as suspensões de células de extração para tubos de poliestireno de fundo redondo devidamente rotulados e proteja-os da luz.

Preparar células não induzidas como controle negativo para a análise por citometria de fluxo. Adicionar a sonda de tensão oxidativa a cada amostra a uma concentração final de cinco micromolares. Cubra as amostras com papel alumínio e incube a 30 graus Celsius por 30 minutos.

Quando a incubação estiver concluída, gire as células, remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets celulares em PBS. Lave as células três vezes dessa maneira com PBS. Após a terceira lavagem, ressuspenda as células no mesmo volume de PBS.

Certifique-se de que as células não coradas estejam incluídas na análise de citometria de fluxo. Usando os lasers e filtros apropriados, execute a análise de citometria de fluxo para detectar GFP e o sinal fluorescente da sonda de estresse oxidativo. Comece clicando no painel Abrir nova planilha e dê um nome ao experimento.

Na barra de ferramentas, selecione a ferramenta Gráfico de dispersão e crie um gráfico com as variáveis Área de dispersão lateral no eixo y versus Área de dispersão direta em uma escala linear no eixo x. Clique na ferramenta Gráfico de dispersão e crie um gráfico com as variáveis Área FITC no eixo x versus Área APC em uma escala logarítmica no eixo y. Clique no ícone Configuração do instrumento e defina todos os níveis de compensação como zero na guia Compensação.

Em seguida, clique na guia Aquisição e selecione um número total de 20.000 eventos a serem registrados com uma baixa taxa de fluxo. Como o sinal de emissão fluorescente de um fluorocromo pode ser detectado por outro detector, é importante realizar um processo de compensação para equalizar o sinal mínimo de cada fluorocromo em todos os detectores por um controle de cor única. Renomeie o tubo 001 como controle negativo e clique na guia Adquirir para começar a executar as células não induzidas e não coradas.

Ajuste a tensão nas configurações do instrumento da dispersão direta e lateral até que a população seja distribuída no quadrante central esquerdo. Clique no ícone Polígono para definir uma região R1 ao redor da população de células, excluindo detritos de células, e use essa população fechada P1 igual a R1 para todos os gráficos de pontos fluorescentes e representações de histograma. Para ajustar a tensão PMT do sinal de fluorescência, execute as células não coradas no gráfico de pontos FL1 a FL3, ajustando o ganho na guia Configuração do instrumento, até que as células sejam distribuídas no quadrante inferior esquerdo.

Usando a ferramenta Gráfico de dispersão, crie um gráfico de pontos com as variáveis FITC-A no eixo x versus FSC-A e um segundo gráfico de pontos com as variáveis APC-A no eixo x versus FSC-A. Em seguida, mude a amostra para as células induzidas para medir a fluorescência da GFP. Na guia Configuração do instrumento, defina o ganho no FSC-A versus FITC quando a população estiver distribuída no quadrante inferior direito.

Defina a população de células GFP-positivas com uma porta. Mude a amostra para as células coradas não induzidas. Exiba o estresse oxidativo pela fluorescência em um gráfico de pontos FSC-A versus APC-A.

Ajuste o ganho até que a população de células seja distribuída no quadrante superior esquerdo. Gate a população de células positivas em P3. Com o ícone Histograma, faça dois gráficos de histograma para representar a fluorescência da célula, um para FITC e outro para fluorescência APC. Crie uma tabela exibindo a intensidade fluorescente média e a fluorescência mediana com seu erro padrão correspondente e/ou o coeficiente de variância para fluorescência GFP e níveis de estresse oxidativo.

Clique na guia Compensação e defina todos os níveis de remuneração como zero. Clique na guia Aquisição e selecione um número total de 20.000 eventos a serem registrados. Prepare três novos tubos de amostras e nomeie-os como não induzidos, solúveis induzidos e agregados induzidos.

Adquira dados das amostras com as configurações predefinidas. Analise os dados abrindo uma nova planilha e criando um gráfico de pontos para as variáveis FITC-A e APC-A, bloqueando as células positivas para a coloração CellROX. Para cada amostra, crie uma tabela de estatísticas com a fluorescência média e o erro padrão para os canais FITC e APC.

Também é possível classificar as células com um classificador FACS seguindo a contagem agregada de proteínas. Células de levedura que expressam variantes A-beta-42 após um período de indução de 16 horas são visualizadas sob um microscópio de fluorescência para determinar a distribuição de proteínas recombinantes dentro das células. Essas imagens são representativas de variantes selecionadas de GFP A-beta-42

A formação de inclusões proteicas, ou PI, foi confirmada em 10 das 20 variantes da coleção analisada. Este gráfico de barras indica a porcentagem de células contendo diferentes números de PI calculados a partir de um total de 500 células fluorescentes para cada variante em réplicas biológicas. Foi observada uma excelente concordância entre as propriedades de agregação preditas e in vivo.

Os níveis de expressão proteica nos extratos celulares foram quantificados usando um anticorpo específico para A-beta. Como tendência geral, as variantes A-beta-42 formadoras de PI, coloridas em verde, estão presentes em níveis mais baixos do que aquelas difusamente distribuídas no citosol, coloridas em vermelho. Diferenças importantes entre as variantes de A-beta-42 foram observadas quando sua fluorescência da sonda de estresse oxidativo, níveis de proteína e propriedades de fluorescência GFP foram representadas em relação à sua capacidade de formar PI e suas propensões de agregação intrínseca previstas pelo algoritmo de bioinformática AGGRESCAN ou TANGO.

As variantes de formação de PI estão em verde e as variantes não formadoras de PI estão em vermelho. Após este procedimento, outros métodos, como iodeto de propídio ou coloração de anexina V, também podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como determinar o impacto de uma variante de proteína expressa intracelular na apoptose celular ou citotoxicidade.