Name: Avaliação do impacto da agregação da proteína no estresse oxidativo celular na levedura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Aprenda a avaliar o impacto da agregação proteica no estresse oxidativo celular em Saccharomyces cerevisiae usando citometria de fluxo. Este método simples e rápido permite quantificar danos oxidativos em grandes populações de levedura.

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1. culturas de S. cerevisiae e expressão da proteína
Nota: Variantes Aβ apresentam propensões de agregação relativa diferente devido a uma mutação em um único resíduo na posição 19 (Phe19) do peptídeo Aβ42 (figura 1A). Essas variantes do peptide são marcados com a proteína fluorescente verde (GFP), que actua como uma agregação de repórter (Figura 1)29.
<ol><li>Transforme os plasmídeos codificação para 20 variantes de Aβ42-GFP em células de levedura com um BY4741 fundo parental (MATa seu3Δ1 leu2Δ0 conheceu15Δ0 ura3Δ0)30. Cada plasmídeo codifica para um mutante de Aβ42 fundido a GFP por um vinculador GSSGSSG. Os plasmídeos são pESC(-URA) e incluem o marcador selecionável URA329.<ol>
<li>Prepare o suporte completo sintético sem uracil (SC-URA) com os seguintes componentes: 1,9 g/L nitrogênio levedura base sem uracil, 5g/L sulfato de amónio e 900 mL de DDQ2O combinado com 100 mL de glicose de 20% (p/v).</li>
		<li>Colocar uma colônia das células de fermento transformado em 20 mL do meio de SC-URA contendo 2% de glicose e crescem as culturas durante a noite a 30 ° C, sob agitação a 210 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia seguinte, cresce novas culturas de células de levedura por inoculando 100 µ l de cultura durante a noite em 5 mL de meio fresco SC-URA.</li>
	<li>Em uma OD590 de 0.5, Centrifugar as culturas a 3.000 x g durante 4 min, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células no mesmo volume de meio de SC-URA fresco contendo 2% rafinose.</li>
	<li>Incube a 30 ° C, sob agitação a 210 rpm por 30 min. Em seguida, Centrifugar as células a 3.000 x g, durante 4 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em meio de SC-URA fresco contendo 2% de galactose para induzir a expressão da proteína recombinante.</li>
	<li>Após 16 h de induzir a expressão de proteínas em meio de SC-URA contendo 2% de galactose, colha 1 mL de células induzidas em tubos estéreis microcentrifuga por centrifugação a 3.000 x g, durante 4 min. Nota: As diferenças mais relevantes ocorrem após um período de indução de células de levedura induzida de 16 h. expressando variantes de Aβ42-GFP pode ser visualizado por microscopia de fluorescência para determinar a distribuição de proteína recombinante no interior das células (Figura 2B).</li>
</ol>2. coloracao celular
Nota: As pilhas novas não induzida são necessárias como um controle negativo para estabelecer um limiar fluorescente durante uma análise FC.
<ol><li>Levar as células de levedura induzida por h 16 e determinar sua densidade óptica, a 590 nm (OD590). Diluí-los em uma solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS) para um OD590 de 0.1.<ol>
<li>Preparar 1 x solução salina tamponada fosfato como segue: adicionar 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, e 0,24 g de KH2PO4 a 800 mL de DDQ2O. Preencha a solução até 1 L de DDQ2O depois de ajustar o pH para 7,4 com HCl. Filtre o buffer com um filtro de 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir as suspensões celulares expressando para tubos apropriadamente rotulados (12 × 75 de poliestireno de hum fundo redondo) e protegê-los de luz. Certifique-se de que estão prontos para ser carregado no citômetro de fluxo para análise, juntamente com células não-induzido e não manchada.</li>
	<li>Adicionar a sonda de estresse oxidativo (por exemplo, CellROX vermelha) para cada amostra em uma concentração final de 5 µM e incube as celulas a 30 ° C por 30 min no escuro.</li>
	<li>Após a incubação, lavar as células 3 vezes com 1X PBS e ressuspendê-los no mesmo volume da reserva antes da sua análise pela FC.</li>
</ol>3. fluxo Cytometry Analysis
Nota: Use uma configuração FC com lasers apropriados e filtros para detectar GFP e sinal de fluorescência de sonda de estresse oxidativo. Um citômetro de fluxo, equipado com um 488 nm azul do laser para a detecção de GFP e laser 635 nm vermelho para a detecção de fluorescência de sonda de stress oxidativo pode ser usado. Aquisição da fluorescência de emissão de GFP e sonda de estresse oxidativo é executada com um filtro de nm BP 530/30 e um filtro de BP 660/20, respectivamente (tabela 1).
<ol><li>Clique em Abrir novo painel de planilha e crie os seguintes lotes do ponto de aquisição.<ol>
<li>Selecione a Ferramenta de plotagem Scatter na barra de ferramentas e criar um enredo com as variáveis Scatter-área lateral (SSC-A) sobre o eixo y vs Forward Scatter-área (FSC-A) em uma escala linear no eixo x.</li>
		<li>Clique na Ferramenta de plotagem Scatter na barra de ferramentas e criar um enredo com as variáveis FL1-área (FITC) sobre o eixo x vs. FL3-área (APC) em uma escala logarítmica no eixo y.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clique no ícone Configurações de instrumentos . Clique na guia de compensação e definir todos os níveis de compensação. Clique na guia de aquisição e selecione um número total de 20.000 eventos para ser gravado.</li>
	<li>Clique no ícone de Caudal para mudar a taxa de fluxo para baixo.</li>
	<li>Clique na guia de adquirir para começar a correr as células não-induzida, imaculadas e ajustar a tensão nas Configurações do instrumento do RCS e dispersão de lado até que a população é distribuída no quadrante médio esquerdo.<ol>
<li>Clique no ícone do polígono para definir uma região R1, em torno de população celular excluindo os restos da célula e usar esta população gated P1 = R1 para todos os lotes do ponto fluorescente e representações de histograma (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para ajustar a tensão de PGTO do sinal de fluorescência, execute as células imaculadas na trama ponto FL1-FL3, ajuste o ganho na guia Configuração do instrumento , até que as células são distribuídas no quadrante inferior esquerdo.</li>
	<li>Altere a amostra para as células induzidas para medir a fluorescência de GFP. Na guia Configuração do instrumento , defina o ganho no FSC-A vs FL1 (FITC) quando a população é distribuída no quadrante inferior direito. Defina a população de células positivas com um portão (portão P2).</li>
	<li>Mudança da amostra para o não-induzida manchado células para exibir o estresse oxidativo por fluorescência em um terreno de ponto FSC-A vs FL3 (APC). Ajuste o ganho até a população celular é distribuída no quadrante esquerdo superior. A população de células positivas em P3 de portão.</li>
	<li>Fazer duas parcelas de histograma com o ícone de histograma para representar a fluorescência da célula. Para representar a intensidade da fluorescência, certifique-se de FL1 (FITC) representando a fluorescência de GFP é no eixo x e FL3 (APC) representando a fluorescência é no eixo y, aplicando as populações P2 e P3 em uma escala logarítmica, respectivamente. Nota: As sobreposições de histograma são uma boa maneira de ilustrar as diferenças entre os perfis de fluorescência das células expressando diferentes variantes Aβ.</li>
</ol>4. recombinação da proteína Immunodetection
<ol><li>Para determinar os níveis de expressão da proteína, colher as culturas de leveduras induzidas por 16 h por centrifugação a 4.000 x g durante 6 min e armazenar as pelotas de célula a-80 ° C.<ol>
<li>Ressuspender as células coletadas, expressando a proteína recombinante para 16 h em PBS. Prepare suspensões da pilha de 200 µ l de cada mutante de Aβ42-GFP para uma OD590 de 20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para análise de fração de proteínas totais, colheita de 100 µ l de cada mutante por centrifugação a 14.000 x g por 20 min e ressuspender as pelotas de célula no mesmo volume de tampão de lise de leveduras Y-PER (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1% DMSO, 200 mM de NaCl, 1 mM EDTA, contendo 10 mg/mL (myr SB3-14 istyl sulfobetaine) suplementado com fluoreto de phenylmethylsulfonyl de 1 mM (PMSF)).<ol>
<li>Incube as amostras por 20 min em temperatura ambiente sob leve agitação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine a concentração de extrato de proteínas usando o ensaio de Bradford. Carrega até 5 µ g de extrato de proteína de cada amostra em um gel de electroforese de SDS-PAGE 15% acrilamida e borrão em uma membrana de difluoreto (PVDF) de polivinilideno a 100 V por 60 min.<ol>
<li>Prepare um Bradford reagente com 100 mg de azul de Coomassie brilhante G-250 dissolvido em 50 mL de etanol a 95% e adicionar 100 mL de ácido fosfórico 85% (p/v). Então, quando o corante é completamente dissolvido, diluir a mistura com o ddH2O de 1L e filtrar por papel de filtro de celulose imediatamente antes da utilização. Nota: O reagente de Bradford deve ser marrom claro.</li>
		<li>Prepare um padrão de albumina de soro bovino (BSA) variando de 5-100 µ g de proteína em 1.000 µ l de reagente de Bradford.</li>
		<li>Adicione 1-10 µ l de proteína extrair a 1 mL de reagente de Bradford e incubar a mistura à temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Medir a absorvância das normas e a proteína extrair amostras em OD595.</li>
		<li>Para a análise, fazer um gráfico com os valores de absorvância obtidos para os padrões vs. µ g de proteína. Com base na curva padrão, determine as concentrações das amostras originais da quantidade de proteína, considerando o volume e a diluição, se for o caso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar a membrana com 1 x salino Tris (TBS), 0.1% Tween 20 (TTBS) e bloqueá-lo usando leite seco desnatado 5% (p/v) em 1 x TTBS.<ol>
<li>Para preparar 1 L de 10 x TBS, dissolver 24 g de Tris base e 88 g de NaCl em 900 mL de H2Odd e ajustar o pH 7,6. Adicionar O ddH2até um volume final de 1 L. Para uma solução de 1 x, misturar 1 parte de estoque de x 10 com 9 peças de DDQ2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar a membrana para 1 h com um anticorpo primário de β-amiloide 6E10 diluído 1:1,000 e por 1h à temperatura ambiente com uma cabra de anticorpo secundário conjugado de anti-mouse IgG HRP diluído 01:10, 000.</li>
	<li>Desenvolver membranas usando 1 mL do reagente fluorescente Luminata e quantificar bandas por análise densitométricos, conforme descrito na etapa 5.2.</li>
</ol>5. análise de dados
<ol><li>Para analisar os dados obtidos pelo FC, criar uma tabela que exibe a média intensidade fluorescente (IFM) e fluorescência mediana com seu correspondente desvio-padrão e/ou o coeficiente de variação (CV) para os níveis de estresse oxidativo e fluorescência de GFP.<ol>
<li>Clique na guia de Inspetor e o ícone de estatísticas para personalizar os dados estatísticos que são necessários para cada canal. Nota: Quando se comparam as variantes da proteína, converta dados valores de fluorescência para um fundo dobrável ou resolução métrica (RD): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> Nesta métrica, a amostra média é a média fluorescência das amostras do problema, o controle médio é a média fluorescência das células usado como um controle e o SD é o desvio-padrão da média fluorescência. Fator de RD é um índice mais exato do que o valor de IFM como ele não só calcula a diferença entre as amostras, mas também as contas para a divulgação dos dados. Este cálculo é especificamente relevante quando comparar dados provenientes de diferentes experiências realizadas ao longo do tempo. Uma vez que o RDs foram calculado, o uso de um teste estatístico é aconselhável confirmar a significância das diferenças observadas entre as variantes da proteína.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para a proteína immunodetection, quantificar os níveis de proteína recombinante por Western blot utilizando software ImageJ.<ol>
<li>Antes da análise de densitometria, converta as imagens raw originais da membrana desenvolvida em modo JPEG arquivo formato e escala de cinza.</li>
		<li>Ajuste a seção Definir medições do menu Analyze para Dizer o valor de cinza.</li>
		<li>Clique na ferramenta retângulo do ImageJ e definir uma região de interesse (ROI) com um tamanho consistente para a análise de densitometria de banda. Centro de cada banda na imagem dentro da moldura retangular criada de membrana e registrar a medição de um por um, usando Ctrl + M (o comando de medição).</li>
		<li>Meça o fundo local adjacente à cada banda, aplicando a mesma área ROI. Após a medição, subtrai o fundo local correspondente de cada banda individual.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Uma ampla gama de doenças está ligada ao acúmulo de misfolded proteínas em depósitos celulares6,7,8,33. Muitos esforços foram feitos para desvendar os mecanismos moleculares que desencadeiam o aparecimento destas doenças usando abordagens computacionais, que não levam em concentrações de proteína de conta, ou em vitro se aproxima, em que a concentração de proteína mantém-se constante d...

Proteostasis é um determinante fundamental dos processos de adequação e envelhecimento celular. Nas células, homeostase de proteína é mantida pelo controle de qualidade de proteína sofisticadas redes visa garantir a correta dobrar de conformistas de misfolded proteínas por acompanhantes e/ou sua proteólise alvejado com vários mecanismos bem conservados1 ,2,3,4,5. Um grande número de estudos oferece suporte à ligação entre o início e a progressão de uma ampla gama de doenças humanas e o fracasso de proteostasis, levando ao enrolamento de proteínas e agregação. Por exemplo, a presença de depósitos de proteína é considerada uma característica patológica de muitas doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, Parkinson e Huntington doenças6,7,8, doenças prionogenic e amyloidoses não-degenerativas9. Tem sido sugerido que cedo assemblies oligoméricos e protofibrillar na reação de agregação são os principais elicitores de citotoxicidade, estabelecendo interações aberrantes com outras proteínas no meio lotado de celular10. Além disso, inclusões de proteína (PI) podem ser transmitidos entre as células, seus efeitos tóxicos11,12de propagação. Portanto, pode ser que a formação de PI de fato pode constituir um mecanismo desintoxicante que restringe a presença de espécies perigosas agregados para locais específicos na célula, onde eles podem ser processados ou acumulados sem grandes efeitos colaterais 13 , 14.
Padrão em vitro abordagens bioquímicas forneceram importantes insights sobre as diferentes espécies que povoam as reações de agregação e suas propriedades de15,16. No entanto, as condições usadas nestes ensaios são claramente diferentes das que ocorrem dentro da célula e, portanto, questionar sua relevância fisiológica. Por causa de conservação notável dos caminhos celulares tais como controle de qualidade de proteína, autofagia ou o Regulamento do estado redox celular17,18 entre eucariotas19,20,21 ,22,23, a brotamento de levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) surgiu como um modelo de celular simples privilegiado para estudar os determinantes moleculares de agregação da proteína e seu impacto associado citotóxico em ambientes biologicamente relevantes24,25,26.
Propensão de agregação de proteínas é uma característica inerentemente codificada na sequência principal. Assim, a formação de estruturas semelhantes a amiloide pode ser prevista com base na identificação e avaliação da potência de agregação-promover regiões em polipeptídeos27. No entanto, apesar do sucesso de bioinformatic algoritmos para prever as propriedades de agregação em vitro de sequências de proteínas, eles estão ainda longe de previsão como essas propensões traduzem na vivo citotóxicos impacto. Estudos que abordam a relação entre o estado agregado de uma determinada proteína e seu dano celular associado de forma sistemática podem ajudar a contornar essa limitação computacional. Esta conexão é abordada no presente estudo, aproveitando-se de um conjunto grande de variantes do peptídeo β-amiloide Aβ42 diferindo apenas em um único resíduo, mas indicando uma escala contínua de agregação propensões na vivo28. Em particular, uma abordagem baseada em FC para identificar a espécie conformacional representando o dano oxidativo eliciado propensas a agregação de proteínas nas células de levedura é descrita. A metodologia oferece muitas vantagens como simplicidade, capacidade de alta produtividade e precisão das medições quantitativo. Esta abordagem, foi possível confirmar essa jogada de PI um papel protetor contra o estresse oxidativo.

<table><tbody><tr><td>Células de levedura BY4741&nbsp;</td><td>Genótipo ATCC</td><td>201388</td><td>: MATa his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 met15&Delta; 0 ura3&Delta; 0</td></tr><tr><td>plasmídeo pESC(-Ura)&nbsp;</td><td>Agilent Genomics</td><td>217454</td><td>plasmídeo de expressão de levedura com um promotor Gal. Marcador selecionável URA3</td></tr><tr><td>Levedura Sintética Drop-out Medium Suplementos</td><td>Sigma</td><td>Y1501</td><td>Base</td></tr> de <tr><td>Nitrogênio de Levedura em Pó Sem Aminoácidos</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>Pó Rafinose</td><td>Sigma</td><td>R7630</td><td>Glicose em Pó</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td>Fosfato em</td></tr><tr><td>Pó Salina Tamponada (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991&nbsp;</td><td>Solução 10X</td></tr><tr><td>Reagente CellROX Deep Red&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10422</td><td>Sensor fluorescente de radicais livres, não fluorescente enquanto em estado reduzido, e exibe fluorescência brilhante após oxidação por espécies reativas de oxigênio (ROS), com máximos de absorção/emissão a 644/665 nm.</td></tr><tr><td>Reagente de extração de proteína Y-PER&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78990</td><td>Tampão de lise de células líquidas</td></tr><tr><td>Acrilamida/Bis-acrilamida</td><td>Solução Sigma</td><td>A6050</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de corante Bradford</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>5000205</td><td>Reagente de corante para determinação de uma etapa da concentração de proteínas</td></tr><tr><td>&beta;-anticorpo amilóide 6E10&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>803001</td><td>Mouse IgG1. O epítopo encontra-se dentro dos aminoácidos 3-8 da beta-amilóide (EFRHDS).</td></tr><tr><td>Conjugado IgG-HRP anti-camundongo de cabra&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1721011</td><td></td></tr><tr><td>Membrane Immobilon-P, PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Luminata forte</td><td>Merk</td><td>WBLUF0100</td><td>Reagente de detecção de HRP quimioluminescente pré-misturado, pronto para uso</td></tr><tr><td>Solução de fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)</td> <td>Inibidor</td> de protease Sigma <td>93482</td><td>. Dissolvido a 0,1 M em etanol</td></tr><tr><td>FACSCantômetro de fluxo de anto</td><td>A BD Biosciences</td><td>657338</td><td>equipada com um 488&nbsp; nm laser azul para a detecção de GFP e 635&nbsp; laser vermelho nm / filtro BP 530/30 nm e filtro BP 660/20</td></tr><tr><td>Mini Electroforese Trans-Blot Célula de transferência</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td>Sistema de transferência de proteínas</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td>Sistema de electroforese</td></tr></tbody></table>

avaliação do impacto da agregação da proteína no estresse oxidativo celular na levedura

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Enrolamento de proteínas e de agregação em conformações amiloides têm sido relacionados ao aparecimento e progressão de várias doenças neurodegenerativas. No entanto, ainda há pouca informação sobre proteína insolúvel como agregados exercem seus efeitos tóxicos em vivo. Organismos-modelo simples de procariotas e eucariotas, tais como bactérias e leveduras, têm contribuído significativamente para nossa compreensão atual dos mecanismos por trás da formação de amiloide intracelular, propagação de agregados e toxicidade. Neste protocolo, o uso de levedura é descrito como um modelo para dissecar a relação entre a formação de agregados de proteínas e seu impacto sobre o estresse oxidativo celular. O método combina a detecção de estado solúvel/agregados intracelular de uma proteína amiloidogénicos com a quantificação dos danos oxidativos celulares resultantes de sua expressão usando citometria de fluxo (FC). Essa abordagem é simples, rápido e quantitativo. O estudo ilustra a técnica correlacionando o estresse oxidativo celular, causado por um conjunto grande de variantes de peptídeo β-amiloide com suas propensões respectiva agregação intrínseca.

Este protocolo descreve como empregar uma coleção de 20 variantes do peptide Aβ42 onde Phe19 alterou a todos os naturais proteinogenic aminoácidos28. A propensão de agregação teórica destas proteínas pode ser analisado usando dois algoritmos diferentes bioinformatic (AGGRESCAN e TANGO31,32). Em ambos os casos, esta análise processa uma gradação progressiva das tendências de agregação, atribuindo, como regra...

Agregação da proteína provoca estresse oxidativo celular. Este protocolo descreve um método para monitorar os Estados intracelulares de proteínas amiloidogénicos e o stress oxidativo associado a eles, usando citometria de fluxo. A abordagem é usada para estudar o comportamento de variantes do peptídeo β-amiloide solúveis e propensas a agregação.

Avaliação do impacto da agregação da proteína no estresse oxidativo celular na levedura

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a relação entre a formação de agregados proteicos intracelulares e seu impacto no estresse oxidativo celular usando a levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de doenças de dobramento e agregação de proteínas, como distúrbios neurodegenerativos e amiloidoses não neuropáticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, rápida e permite a quantificação dos danos do estresse oxidativo celular em uma grande população de leveduras.Com este método, podemos fornecer informações sobre a correlação entre o estado intracelular solúvel ou agregado de uma proteína amiloidogênica com os níveis de estresse oxidativo em leveduras. Além disso, também pode ser aplicado a outros organismos modelo que expressam proteínas recombinantes. A demonstrar a análise de citometria de fluxo estará Manuela Costa, técnica do Posto de Citometria de Fluxo da UAB.Neste estudo, o estado de agregação intracelular de diferentes variantes do peptídeo A-beta-42 é rastreado usando S. cerevisiae transformado com um plasmídeo que codifica para A-beta-42 fundido a GFP sob o controle de um promotor

evaluation-impact-protein-aggregation-on-cellular-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste protocolo a expressão do gene, em leveduras...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

Este manuscrito descreve três protocolos complementares para avaliar a toxicidade de poliglutaminas (poliQ)-expansão proteínas na...

Ensaios de crescimento para avaliar a toxicidade poliglutamina em Levedura

Viabilidade celular depende de uma gestão eficiente e oportuna de misfolding proteína. Descrevemos aqui um método para a visualização dos diferentes destinos potenciais de uma proteína misfolded: redobramento, degradação, ou sequestração de inclusões. Nós demonstramos a utilização de um sensor de dobragem,...

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

Este artigo descreve o uso de uma luciferase de pirilampo-GFP proteína de fusão para...

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este artigo descreve um ensaio baseado no crescimento de leveduras para a determinação dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas. Ele também demonstra um método para extração rápida de proteínas de levedura, adequado para western blotting para confirmar bioquimicamente os requisitos de degradação. Essas técnicas podem ser adaptadas para monitorar a degradação de uma variedade de proteínas.

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

A abundância de proteínas reflete as taxas de síntese e degradação de proteínas. Este artigo descreve o uso de perseguição de cicloheximida seguida de western blotting para analisar a degradação de proteínas no eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento).

Cicloheximida Análise perseguição de degradação da proteína em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

O objetivo do método apresentado aqui é explorar a agregação da proteína durante o envelhecimento normal no organismo modelo c. elegans. O protocolo representa uma poderosa ferramenta para estudar os agregados grandes altamente insolúveis que formam com a idade e para determinar como as alterações em proteostasis impactam agregação da proteína.

Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

Dentre as mais adversas condições de stress que organismos encontram durante seu ciclo de vida envolve o acúmulo de oxidantes. Durante o estresse oxidativo, células dependem fortemente de chaperones moleculares. Aqui, apresentamos os métodos usados para investigar redox-regulado antiatividade agregação, bem como para acompanhar mudanças estruturais que regulam a função de acompanhante usando HDX-MS.

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

Este protocolo descreve a extração e visualização de proteínas agregadas e solúveis de Escherichia coli após o tratamento com um antimicrobiano proteotóxico. Após este procedimento permite uma comparação qualitativa da formação de agregado de proteínas in vivo em diferentes cepas bacterianas e/ou entre os tratamentos.

Extração e Visualização de Agregados proteicos após tratamento de Escherichia coli com um Estressor Proteotóxico

Um modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína é necessário para estudar e entender a patogênese da doença de Parkinson. Descrevemos um método para monitorar a citotoxicidade e a formação de agregados de α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado.

Um método para estudar a toxicidade e agregação da α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado

Aprenda a avaliar o impacto da agregação proteica no estresse oxidativo celular em Saccharomyces cerevisiae usando citometria de fluxo. Este método simples e rápido permite quantificar danos oxidativos em grandes populações de levedura.

Avaliação do impacto da agregação da proteína no estresse oxidativo celular na levedura

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