Name: Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-07T18:43:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Aprenda a técnica de injeção retro-orbital em peixe-zebra adulto para estudos de transplante de células-tronco hematopoéticas. Este método permite visualizar células sanguíneas marcadas com fluorescência em Danio rerio.

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Este trabalho é apoiado por Howard Hughes Medical Institute e uma concessão do NIH para o estudo da hematopoiese embrionária.

Parte 1. Preparação de material de injecção <ol><li> Tg (globina: GFP) células: </li><li> Sangrar peixes doadores adultos usando ponteira 10ul revestido em heparina (1unit/ul) para pescar punção por trás de emalhar. </li><li> Aspirar glóbulos vermelhos e dispensar em tampão celular (0.9x PBS + 5% de SFB + 1% Pen / Strep). </li><li> Suspensão de células filtro sobre malha 40uM e determinar a concentração de células usando hemocitômetro como descrito por LeBlanc et al. </li><li> Spin down e ressuspender em tampão celular na concentração desejada de tal forma que o volume de injeção final não é mais do que 5ul. Aqui nós injetar 1,5-2000000 células / destinatário. </li><li> Para o, dextran Texas Red ®, dissolver o corante em DPBS para uma concentração final de injecção de 10-12 mg / mL. Plano para injetar 4 uL por peixe. </li></ol> Parte 2. Injeção <ol><li> Anestesiar peixes em tricaina (4.2ml (4mg/ml) peixes de água tricaine/100ml). </li><li> Lavar seringa Hamilton 3-4 vezes antes da injeção utilizando etanol 70%. Enxágüe 3-4 vezes com DPBS 0.9x. </li><li> Coloque os peixes lado dorsal para cima e virado para a direita na esponja úmida. </li><li> Segure a seringa Hamilton com a mão direita e com o dedo indicador sobre o êmbolo. Suavemente estabilizar o corpo do peixe com a mão esquerda. </li><li> Posição da agulha com o bisel voltado para cima de tal forma que se o olho do peixe s fosse um relógio, a agulha seria apontar para a posição 7:00 e em um ângulo de 45 graus para o peixe (figura 1). </li><li> Inserir a agulha delicadamente 1-2 mm em posição 7:00 e lentamente o êmbolo. </li><li> Permitir que os peixes na água para recuperar E3 fresco. </li><li> Lavar agulha, como descrito acima, entre as injeções de reagentes diferentes. </li><li> Solução Flick célula para ressuspender as células a cada poucos minutos para evitar aglomeração de células. </li><li> Manter o fluxo de peixe por 1 semana com mudanças de água diariamente para evitar a infecção. Mantemos peixe na água UTI para esse período (10 ml + casaco Estresse pemafix 5mL + melafix 5mL por 38 litros de água E3). </li></ol> Parte 3. Resultados representante Quando realizada corretamente, é possível visualizar material injetado, se tiver sido rotulado de alguma forma. Por exemplo, Tg (globina: GFP), as células vermelhas do sangue deve ser visto sob um microscópio fluorescente dissecção circulando na vasculatura do destinatário peixes casper logo após a injeção, como mostrado na figura 2. Da mesma forma, a injeção de um dextran 70kDa, conjugado com Texas Red ® pode ser visualizado na vasculatura de peixe transparente imediatamente após a injeção de retro-orbital (figura 3). Células de rim fluorescente de Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores também podem ser injetados retro-orbital em peixes irradiados casper destinatário. Estas células acabará casa até a medula destinatário (figura 4a) e pode então ir para repovoar o rim depois de várias semanas (figura 4b). Se a injecção é muito raso ou o ângulo da agulha ignora a retro-orbital cavidade do seio venoso, material injetado pode ser visualizado pooling em torno do olho ou saindo dela. Alternativamente, se a injeção é muito profundas, os peixes podem sofrer danos tecido ou sangramento excessivo, mas eles ainda podem se recuperar. Quando realizada corretamente, a mortalidade após retro-orbital injecção deve ser inferior a 5% do peixe total injetado e sucesso de entrega para a corrente sanguínea deve ser superior a 90% do peixe total injetado. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 1"> Figura 1: Ilustração de retro-orbital técnica de injeção. O olho direito do peixe é representado como um relógio analógico em que os sete posição do relógio o corresponde ao local de injeção correta. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 2"> Figura 2: Tg (globina: GFP) glóbulos vermelhos circulantes na vasculatura da cauda de um peixe adulto casper três dias depois de retro-orbital injeção. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 3"> Figura 3: A injeção de sucesso de um dextran 70kDa conjugado com Texas Red ® usado como corante fluorescente produz vasculatura no peixe adulto transparente, casper e é facilmente visualizado utilizando microscopia de fluorescência padrão todo animal. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="Figura 4a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 4a"> Figura 4a: Três dias após retro-orbital injeção de células de rim de todo medula Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores, as células podem ser visualizados homing para a medula renal de peixes irradiados receptor adulto casper. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="Figura 4b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4B"> Figura4b: Quatro semanas após a retro-orbital injeção de células de rim de toda a medula da Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores, o repovoamento do rim destinatário com células da medula do doador verde toda rim pode ser visualizado na irradiados peixes receptor adulto casper.

<ol><li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Bio.+Med%22%5BJournal%5D)">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
</ol>

Retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto dá a maior eficiência de entrega de material injetado na corrente sanguínea com a menor incidência de mortalidade. Devido à natureza do local de injeção, a punção parece curar rapidamente, diminuindo a ocorrência de infecção e da quantidade de perda de sangue. O site pode até ser injetado repetidamente durante um curto período de tempo para injeções diárias de medicamentos, por exemplo. Grandes quantidades de droga deve ser comprado por métodos tra...

<table><tbody><tr><td>Sal de heparina sódica da mucosa intestinal de suíno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>Frasco pré-pesado de 300 unidades USP</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical</td><td></td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Solução Salina Tamponada com Fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red&amp;#174;</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl&lt;br/&gt;0,17 mM KCl&lt;br/&gt;0,33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0,33 mM MgSO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Seringa de microlitros</td><td>Hamilton Co</td><td>80300</td><td>701N 10 µL SYR (26s/2&amp;#8221;/2)</td></tr></tbody></table>

retro-orbital de injeção no zebrafish adulto

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Tratamento medicamentoso de animais inteiros é uma ferramenta essencial em qualquer sistema modelo para farmacológicos e químicos estudos genéticos. Injecção intravenosa (IV) é muitas vezes a forma mais eficaz e não invasivo de transporte de um agente de interesse. No peixe-zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), IV injeção de drogas tem sido um desafio, porque o diâmetro dos pequenos vasos. Esta também se mostrou um obstáculo significativo para a injeção de células durante o transplante de células-tronco hematopoética. Historicamente, as injeções para a corrente sanguínea foram feitas diretamente através do coração. No entanto, este procedimento intra-cardíaca tem uma taxa de mortalidade muito elevada como o coração é freqüentemente furado durante a injeção de deixar o peixe propensos à infecção perda de sangue, maciça ou lesão de órgão fatal. Com base na nossa experiência com o mouse, temos desenvolvido um procedimento de injeção novo no zebrafish em que o local da injeção é atrás do olho e no seio venoso retro-orbital. Este retro-orbital técnica de injeção (RO) tem sido empregada com sucesso em ambos injeção de drogas nos peixes adultos, bem como o transplante de células da medula todo rim. Injeção RO tem uma taxa de mortalidade muito menor do que a injeção intra-cardíaca tradicional. Peixes que são injetados retro-orbital tendem a sangrar a injeção menos seguinte e estão em um risco muito menor de lesão de um órgão importante como o coração. Células Além disso, quando realizado adequadamente, injetado e / ou drogas entrar rapidamente na corrente sangüínea permitindo compostos para exercer seu efeito sobre o peixe inteiro e células de rim facilmente o lar de seu nicho. Assim, esta técnica minimiza nova injeção de mortalidade, permitindo a entrega eficiente de material para a corrente sanguínea de peixes adultos. Aqui nós exemplificar essa técnica, retro-orbital injeção de Tg (<em&gt; Globina</em&gt;: GFP) em células adultas<em&gt; Casper</em&gt; Peixes, bem como a injeção de um corante fluorescente vermelho (dextran, Texas Red<em&gt;</em&gt;) Em adultos<em&gt; Casper</emPeixe&gt;. Em seguida, visualize injeções de sucesso por microscopia de fluorescência toda animais.

Aqui nós mostramos como fazer retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto.

Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto

O tratamento medicamentoso de animais inteiros é uma ferramenta essencial em qualquer sistema de modelo para estudos farmacológicos e de genética química. A injeção intravenosa (IV) é...

Os eritrócitos doadores são inicialmente coletados de peixes transgênicos com globina GFP por punção cardíaca do animal doador e aspiração dos eritrócitos. Após o preparo das células, os peixes receptores são injetados por via retro-orbital e posteriormente analisados por microscopia de fluorescência padrão em todo o organismo, a fim de verificar a injeção bem-sucedida de células marcadas com fluorescência. De forma semelhante, um dextrano corado conjugado à Texas Red é preparado, injetado por via retro-orbital e o animal injetado é analisado para confirmar a injeção bem-sucedida.Olá, sou Emily Atch do Laboratório de Leonard Zan, do Departamento de Hematologia e Oncologia do Hospital Infantil de Boston. Hoje vamos mostrar um procedimento para injeção retro-orbital em peixes-zebra adultos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o transplante de células-tronco hematopoiéticas.Então vamos começar. Demonstraremos as injeções retro-orbitárias de células transgênicas de globina GFP e de um corante fluorescente vermelho, dextrina conjugada com Texas red, em peixes Casper adultos, uma linhagem transparente de peixe-zebra, para preparar células transgênicas de globina GFP. Coletaremos as células do peixe doador adulto utilizando uma ponteira de pipeta de 10 microlitros revestida com heparina para perfurar o peixe atrás das brânquias, aspirar os glóbulos vermelhos e dispensá-los em um tampão celular.Em seguida, filtre a suspensão celular através de malha de 40 micrômetros. Após determinar a concentração das células utilizando um hemocitômetro conforme descrito anteriormente por LeBlanc et al., centrifugue as células a 1500 RPM durante cinco minutos. Re-suspenda as células em tampão celular na concentração desejada, de modo que o volume final de injeção não ultrapasse cinco microlitros.Nesta demonstração, injetaremos de 1,5 a 2 milhões de células por receptor para preparar o corante fluorescente vermelho, dissolvendo-o em DPBS para uma concentração final de injeção de 10 a 12 miligramas por mililitro. Injetaremos quatro microlitros por peixe, já que o procedimento de injeção é o mesmo. Independentemente do material injetado, demonstraremos apenas a injeção do corante fluorescente vermelho.Antes de injetar os peixes, lave a seringa Hamilton três a quatro vezes usando etanol 70%. Enxágue três a quatro vezes com XDPS 0,9. Após anestesiar o peixe em Trica, posicione o peixe com o lado dorsal voltado para cima e voltado para a direita sobre uma esponja úmida.Segure a seringa Hamilton carregada com a mão direita, com o indicador sobre o êmbolo, e com a mão esquerda estabilize suavemente o corpo do peixe. Posicione a agulha com o bisel voltado para cima, de modo que, se o olho do peixe fosse um relógio, a agulha apontasse para a posição sete horas. E com um ângulo de 45 graus em relação ao peixe, insira suavemente a agulha de um a dois milímetros na posição sete horas e pressione lentamente o êmbolo.Deixe o peixe se recuperar em água E3 fresca. Mantenha os peixes fora do fluxo por uma semana com trocas diárias de água para evitar infecções; mantemos os peixes em água de UTI durante este período. Quando as injeções retro-orbitárias são realizadas corretamente, é possível visualizar o material injetado que foi marcado.Por exemplo, glóbulos vermelhos transgênicos de globina GFP podem ser observados sob um microscópio de dissecação fluorescente circulando na vasculatura da cauda de um peixe Casper adulto receptor três dias após a injeção; da mesma forma, a injeção bem-sucedida de uma dextrina de 70 quilodaltons conjugada com Texas red produz imediatamente uma vasculatura fluorescente. Nos peixes Casper adultos transparentes, que são facilmente visualizados por microscopia de fluorescência de todo o organismo, células fluorescentes da medula renal de peixes doadores transgênicos com beta actina GFP também podem ser injetadas por via retro-oral em um peixe Casper receptor irradiado. Essas células eventualmente migram para a medula do receptor, como mostrado aqui, três dias após a injeção; quatro semanas depois, essas células verdes doadoras podem continuar a repovoar o rim do receptor.Acabamos de mostrar como realizar injeções retro-orbitárias em peixes-zebra adultos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de injetar com a agulha em um ângulo de 45 graus em relação ao plano do peixe. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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