Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto

Aqui nós mostramos como fazer retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto.

Os glóbulos vermelhos do doador são coletados primeiro de peixes GFP de globina transgênica perfurando o coração do animal doador e aspirando os glóbulos vermelhos. Uma vez que as células são preparadas para a injeção, os peixes receptores são injetados retroorbitalmente e posteriormente fotografados usando microscopia de fluorescência padrão de animais inteiros para injeção bem-sucedida de células marcadas com fluorescência. Da mesma forma, um corante colorido dextrina conjugado ao vermelho do Texas é preparado e injetado retroorbital e o animal injetado é fotografado para injeção bem-sucedida.

Olá, sou Emily Atch, do Laboratório de Leonard Zan no Departamento de Hematologia e Oncologia do Hospital Infantil de Boston. Hoje vamos mostrar-lhe um procedimento para Injeção retroorbital em peixe-zebra adulto. Utilizamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar o transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Então vamos começar. Estaremos demonstrando as injeções retroorbitais de células GFP de globina transgênica e um corante fluorescente vermelho dextrina conjugado ao vermelho do Texas em peixes Casper adultos, uma raça transparente de peixe-zebra para preparar lobina transgênica. As células GFP sangram peixes doadores adultos usando uma ponta de pipeta de 10 microlitros revestida com heparina para perfurar os peixes atrás das brânquias, aspirar os glóbulos vermelhos e dispensá-los em um tampão celular.

Em seguida, filtre a suspensão da célula sobre uma malha de 40 micrômetros. Depois de determinar a concentração das células usando um hemocitômetro, conforme descrito anteriormente por LeBlanc, os etais gastam nas células a 1500 RPM por cinco minutos. Reus suspende as células em tampão celular em uma concentração desejada, de modo que o volume final de injeção não seja superior a cinco microlitros.

Nesta demonstração, injetaremos 1,5 a 2 milhões de células por receptor para preparar o corante fluorescente vermelho, dissolvê-lo em DPBS para uma concentração final de injeção de 10 a 12 miligramas por mililitro. Estaremos injetando quatro microlitros por peixe, pois o procedimento de injeção é o mesmo. Independentemente do material injetado, demonstraremos apenas a injeção do corante fluorescente vermelho.

Antes de injetar o peixe, lave a seringa Hamilton três a quatro vezes usando etanol a 70%. Enxágue três a quatro vezes com 0,9 XDPS. Depois de anestesiar o peixe em Trica, coloque o lado dorsal do peixe para cima e voltado para a direita em uma esponja úmida.

Segure a seringa Hamilton carregada com a mão direita e com o dedo indicador no êmbolo com a mão esquerda estabilize suavemente o corpo do peixe. Posicione a agulha com o chanfro voltado para cima, de modo que, se o olho do peixe fosse um relógio, a agulha apontasse para a posição das sete horas. E em um ângulo de 45 graus em relação ao peixe, insira suavemente a agulha de um a dois milímetros na posição das sete horas e pressione lentamente o êmbolo.

Deixar o peixe recuperar em água doce E três. Mantenha os peixes fora do fluxo por uma semana com trocas diárias de água para evitar infecções, mantemos os peixes na água da UTI por esse período. Quando as injeções retroorbitais são realizadas corretamente, é possível visualizar o material injetado que foi rotulado.

Por exemplo, glóbulos vermelhos transgênicos de globina GFP podem ser vistos sob um microscópio de dissecção fluorescente circulando na vasculatura da cauda de um peixe Casper adulto receptor três dias após a injeção, da mesma forma a injeção bem-sucedida de uma dextrina de 70 kilodalton conjugada ao vermelho do Texas produz imediatamente vasculatura fluorescente. No peixe Casper adulto transparente, que é facilmente visualizado por microscopia de fluorescência padrão de animais inteiros, as células da medula renal fluorescente de peixes doadores transgênicos de beta-actina GFP também podem ser injetadas retrooralmente em um peixe receptor de Casper irradiado. Essas células acabarão por abrigar a medula receptora, como mostrado aqui, três dias após a injeção, quatro semanas depois, essas células verdes do doador podem repovoar o rim receptor.

Acabamos de mostrar como realizar injeções retroorbitais em peixes-zebra adultos. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de injetar com a agulha em um ângulo de 45 graus em relação ao plano do peixe. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.