Name: Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Aprenda a determinar a localização sub-mitocondrial da quinase Cdk1 e analisar como essa localização afeta a progressão do ciclo celular. Este método utiliza marcação proteica e centrifugação para isolar frações mitocondriais.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas do NIH CA133402, CA152313 e Departamento de Energia Office of Science DE-SC0001271. Agradecemos ao Laboratório de Recursos Compartilhados de Citometria de Fluxo da Universidade da Califórnia Davis com financiamento do NCI P30 CA0933730 e subsídios de 026825 NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 e S10 RR e com assistência técnica da Sra. Bridget McLaughlin e do Sr. Jonathan Van Dyke por sua ajuda com os experimentos de citometria de fluxo.

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Como as proteínas destinadas para outros organelos subcelulares, proteínas mitocondriais possuem sinais alvo específicas no interior da sua estrutura primária ou secundária que os dirigem para o organelo, com a assistência de translocação de proteína elaborada e máquinas de dobragem 21,22. As mitocôndrias sequências de direccionamento (MTS) obtidos a partir de proteínas residentes exclusivamente mitocondriais tais como COX8 pode ser adicionado ao terminal-N de qualquer sequência de genes para proteínas alvo e...

Nos mamíferos, a progressão do ciclo celular é dependente de acontecimentos altamente ordenadas controlados por ciclinas e cinases dependentes de ciclina (CDK) 1. Através de sua citoplasmático, nuclear, e localização centrosomal, CyclinB1 / Cdk1 é capaz de sincronizar diferentes eventos na mitose, tais como quebra envelope nuclear e separação centrossoma 2. CyclinB1 / Cdk1 protege as células mitóticas contra a apoptose 3 e promove a fissão mitocondrial, um passo crítico para uma distribuição igual das mitocôndrias das células filhas recém-formados 4. Em proliferação de células de mamíferos, mitocondrial de ATP é gerado através da fosforilação oxidativa (FOX) construção (cadeia de transporte de electrões), o qual é composto por 5 complexos de multi-subunidades; Complexo I - V complexo (CI-CV). Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH): oxidorredutase ubiquinona ou complexo I (CI) é a maior e menos compreendido dos cinco complexos de 5. O complexo Consists de 45 subunidades, das quais 14 formam o núcleo catalítico. Uma vez montado, o complexo assume uma estrutura em forma de L com um braço saliente na matriz e o outro braço incorporado na membrana interna 6,7. Mutações em subunidades de IC são a causa de uma variedade de doenças mitocondriais 8. Um IC funcionalmente eficiente em OXPHOS é necessário não só para a respiração mitocondrial geral 9, mas também para a progressão do ciclo celular bem sucedida 10. Unravelling os mecanismos subjacentes ao funcionamento deste complexo de enzima ligada à membrana na saúde e na doença pode permitir o desenvolvimento de novos processos de diagnóstico e estratégias terapêuticas avançadas. Em um estudo recente, verificou-se que o / complexo Cdk1 CyclinB1 transloca para dentro da mitocôndria na / (mitose) fase M (Gap 2) G2 e fosforila subunidades CI para aumentar a produção de energia mitocondrial, potencialmente, para compensar o aumento das necessidades energéticas das células durante celular ciclo de 11. Aqui nós showcase procedimentos experimentais e estratégias que podem ser usados ​​para estudar a translocação mitocondrial de cinases em contrário nucleares / citoplasmáticas, os seus substratos mitocondriais, bem como consequências funcionais da sua localização mitocondrial usando CyclinB1 / Cdk1 como um exemplo. A constatação de que o / complexo Cdk1 CyclinB1 transloca para dentro da mitocôndria, quando necessário solicitado os estudos de sobre-expressão específicas de mitocôndrias e knockdown deste complexo. Para conseguir a expressão específica de mitocôndrias de proteínas, pode-se adicionar uma sequência de direccionamento mitocondrial (MTS) no N-terminal da proteína de interesse. Mitocôndrias alvo sequências permitem a ordenação das proteínas mitocondriais na mitocôndria onde eles residem normalmente 12. Temos usado uma sequência de direccionamento 87 mitocôndrias de base derivado do precursor do citocromo humano subunidade c oxidase 8A (COX8) e clonado-lo em Green Fluorescent Protein (GFP) tagged CyclinB1 ou vermelho fluorescenteProtein (RFP) tagged Cdk1 contendo plasmídeos no quadro. Este método permitiu-nos atingir CyclinB1 e Cdk1 na mitocôndria, que alterou a expressão mitocondrial destas proteínas sem afetar sua piscina nuclear. Por fluorescente marcação destas proteínas, fomos capazes de monitorar a sua localização em tempo real. Da mesma forma, nós introduzimos MTS em um plasmídeo contendo marcado-RFP dominante negativo Cdk1, o que nos permitiu bater especificamente para baixo a expressão mitocondrial e funções de Cdk1. É essencial para distinguir entre as funções mitocondriais e nucleares das quinases que têm localizações dupla como Cdk1. Engenharia MTS para o N-terminal destas cinases funcionais duais oferece uma grande estratégia que é fácil de ser utilizado e eficaz. Desde Cdk1 é uma quinase do ciclo celular, que é fundamental para determinar a progressão do ciclo celular quando Cdk1 está localizada dentro da mitocôndria. Para conseguir isso, nós utilizamos uma nova metod para monitorizar o conteúdo em ADN em células. Os métodos tradicionais incluem a utilização de BrdU (bromodesoxiuridina), um análogo da timidina sintética, que incorpora-se no ADN sintetizado de novo durante a fase S do ciclo celular para substituir timidina. Em seguida, as células que estão a replicar o seu DNA activamente pode ser detectada utilizando anticorpos anti-BrdU. Uma desvantagem deste método é que ele exige a desnaturação de ADN para fornecer acesso para o anticorpo BrdU por métodos agressivos como tratamento com ácido ou calor, o que pode resultar em inconsistência entre os resultados 13,14. Alternativamente, utilizou-se uma abordagem semelhante para monitorar as células que se dividem activamente com um análogo da timidina diferente, EdU. detecção EdU não requer desnaturação DNA dura como o tratamento detergente suave permite que o reagente de detecção para acessar o EdU no DNA recém-sintetizado. O método EdU provou ser mais confiável, consistente e com potencial para a análise de alto rendimento 15. Finalmente, to determinar os substratos mitocondriais de Cdk1, usamos uma ferramenta proteômica chamado 2D DIGE, que é uma versão avançada do eletroforese em gel clássico bidimensional. Electroforese bidimensional separa as proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico na primeira dimensão e o peso molecular na segunda. Uma vez que as modificações pós-traducionais, tais como fosforilação afectar o ponto isoeléctrico e o peso molecular das proteínas, géis 2D podem detectar diferenças entre os estados de fosforilação de proteínas nas amostras diferentes. O tamanho (área e intensidade) de proteína acaba alterações com o nível de expressão de proteínas, permitindo a comparação quantitativa entre múltiplas amostras. Usando este método, fomos capazes de diferenciar as proteínas fosforiladas no tipo selvagem contra células que expressam CDK1 segmentada por mitocôndrias mutantes. Os spots de proteínas específicas que mostraram no tipo selvagem, mas estavam faltando no mutante preparação Cdk1 segmentada por mitocôndrias foram isoladas eidentificado através de espectrometria de massa. Nos geles 2D tradicionais, corantes de trifenilmetano são utilizados para visualizar as proteínas no gel. 2D DIGE usa rótulos proteína fluorescente com um efeito mínimo sobre a mobilidade eletroforética de proteínas. Diferentes amostras de proteínas podem ser marcados com diferentes corantes fluorescentes, misturados entre si e separadas por os géis idênticos, permitindo que a co-electroforese de amostras múltiplas com uma única gel 16. Isto minimiza as variações de gel-a-gel, o que é um problema crítico nos estudos proteómica à base de gel.

<table><tbody><tr><td>32P ATP&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU002001MC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-camundongo</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-11003</td><td>Alexa-546 anticorpo</td></tr><tr><td>secundário anti-coelho</td> conjugado <td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A11029</td><td>Alexa-488 conjugado</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Research Organics</td><td>1166A</td><td>Para ensaio de quinase in vitro</td></tr><tr><td>Anticorpo Cdk1</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>9112</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de quinase Cdk1 New</td><td>England Biolabs</td><td>P6020S</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imagem</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td>Para análise do ciclo celular com marcação EdU</td></tr><tr><td></td><td>Tecnologia de sinalização celular</td> de anticorpo COX IV <td>4844S</td><td>para imunocoloração mitocondrial</td></tr><tr><td>Anticorpo Ciclina B1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-752</td><td></td></tr><tr><td>Complexo enzimático CyclinB1 / Cdk1 New</td><td>England Biolabs</td><td>P6020S</td><td>Evite congelar / descongelar</td></tr><tr><td>Kit de rotulagem de flúor CyDye DIGE</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>DIGE Gel e kit tampão DIGE</td><td>GE Ciências da Vida em Saúde</td><td>28-9480-26 AA</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319937</td><td>DMF</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>DTT</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>EMD Millipore</td><td>71004</td><td>Para mutagênese dirigida ao local</td></tr><tr><td>Dpn I enzima</td><td>Stratagene</td><td>200519-53</td><td>Para mutagênese dirigida</td></tr><tr><td>ao local Fluido de cobertura de tira seca</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1335-01</td><td>Usado como óleo mineral</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-03</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Vacufuge Concentrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td>Usado como concentrador de centrífuga a vácuo</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Solução de montagem anti-desbotamento</td></tr><tr><td>Fortessa Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>649908</td><td>Para ciclo celular análise com marcação EdU</td></tr><tr><td>Histona H1</td><td>Calbiochem</td><td>382150</td><td>Para ensaio de quinase in vitro</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Para purificar fragmentos de DNA de géis de agarose</td></tr><tr><td>Géis Immobiline DryStrip</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1016-61</td><td>Tiras IEF (foco isoelétrico)</td></tr><tr><td>Glutationa imobilizada</td><td>Thermo Scientific</td><td>15160</td><td>Grânulos de glutationa-agarose</td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>IAA</td></tr><tr><td>IPGphor 3 Unidade de Foco Isoelétrico</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>11-0033-64</td><td>Suportes de tira IPGphor</td></tr><tr><td>Isopropil-b-D-tio-galactopiranosídeo&nbsp;</td><td>RPI Corp</td><td>156000-5.0</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9783</td><td>Para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td>Para rotulagem CyDye</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>EMD Chemicals</td><td>5960</td><td></td></tr><tr><td>Mitoctracker Vermelho/Verde</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>M7512/M7514</td><td>Corantes fluorescentes mitocondriais</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>EMD Chemicals</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clonetech</td><td>6085-1</td><td>Vetor que expressa GFP</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>Stratagene</td><td>600-255-52</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-5X-1&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9545-53</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonil</td> vetor que expressa GST <td>Shelton Scientific</td><td>IB01090</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Spectra/Por 4 tubos de diálise</td><td>Spectrum Labs</td><td>132700</td><td>como tubo de membrana porosa para diálise</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>P-33300</td><td>Para coloração de fosfoproteínas em géis 2D</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de proteinase</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td>Para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Kit de mutagênese dirigida ao local QuikChange</td><td>Kit Stratagene</td><td>200519-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit de isolamento</td> de <td>plasmídeo</td><td>Qiagen</td><td>27104</td> MiniPrep</tr><tr><td>RO-3306</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>270-463-M001</td><td>Inibidor de Cdk1</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>MP Biomedicals</td><td>150154</td><td>Inibidor do Complexo I</td></tr><tr><td>Carbonato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S93359</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>EMD Chemicals</td><td>SX0420-5</td><td>Para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Ortovanadato</td><td>de sódio MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Pirofosfato de sódio decahidratado</td><td>Alfa Aesar</td><td>33385</td><td>Para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Sódio &beta;-glicerofosfato</td><td>Alfa Aesar</td><td>L03425</td><td>Para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>SpectraMax M2e&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>M2E</td><td>Microplate reader</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Grinder pilão</td><td>Kimble Chase</td><td>885301-0007</td><td>Para isolamento de mitocôndrias</td></tr><tr><td>Tubo de triturador de tecidos</td><td>Kimble Chase</td><td>885303-0007</td><td>Para isolamento de mitocôndrias</td></tr><tr><td>Solução de ácido tricloroacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td>TCA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Calbiochem</td><td>650211</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Scanner de gel a laser para 2D-DIGE</td></tr><tr><td>Ubiquinona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7956</td><td></td></tr></tbody></table>

abordagens experimentais para estudar mitocondrial localização e função de um ciclo celular nuclear kinase, cdk1

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Embora as mitocôndrias possuam sua própria maquinaria transcricional, apenas 1% das proteínas mitocondriais são sintetizadas dentro da organela. As proteínas codificadas no núcleo são transportadas para as mitocôndrias guiadas por suas sequências de direcionamento de mitocôndrias (MTS); no entanto, a maioria das proteínas localizadas mitocondriais não possui um MTS identificável. No entanto, o fato de que o MTS pode instruir proteínas a entrar na mitocôndria fornece uma ferramenta valiosa para estudar as funções mitocondriais de proteínas normalmente nucleares e / ou citoplasmáticas. Recentemente, identificamos o complexo quinase do ciclo celular CyclinB1 / Cdk1 nas mitocôndrias. Para estudar especificamente as funções mitocondriais desse complexo, a superexpressão mitocondrial e o knock-down desse complexo sem interferir em suas funções nucleares ou citoplasmáticas foram essenciais. Ao marcar CyclinB1 / Cdk1 com MTS, fomos capazes de alcançar a superexpressão mitocondrial deste complexo para estudar seus alvos mitocondriais, bem como funções. Por meio da marcação de Cdk1 dominante-negativo com MTS, a inibição da atividade de Cdk1 foi realizada particularmente nas mitocôndrias. Potenciais alvos mitocondriais do complexo CyclinB1 / Cdk1 foram identificados usando uma abordagem proteômica baseada em gel. Ao contrário da análise tradicional de gel 2D, empregamos a tecnologia de eletroforese em gel de diferença bidimensional (2D-DIGE) seguida de coloração de fosfoproteína para marcar fluorescentemente proteínas diferencialmente fosforiladas em células mitocondriais que expressam Cdk1. A identificação de manchas de fosfoproteína que foram alteradas no tipo selvagem versus mitocôndrias com Cdk1 negativo dominante revelou a identidade de alvos mitocondriais de Cdk1. Finalmente, para determinar o efeito da localização mitocondrial de CyclinB1 / Cdk1 na progressão do ciclo celular, um ensaio de proliferação celular usando um análogo sintético de timidina EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) foi usado para monitorar as células à medida que passam pelo ciclo celular e replicam seu DNA. Ao todo, demonstramos uma variedade de abordagens disponíveis para estudar a localização mitocondrial e a atividade de uma quinase do ciclo celular. Estes são métodos avançados, mas fáceis de seguir, que serão benéficos para muitos pesquisadores de biologia celular.

Localização sub-mitocondrial de CyclinB1 e Cdk1 extracção de carbonato de sódio é usado para determinar se uma proteína está localizada no interior da mitocôndria ou na superfície exterior, ou seja, da membrana externa. Uma vez que uma proteína é mostrada para localizar dentro da mitocôndria, nova determinação da localização sub-mitocondrial pode ser feita através de mitoplasting combinado com digestão com pro...

Aqui, descrevemos como estudar a localização mitocondrial de uma quinase (ciclo celular) e como determinar sua localização submitocondrial, bem como potenciais substratos/alvos mitocondriais. A expressão forçada de proteínas nas mitocôndrias fornece uma ferramenta útil para estudar as consequências funcionais da localização mitocondrial de uma proteína de interesse.

Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é determinar a localização submitocondrial de uma quinase normalmente nuclear envolvida no ciclo celular e, em seguida, analisar como sua localização mitocondrial afeta a progressão do ciclo celular. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da pesquisa mitocondrial, como a forma pela qual o núcleo se comunica com as mitocôndrias durante o ciclo celular. Ao marcar proteínas com uma sequência direcionadora mitocondrial, podemos aproveitar a superexpressão específica da proteína nas mitocôndrias, permitindo estudar suas funções específicas nesse compartimento.Embora este método possa fornecer informações sobre o direcionamento mitocondrial de certas proteínas, ele também pode ser aplicado a outros organelos, como o núcleo, retículo endoplasmático, complexo de Golgi e lisossomo. Após o cultivo, homogeneização e centrifugação das células de acordo com o protocolo descrito, transfira o sobrenadante para um novo tubo. Em seguida, centrifugue a amostra a 7.000 g e 4 graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, utilize 200 microlitros de tampão IBC gelado para ressuspender o pellet e divida o homogenato em duas alíquotas. Centrifugue as amostras novamente a 7.000 g e 4 graus Celsius por 10 minutos. E repita a lavagem.Após descartar o sobrenadante, adicione 30 microlitros de tampão de lise celular a um dos pellets e armazene o lisado a 80 graus Celsius para imunoblotagem. Para realizar a extração com carbonato de sódio com o segundo pellet, a fim de separar proteínas solúveis e ligadas à membrana, adicione 250 microlitros de carbonato de sódio 0,1 molar, pH 11,0, e incube no gelo por 30 minutos. Centrifugue a 100.000 ×g por 20 minutos.Em seguida, colete o sobrenadante e adicione um volume igual de ácido tricloroacético a 20%, recém-preparado, para precipitar as proteínas. Mantenha na gelo por 30 minutos. Enquanto isso, adicione 30 microlitros de tampão de lise celular ao precipitado e sonique de acordo com o protocolo descrito no texto antes de armazenar a 80 graus Celsius para imunoblotagem.Após a incubação de 30 minutos com TCA, centrifugue a reação a 15.000 g por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e, em seguida, utilize 80 microlitros de tampão de lise celular para ressuspender o precipitado. Após o isolamento das frações mitocondriais a partir de células conforme descrito no protocolo textual, separe as frações mitocondriais em 10 porções iguais.Centrifugue as amostras a 7.000 g e 4 graus Celsius durante 10 minutos. Utilize 30 microlitros de uma faixa de concentrações de tampões de sacarose hipotônicos com ou sem tripsina para dissolver cada pellet. Incube em gelo por 30 minutos.Adicione 3 microlitros de PMSF 10 milimolar aos tubos contendo tripsina para interromper a digestão com tripsina. Incube em gelo por 10 minutos. Centrifugue as amostras a 14.000 g e 4 graus Celsius por 10 minutos.E transfira o sobrenatante para um novo tubo. Para lisar o pellet, adicione 30 microlitros de tampão de lise celular. Sonique as amostras conforme descrito no protocolo textual e armazene a 80 graus Celsius.Para construir vetores de ciclina B1-Cdk1 marcados com GFP/RFP direcionados às mitocôndrias, clone a sequência de direcionamento mitocondrial do precursor da subunidade 8A da citocromo-c oxidase humana e enquadre-a no extremo N-terminal da GFP ou RFP nos sítios Nhe1 e BamH1 dos vetores pEGFP-N1 ou pERFP-N1, utilizando técnicas padrão de clonagem molecular. Utilizando os iniciadores descritos no protocolo textual, amplifique os genes Cdk1 e ciclina B1 seguindo técnicas padrão. Em seguida, use BamH1 para digerir os produtos de PCR.Execute as reações em um gel de agarose a 1%, antes de usar uma lâmina de barbear para cortar os fragmentos de DNA do tamanho correto. Em seguida, utilize um kit de extração de gel para purificar o DNA. Depois, digira um micrograma dos plasmídeos MTS-pEGFP-N1 e MTS-pERFP-N1 com 1 microlitro de BamH1 a 37 graus Celsius por 2 horas.Em seguida, adicione 1 microlitro de fosfatase alcalina de intestino de bezerro e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após correr os produtos da digestão em um gel de agarose 1% e purificar o DNA conforme descrito acima, monte uma reação de ligação utilizando os reagentes listados no protocolo do texto. Em seguida, incube a reação a 4 graus Celsius durante a noite.Transforme células competentes de E. coli dH5-alpha com 10 microlitros da mistura de ligação. E cultive as bactérias em placas de ágar LB contendo 10 miligramas por mililitro de canamicina a 37 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, utilize uma ponta de pipeta estéril para selecionar uma colônia de uma placa. Em seguida, insira a ponta em um tubo contendo 5 mililitros de LB com canamicina. Incube a cultura durante a noite e, na manhã seguinte, utilize um kit de mini-prep conforme o protocolo descrito para isolar o plasmídeo.Para transfectar células MCF-10A em crescimento exponencial, use plasmídeos de Cdk1 ou ciclina B-1 para preparar o reagente de transfeção de plasmídeo na proporção de 1:2 em 100 microlitros de meio livre de soro e antibiótico. Transfecte as células e incube a 37 graus Celsius por 48 horas. Revele e visualize as mitocôndrias de acordo com o protocolo descrito no texto.Para realizar a classificação celular, transfectar 2 vezes 10⁵ células com os vetores desejados em uma placa de 6 poços usando uma proporção de 1:2 de DNA para reagente de transfeção preparado em 2,5 mililitros de meio livre de soro e antibiótico. Após incubar a transfeção por 48 horas, utilizar citometria de fluxo para classificar células vivas que expressem estavelmente as proteínas Cdk-1 marcada com GFP e ciclinaB1 marcada com RFP, conforme protocolo descrito. Para medir o comprimento do ciclo celular utilizando o ensaio de citometria de fluxo com marcação por EdU, semear as células classificadas em placas de 6 poços numa densidade de 2,5 vezes 10⁵ células por poço.Após uma incubação durante a noite, adicione EdU ao meio de cultura em uma concentração final de 25 micromolar e incube por mais uma hora. Em seguida, em intervalos de duas horas, use 1% de BSA em 500 microlitros de PBS para lavar um poço de células. E colete em um tubo de 1,5 mililitro.Centrifugue as células a 350 g durante 5 minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante. Desprenda o pellet adicionando 100 microlitros de solução fixadora.Agite bem e incube à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, use 1 mililitro de BSA 1% em PBS para lavar as células três vezes. Depois, use 0,5 mililitros de etanol 70% para fixar as células a 4 graus Celsius durante a noite.Ao realizar a marcação com EdU em células transfectadas com proteínas marcadas com GFP e RFP, é essencial quencher os sinais fluorescentes de GFP e RFP. Para isso, adicionamos uma etapa extra de fixação celular durante a noite usando etanol 70%. No dia seguinte, após lavar e permeabilizar as células de acordo com o protocolo descrito, adicione 0,5 mililitros do coquetel de reação em cada tubo e misture bem.Após a incubação no escuro e uma nova lavagem, utilize 50 microgramas por mililitro de iodeto de propídio ou PI em PBS com 1% de BSA para corar o DNA. Analise as células por citometria de fluxo para acompanhar a população positiva para EdU. Apresente um gráfico de dispersão de pontos de células marcadas com EdU, coradas para conteúdo de DNA e EdU.Utilize o canal APC para o EdU Alexa 647 com um filtro passa-banda de 670 30, com toda a luz presente, abaixo de 685 nanômetros atingindo esse filtro, e o canal de fitoeritrina para o PI com um filtro passa-banda de 581 15 na frente, com toda a luz presente abaixo de 600 nanômetros atingindo esse filtro. Com uma estratégia padrão de aquisição por portas, plote área da FSC pela área da SSC para morfologia, seguido por PI pelo EdU Alexa 647 para coloração celular. Registre os dados de todos os tubos um por um, adquirindo 10.000 eventos por amostra.Nesta figura, a proteína da matriz mitocondrial Hsp60 e a proteína do espaço intermembranar Timm13 foram utilizadas como marcadores de localização submitocondrial. Semelhante ao Hsp60, mas ao contrário do Timm13, a ciclina B1 e a Cdk1 foram protegidas da digestão por tripsina, indicando que elas se localizam na matriz mitocondrial. Como mostrado aqui, por meio de Western blotting das frações mitocondriais isoladas, utilizando construtos de ciclina B1 e Cdk-1 marcados com MTS e GFP, conseguiu-se a superexpressão da ciclina B1 e/ou da Cdk-1 nas mitocôndrias.Utilizando um ensaio de pulse chase com EdU, demonstrou-se que as células marcadas em fase S progrediram pela fase G2M e apareceram na fase G1 em até 4 horas em células que expressavam a ciclinaB1 mitocondrial de tipo selvagem com Cdk-1. Em comparação com 6 horas, em células transfectadas com controle de vetor ou ciclinaB1 mutante com Cdk-1, indicando que a potencialização da ciclinaB1 mitocondrial com Cdk-1 acelera a progressão do ciclo celular. Após este procedimento, outros métodos, como a geração mitocondrial de ATP, consumo de oxigênio, potencial de membrana e espécies reativas de oxigênio, podem ser medidos para responder perguntas adicionais, como a forma pela qual a localização mitocondrial da quinase do ciclo celular Cdk-1 altera a respiração e a produção de energia mitocondriais.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar a localização mitocondrial e as funções específicas das mitocôndrias de uma quinase nuclear.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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