Name: Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Aprenda a determinar a localização sub-mitocondrial da quinase Cdk1 e analisar como essa localização afeta a progressão do ciclo celular. Este método utiliza marcação proteica e centrifugação para isolar frações mitocondriais.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas do NIH CA133402, CA152313 e Departamento de Energia Office of Science DE-SC0001271. Agradecemos ao Laboratório de Recursos Compartilhados de Citometria de Fluxo da Universidade da Califórnia Davis com financiamento do NCI P30 CA0933730 e subsídios de 026825 NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 e S10 RR e com assistência técnica da Sra. Bridget McLaughlin e do Sr. Jonathan Van Dyke por sua ajuda com os experimentos de citometria de fluxo.

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Como as proteínas destinadas para outros organelos subcelulares, proteínas mitocondriais possuem sinais alvo específicas no interior da sua estrutura primária ou secundária que os dirigem para o organelo, com a assistência de translocação de proteína elaborada e máquinas de dobragem 21,22. As mitocôndrias sequências de direccionamento (MTS) obtidos a partir de proteínas residentes exclusivamente mitocondriais tais como COX8 pode ser adicionado ao terminal-N de qualquer sequência de genes para proteínas alvo e...

Nos mamíferos, a progressão do ciclo celular é dependente de acontecimentos altamente ordenadas controlados por ciclinas e cinases dependentes de ciclina (CDK) 1. Através de sua citoplasmático, nuclear, e localização centrosomal, CyclinB1 / Cdk1 é capaz de sincronizar diferentes eventos na mitose, tais como quebra envelope nuclear e separação centrossoma 2. CyclinB1 / Cdk1 protege as células mitóticas contra a apoptose 3 e promove a fissão mitocondrial, um passo crítico para uma distribuição igual das mitocôndrias das células filhas recém-formados 4. Em proliferação de células de mamíferos, mitocondrial de ATP é gerado através da fosforilação oxidativa (FOX) construção (cadeia de transporte de electrões), o qual é composto por 5 complexos de multi-subunidades; Complexo I - V complexo (CI-CV). Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH): oxidorredutase ubiquinona ou complexo I (CI) é a maior e menos compreendido dos cinco complexos de 5. O complexo Consists de 45 subunidades, das quais 14 formam o núcleo catalítico. Uma vez montado, o complexo assume uma estrutura em forma de L com um braço saliente na matriz e o outro braço incorporado na membrana interna 6,7. Mutações em subunidades de IC são a causa de uma variedade de doenças mitocondriais 8. Um IC funcionalmente eficiente em OXPHOS é necessário não só para a respiração mitocondrial geral 9, mas também para a progressão do ciclo celular bem sucedida 10. Unravelling os mecanismos subjacentes ao funcionamento deste complexo de enzima ligada à membrana na saúde e na doença pode permitir o desenvolvimento de novos processos de diagnóstico e estratégias terapêuticas avançadas. Em um estudo recente, verificou-se que o / complexo Cdk1 CyclinB1 transloca para dentro da mitocôndria na / (mitose) fase M (Gap 2) G2 e fosforila subunidades CI para aumentar a produção de energia mitocondrial, potencialmente, para compensar o aumento das necessidades energéticas das células durante celular ciclo de 11. Aqui nós showcase procedimentos experimentais e estratégias que podem ser usados ​​para estudar a translocação mitocondrial de cinases em contrário nucleares / citoplasmáticas, os seus substratos mitocondriais, bem como consequências funcionais da sua localização mitocondrial usando CyclinB1 / Cdk1 como um exemplo. A constatação de que o / complexo Cdk1 CyclinB1 transloca para dentro da mitocôndria, quando necessário solicitado os estudos de sobre-expressão específicas de mitocôndrias e knockdown deste complexo. Para conseguir a expressão específica de mitocôndrias de proteínas, pode-se adicionar uma sequência de direccionamento mitocondrial (MTS) no N-terminal da proteína de interesse. Mitocôndrias alvo sequências permitem a ordenação das proteínas mitocondriais na mitocôndria onde eles residem normalmente 12. Temos usado uma sequência de direccionamento 87 mitocôndrias de base derivado do precursor do citocromo humano subunidade c oxidase 8A (COX8) e clonado-lo em Green Fluorescent Protein (GFP) tagged CyclinB1 ou vermelho fluorescenteProtein (RFP) tagged Cdk1 contendo plasmídeos no quadro. Este método permitiu-nos atingir CyclinB1 e Cdk1 na mitocôndria, que alterou a expressão mitocondrial destas proteínas sem afetar sua piscina nuclear. Por fluorescente marcação destas proteínas, fomos capazes de monitorar a sua localização em tempo real. Da mesma forma, nós introduzimos MTS em um plasmídeo contendo marcado-RFP dominante negativo Cdk1, o que nos permitiu bater especificamente para baixo a expressão mitocondrial e funções de Cdk1. É essencial para distinguir entre as funções mitocondriais e nucleares das quinases que têm localizações dupla como Cdk1. Engenharia MTS para o N-terminal destas cinases funcionais duais oferece uma grande estratégia que é fácil de ser utilizado e eficaz. Desde Cdk1 é uma quinase do ciclo celular, que é fundamental para determinar a progressão do ciclo celular quando Cdk1 está localizada dentro da mitocôndria. Para conseguir isso, nós utilizamos uma nova metod para monitorizar o conteúdo em ADN em células. Os métodos tradicionais incluem a utilização de BrdU (bromodesoxiuridina), um análogo da timidina sintética, que incorpora-se no ADN sintetizado de novo durante a fase S do ciclo celular para substituir timidina. Em seguida, as células que estão a replicar o seu DNA activamente pode ser detectada utilizando anticorpos anti-BrdU. Uma desvantagem deste método é que ele exige a desnaturação de ADN para fornecer acesso para o anticorpo BrdU por métodos agressivos como tratamento com ácido ou calor, o que pode resultar em inconsistência entre os resultados 13,14. Alternativamente, utilizou-se uma abordagem semelhante para monitorar as células que se dividem activamente com um análogo da timidina diferente, EdU. detecção EdU não requer desnaturação DNA dura como o tratamento detergente suave permite que o reagente de detecção para acessar o EdU no DNA recém-sintetizado. O método EdU provou ser mais confiável, consistente e com potencial para a análise de alto rendimento 15. Finalmente, to determinar os substratos mitocondriais de Cdk1, usamos uma ferramenta proteômica chamado 2D DIGE, que é uma versão avançada do eletroforese em gel clássico bidimensional. Electroforese bidimensional separa as proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico na primeira dimensão e o peso molecular na segunda. Uma vez que as modificações pós-traducionais, tais como fosforilação afectar o ponto isoeléctrico e o peso molecular das proteínas, géis 2D podem detectar diferenças entre os estados de fosforilação de proteínas nas amostras diferentes. O tamanho (área e intensidade) de proteína acaba alterações com o nível de expressão de proteínas, permitindo a comparação quantitativa entre múltiplas amostras. Usando este método, fomos capazes de diferenciar as proteínas fosforiladas no tipo selvagem contra células que expressam CDK1 segmentada por mitocôndrias mutantes. Os spots de proteínas específicas que mostraram no tipo selvagem, mas estavam faltando no mutante preparação Cdk1 segmentada por mitocôndrias foram isoladas eidentificado através de espectrometria de massa. Nos geles 2D tradicionais, corantes de trifenilmetano são utilizados para visualizar as proteínas no gel. 2D DIGE usa rótulos proteína fluorescente com um efeito mínimo sobre a mobilidade eletroforética de proteínas. Diferentes amostras de proteínas podem ser marcados com diferentes corantes fluorescentes, misturados entre si e separadas por os géis idênticos, permitindo que a co-electroforese de amostras múltiplas com uma única gel 16. Isto minimiza as variações de gel-a-gel, o que é um problema crítico nos estudos proteómica à base de gel.

<table><tbody><tr><td>32P ATP&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU002001MC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-camundongo</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-11003</td><td>Alexa-546 anticorpo</td></tr><tr><td>secundário anti-coelho</td> conjugado <td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A11029</td><td>Alexa-488 conjugado</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Research Organics</td><td>1166A</td><td>Para ensaio de quinase in vitro</td></tr><tr><td>Anticorpo Cdk1</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>9112</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de quinase Cdk1 New</td><td>England Biolabs</td><td>P6020S</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imagem</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td>Para análise do ciclo celular com marcação EdU</td></tr><tr><td></td><td>Tecnologia de sinalização celular</td> de anticorpo COX IV <td>4844S</td><td>para imunocoloração mitocondrial</td></tr><tr><td>Anticorpo Ciclina B1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-752</td><td></td></tr><tr><td>Complexo enzimático CyclinB1 / Cdk1 New</td><td>England Biolabs</td><td>P6020S</td><td>Evite congelar / descongelar</td></tr><tr><td>Kit de rotulagem de flúor CyDye DIGE</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>DIGE Gel e kit tampão DIGE</td><td>GE Ciências da Vida em Saúde</td><td>28-9480-26 AA</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319937</td><td>DMF</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>DTT</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>EMD Millipore</td><td>71004</td><td>Para mutagênese dirigida ao local</td></tr><tr><td>Dpn I enzima</td><td>Stratagene</td><td>200519-53</td><td>Para mutagênese dirigida</td></tr><tr><td>ao local Fluido de cobertura de tira seca</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1335-01</td><td>Usado como óleo mineral</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-03</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Vacufuge Concentrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td>Usado como concentrador de centrífuga a vácuo</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Solução de montagem anti-desbotamento</td></tr><tr><td>Fortessa Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>649908</td><td>Para ciclo celular análise com marcação EdU</td></tr><tr><td>Histona H1</td><td>Calbiochem</td><td>382150</td><td>Para ensaio de quinase in vitro</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Para purificar fragmentos de DNA de géis de agarose</td></tr><tr><td>Géis Immobiline DryStrip</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1016-61</td><td>Tiras IEF (foco isoelétrico)</td></tr><tr><td>Glutationa imobilizada</td><td>Thermo Scientific</td><td>15160</td><td>Grânulos de glutationa-agarose</td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>IAA</td></tr><tr><td>IPGphor 3 Unidade de Foco Isoelétrico</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>11-0033-64</td><td>Suportes de tira IPGphor</td></tr><tr><td>Isopropil-b-D-tio-galactopiranosídeo&nbsp;</td><td>RPI Corp</td><td>156000-5.0</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9783</td><td>Para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td>Para rotulagem CyDye</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>EMD Chemicals</td><td>5960</td><td></td></tr><tr><td>Mitoctracker Vermelho/Verde</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>M7512/M7514</td><td>Corantes fluorescentes mitocondriais</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>EMD Chemicals</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clonetech</td><td>6085-1</td><td>Vetor que expressa GFP</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>Stratagene</td><td>600-255-52</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-5X-1&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9545-53</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonil</td> vetor que expressa GST <td>Shelton Scientific</td><td>IB01090</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Spectra/Por 4 tubos de diálise</td><td>Spectrum Labs</td><td>132700</td><td>como tubo de membrana porosa para diálise</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>P-33300</td><td>Para coloração de fosfoproteínas em géis 2D</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de proteinase</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td>Para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Kit de mutagênese dirigida ao local QuikChange</td><td>Kit Stratagene</td><td>200519-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit de isolamento</td> de <td>plasmídeo</td><td>Qiagen</td><td>27104</td> MiniPrep</tr><tr><td>RO-3306</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>270-463-M001</td><td>Inibidor de Cdk1</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>MP Biomedicals</td><td>150154</td><td>Inibidor do Complexo I</td></tr><tr><td>Carbonato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S93359</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>EMD Chemicals</td><td>SX0420-5</td><td>Para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Ortovanadato</td><td>de sódio MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Pirofosfato de sódio decahidratado</td><td>Alfa Aesar</td><td>33385</td><td>Para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Sódio &beta;-glicerofosfato</td><td>Alfa Aesar</td><td>L03425</td><td>Para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>SpectraMax M2e&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>M2E</td><td>Microplate reader</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Grinder pilão</td><td>Kimble Chase</td><td>885301-0007</td><td>Para isolamento de mitocôndrias</td></tr><tr><td>Tubo de triturador de tecidos</td><td>Kimble Chase</td><td>885303-0007</td><td>Para isolamento de mitocôndrias</td></tr><tr><td>Solução de ácido tricloroacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td>TCA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Calbiochem</td><td>650211</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Scanner de gel a laser para 2D-DIGE</td></tr><tr><td>Ubiquinona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7956</td><td></td></tr></tbody></table>

abordagens experimentais para estudar mitocondrial localização e função de um ciclo celular nuclear kinase, cdk1

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Embora as mitocôndrias possuam sua própria maquinaria transcricional, apenas 1% das proteínas mitocondriais são sintetizadas dentro da organela. As proteínas codificadas no núcleo são transportadas para as mitocôndrias guiadas por suas sequências de direcionamento de mitocôndrias (MTS); no entanto, a maioria das proteínas localizadas mitocondriais não possui um MTS identificável. No entanto, o fato de que o MTS pode instruir proteínas a entrar na mitocôndria fornece uma ferramenta valiosa para estudar as funções mitocondriais de proteínas normalmente nucleares e / ou citoplasmáticas. Recentemente, identificamos o complexo quinase do ciclo celular CyclinB1 / Cdk1 nas mitocôndrias. Para estudar especificamente as funções mitocondriais desse complexo, a superexpressão mitocondrial e o knock-down desse complexo sem interferir em suas funções nucleares ou citoplasmáticas foram essenciais. Ao marcar CyclinB1 / Cdk1 com MTS, fomos capazes de alcançar a superexpressão mitocondrial deste complexo para estudar seus alvos mitocondriais, bem como funções. Por meio da marcação de Cdk1 dominante-negativo com MTS, a inibição da atividade de Cdk1 foi realizada particularmente nas mitocôndrias. Potenciais alvos mitocondriais do complexo CyclinB1 / Cdk1 foram identificados usando uma abordagem proteômica baseada em gel. Ao contrário da análise tradicional de gel 2D, empregamos a tecnologia de eletroforese em gel de diferença bidimensional (2D-DIGE) seguida de coloração de fosfoproteína para marcar fluorescentemente proteínas diferencialmente fosforiladas em células mitocondriais que expressam Cdk1. A identificação de manchas de fosfoproteína que foram alteradas no tipo selvagem versus mitocôndrias com Cdk1 negativo dominante revelou a identidade de alvos mitocondriais de Cdk1. Finalmente, para determinar o efeito da localização mitocondrial de CyclinB1 / Cdk1 na progressão do ciclo celular, um ensaio de proliferação celular usando um análogo sintético de timidina EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) foi usado para monitorar as células à medida que passam pelo ciclo celular e replicam seu DNA. Ao todo, demonstramos uma variedade de abordagens disponíveis para estudar a localização mitocondrial e a atividade de uma quinase do ciclo celular. Estes são métodos avançados, mas fáceis de seguir, que serão benéficos para muitos pesquisadores de biologia celular.

Localização sub-mitocondrial de CyclinB1 e Cdk1 extracção de carbonato de sódio é usado para determinar se uma proteína está localizada no interior da mitocôndria ou na superfície exterior, ou seja, da membrana externa. Uma vez que uma proteína é mostrada para localizar dentro da mitocôndria, nova determinação da localização sub-mitocondrial pode ser feita através de mitoplasting combinado com digestão com pro...

Aqui, descrevemos como estudar a localização mitocondrial de uma quinase (ciclo celular) e como determinar sua localização submitocondrial, bem como potenciais substratos/alvos mitocondriais. A expressão forçada de proteínas nas mitocôndrias fornece uma ferramenta útil para estudar as consequências funcionais da localização mitocondrial de uma proteína de interesse.

Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é determinar a localização submitocondrial de uma quinase normalmente nuclear envolvida no ciclo celular e, em seguida, analisar como sua localização mitocondrial afeta a progressão do ciclo celular. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da pesquisa mitocondrial, como a forma pela qual o núcleo se comunica com as mitocôndrias durante o ciclo celular. Ao marcar proteínas com uma sequência direcionadora mitocondrial, podemos aproveitar a superexpressão específica da proteína nas mitocôndrias, permitindo estudar suas funções específicas nesse compartimento.Embora este método possa fornecer informações sobre o direcionamento mitocondrial de certas proteínas, ele também pode ser aplicado a outros organelos, como o núcleo, retículo endoplasmático, complexo de Golgi e lisossomo. Após o cultivo, homogeneização e centrifugação das células de acordo com o protocolo descrito, transfira o sobrenadante para um novo tubo. Em seguida, centrifugue a amostra a 7.000 g e 4 graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, utilize 200 microlitros de tampão IBC gelado para ressuspender o pellet e divida o homogenato em duas alíquotas. Centrifugue

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

FRET baseado jornalistas estão cada vez mais utilizados para monitorar atividades quinase e fosfatase em células vivas. Aqui nós descrevemos um método de como usar FRET baseado jornalistas para avaliar o ciclo de dependentes de células alterações na fosforilação alvo.

Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

Metáfase para anáfase transição é disparada através anáfase-promover complexo (APC / C) dependente de ubiquitinação e subsequente destruição da ciclina B. Aqui, nós estabelecemos um sistema que, na sequência de pulso-caça, rotulagem permite monitorar proteólise ciclina B em populações de células inteiras e facilita a detecção de interferência do checkpoint mitótico.

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

A análise da relação estrutura-função mitocondrial é necessária para uma compreensão completa dos mecanismos regulatórios da funcionalidade mitocondrial. Métodos específicos para estudar a estrutura e função mitocondrial em ovários vivos e fixos de Drosophila são descritos e demonstrados neste artigo.

Estudar mitocondrial estrutura e função em Drosophila ovários

Este protocolo descreve uma estratégia optogenética para modular a atividade da proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK) durante a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário de Xenopus . Este método permite a ativação reversível da via de sinalização MAPK na cultura de células de mamíferos e em organismos vivos multicelulares, como embriões Xenopus , com alta resolução espacial e temporal.

Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e<em&gt; Xenopus</em&gt; Desenvolvimento embrionário

Apresentamos um protocolo para sincronização de timidina duplo de células HeLa, seguido de análise utilizando microscopia confocal de alta resolução. Esse método é a chave para a obtenção de grande número de células que proseguem sincronicamente de fase S de mitose, permitindo estudos sobre funções mitóticas das proteínas multifunctional que também possuem funções de interfase.

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é ativada na fase G2 do ciclo celular e regula muitos caminhos celulares. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio da quinase em vitro Cdk1, que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1-específicos para o estabelecimento de alvos celulares deste importante quinase.

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic. Nossa aplicação da imagem latente do lapso de tempo permite que o usuário identifique pilhas em vários estágios do mitosis, controle e identifique defeitos mitotic, e analise a dinâmica do eixo e o Fate mitotic da pilha em cima da exposição às drogas antimitotic.

Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo

O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.

Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

Cibridos transmissocondriais são células híbridas obtidas pela fusão de DNA mitocondrial (mtDNA) células esgotadas (células rho0 ) com citoplastas (células enucleadas) derivadas de pacientes afetados por distúrbios mitocondriais. Permitem a determinação da origem nuclear ou mitocondrial da doença, avaliação da atividade bioquímica e confirmação do papel patogênico das variantes relacionadas ao MTDNA.

Uma abordagem in vitro para estudar disfunção mitocondrial: um modelo cibrid

Este protocolo fornece uma abordagem padronizada para imagens da morfologia mitocondrial em múltiplos tecidos de C. elegans durante o envelhecimento.

Imagem e Quantificação da Morfologia Mitocondrial em C. elegans Durante o Envelhecimento

Este artigo descreve o uso de microscopia confocal e ImageJ para avaliar a dinâmica de fissão/fusão mitocondrial via fluorescência de fotocomutação Dendra2.

Avaliação da Dinâmica de Fissão/Fusão Mitocondrial em Células Tubulares Proximais Renais

Aprenda a determinar a localização sub-mitocondrial da quinase Cdk1 e analisar como essa localização afeta a progressão do ciclo celular. Este método utiliza marcação proteica e centrifugação para isolar frações mitocondriais.

Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1

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