Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1

O objetivo geral do procedimento a seguir é determinar a localização subsubcondrial de uma quinase do ciclo celular normalmente nuclear e, em seguida, analisar como sua localização mitocondrial afeta a progressão do ciclo celular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa mitocondrial, como como o núcleo se comunica com as mitocôndrias durante o ciclo celular. Ao marcar proteínas com uma sequência principal de mitocôndrias, podemos tirar proveito de expressões específicas de proteínas nas mitocôndrias, para que possamos estudar suas funções específicas das mitocôndrias.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o direcionamento de certas proteínas pelas mitocôndrias, ele também pode ser aplicado a outras organelas, como o núcleo, ER, golgi e um lisossomo. Após a cultura, homogeneização e peletização das células de acordo com o protocolo de texto, transferir o sobrenadante para um novo tubo. Centrifugue a amostra a 7.000 g e 4 graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, use 200 microlitros de tampão IBC gelado para ressuspender o pellet e divida o homogeneizado em duas alíquotas. Centrifugar novamente as amostras a 7 000 g e 4 graus Celsius durante 10 minutos. E repita a lavagem.

Depois de descartar o sobrenadante, adicione 30 microlitros de tampão de lise celular a um dos pellets e armazene o lisado a 80 graus Celsius para immunoblotting. Para realizar a extração de carbonato de sódio com o segundo pellet para separar proteínas solúveis e ligadas à membrana, adicione 250 microlitros de carbonato de sódio 0,1 molar pH 11,0 e incube no gelo por 30 minutos. Centrifugar a 100 000 g durante 20 minutos.

Em seguida, colete o sobrenadante e adicione um volume igual de ácido tricloroacético a 20% recém-feito para precipitar as proteínas. Mantenha no gelo por 30 minutos. Enquanto isso, adicione 30 microlitros de tampão de lise celular ao pellet e sonicate de acordo com o protocolo de texto antes de armazenar a 80 graus Celsius para immunoblotting.

Após 30 minutos de incubação do TCA, centrifugar a reacção a 15 000 g durante 10 minutos. Descarte o sobrenadante e use 80 microlitros de tampão de lise celular para ressuspender o pellet. Depois de isolar as frações mitocondriais das células, conforme descrito no protocolo de texto, separar as frações mitocondriais em 10 porções iguais.

Granular as amostras a 7 000 g e 4 graus Celsius durante 10 minutos. Use 30 microlitros de uma faixa de concentrações de tampões de sacarose hipotônicos com ou sem tripsina, para dissolver cada pellet. E incube no gelo por 30 minutos.

Adicione 3 microlitros de PMSF 10 milimolares aos frascos contendo tripsina para interromper a digestão da tripsina. E incube no gelo por 10 minutos. Centrifugar as amostras a 14 000 g e 4 graus Celsius durante 10 minutos.

E transfira o sobrenadante para um novo tubo. Para lisar o pellet, adicione 30 microlitros de tampão de lise celular. Sonicar as amostras conforme descrito no protocolo de texto e armazená-las a 80 graus Celsius.

Para construir vetores ciclinaB-1 Cdk-1 direcionados a mitocôndrias GFP / RFP, clone a sequência de direcionamento de mitocôndrias a partir do precursor da subunidade 8A da citocromo-c oxidase humana e enquadre com o terminal n de GFP ou RFP nos locais Nhe1 e bAmH1, de pEGFP-N1 ou pERFP-N1, usando técnicas padrão de clonagem molecular. Usando os primers descritos no protocolo de texto, amplifice os genes Cdk1 e ciclinB1 seguindo técnicas padrão. Em seguida, use BamH1 para digerir os produtos de PCR.

Execute as reações em um gel de agarose a 1% antes de usar uma lâmina de barbear para cortar os fragmentos de DNA do tamanho correto. Em seguida, use um kit de extração de gel para purificar o DNA. Em seguida, digerir um micrograma de plasmídeos MTS-pEGFP-N1 e MTS-pERFP-N1 com 1 microlitro de BamH1 a 37 graus Celsius por 2 horas.

Em seguida, adicione 1 microlitro de fosfatase alcalina intestinal de bezerro e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Depois de executar os produtos de digestão em um gel de agarose a 1% e purificar o DNA conforme descrito, configure uma reação de ligação usando os reagentes listados no protocolo de texto. Em seguida, incube a reação a 4 graus Celsius durante a noite.

Transforme as células competentes de e. coli dH5-alfa com 10 microlitros da mistura de ligação. E cultive as bactérias em placas de ágar LB mais 10 miligramas por mililitro de canamicina a 37 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, use uma ponta de pipeta estéril para pegar uma colônia de um prato. E insira a ponta em um tubo contendo 5 mililitros de LB canamicina. Incubar a cultura durante a noite e na manhã seguinte, usar um mini kit de preparação de acordo com o protocolo de texto para isolar o plasmídeo.

Para tranfeccionar células MCF-10A de crescimento exponencial, use plasmídeos Cdk1 ou ciclinaB-1 para preparar o reagente de transfecção de plasmídeo na proporção de 1:2 em 100 microlitros de soro e meio livre de antibióticos. Transfectar as células e incubar a 37 graus Celsius por 48 horas. Manchar e visualizar as mitocôndrias de acordo com o protocolo de texto.

Para realizar a classificação celular, feche 2 vezes 10 para as 5ª células com os vetores desejados em uma placa de 6 poços usando uma proporção de 1:2 de DNA para reagente de transfecção preparado em 2,5 mililitros de soro e meio livre de antibióticos. Depois de incubar a transfecção por 48 horas, use citometria de fluxo para classificar ao vivo as células que expressam de forma estável as proteínas Cdk-1 marcadas com GFP e clyclinB1 marcadas com RFP de acordo com o protocolo de texto. Para medir a duração do ciclo celular usando o ensaio de citometria de fluxo de marcação EdU, as células classificadas em placas de 6 poços a uma densidade de 2,5 vezes 10 elevado a 5 células por poço.

Após uma incubação durante a noite, adicionar EdU ao meio de cultura a uma concentração final de 25 micromolares e incubar durante mais uma hora. Em seguida, em intervalos de duas horas, use 1% BSA em 500 microlitros de PBS para lavar um poço de células. E colete em um tubo de 1,5 mililitro.

Centrifugue as células a 350 g durante 5 minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante. Desaloje o pellet adicionando 100 microlitros de solução de fixação.

Misture bem e incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, use 1 mililitro de 1% BSA em PBS para lavar as células três vezes. Em seguida, use 0,5 mililitros de etanol a 70% para fixar as células a 4 graus Celsius durante a noite.

Ao realizar a marcação EdU com células transfectadas com proteínas marcadas com GFP e RFP, é fundamental extinguir os sinais fluorescentes de GFP e RFP. Para conseguir isso, adicionamos uma etapa extra de fixação de células durante a noite usando 70% de etanol. No dia seguinte, após lavar e permeabilizar as células de acordo com o protocolo de texto, adicione 0,5 mililitros de coquetel de reação em cada tubo e misture bem.

Após a incubação no escuro e outra lavagem, use 50 microgramas por mililitro de iodeto de propídio ou PI em 1% BSA PBS para corar o DNA. Analise as células por citometria de fluxo para acompanhar a população EdU-positiva. Apresente um gráfico de pontos dispersos de células marcadas com EdU coradas para conteúdo de DNA e EdU.

Use o canal APC para Alexa 647 EdU utilizando um filtro passa-banda 670 30 com toda a luz presente, menos de 685 nanômetros atingindo esse filtro e o canal de ficoeritrina para PI com um filtro passa-banda 581 15 na frente dele, com toda a luz presente a menos de 600 nanômetros atingindo esse filtro. Com uma estratégia de gating padrão para aquisição, plote a área FSC por área SSC para morfologia, seguida por PI por Alexa 647 EdU para coloração celular. Registre dados para todos os tubos, um por um, adquirindo 10.000 eventos por amostra.

Nesta figura, a proteína da matriz mitocondrial Hsp60 e a proteína do espaço intermembranar Timm13 foram usadas como marcadores de localização submitocondrial. Semelhante com Hsp60, mas ao contrário de Timm13, ciclinaB1 e Cdk1 foram protegidos da digestão de tripsina, indicando que eles se localizam na matriz mitocondrial. Como mostrado aqui, por Western blotting das frações mitocondriais isoladas, usando as construções ciclinaB1 e Cdk-1 marcadas com MTS e GFP, a superexpressão de ciclina B1 e / ou Cdk-1 foi alcançada nas mitocôndrias.

Usando um ensaio de perseguição de pulso EdU, foi demonstrado que as células da fase S marcadas progrediram através da fase G2M e apareceram na fase G1 em até 4 horas em células que expressam ciclina mitocondrial do tipo selvagem B1 Cdk-1. Em comparação com 6 horas, em células transfectadas com um controle vetorial ou ciclina mutante B1 Cdk-1, indicando que o aumento da ciclina mitocondrial B1 Cdk-1 acelera a progressão do ciclo celular. Após este procedimento, outros métodos, como geração de ATP mitocondrial, consumo de oxigênio, potencial de membrana e espécies reativas de oxigênio, podem ser medidos para responder a perguntas adicionais, como como a localização mitocondrial da quinase do ciclo celular Cdk-1 altera a respiração mitocondrial e a produção de energia.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar a localização mitocondrial e as funções específicas das mitocôndrias de uma quinase nuclear.