Preparando a desenvolver tecido olfativo periférico para Molecular e análise imuno-histoquímica em Drosophila

O objetivo geral de estadiar e dissecar tecidos olfativos periféricos da pupila e do adulto em desenvolvimento em espécies de Drosophila é gerar amostras para análises moleculares e de desenvolvimento dos tecidos olfatórios periféricos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento e evolução do sistema olfativo, como a expressão, dinâmica, níveis e padrões de genes específicos nos tecidos olfatórios periféricos em desenvolvimento. Através deste método, podemos obter insights sobre o desenvolvimento do sistema olfativo periférico em espécies de Drosophila.

Também pode ser aplicado a outros sistemas sensoriais, como o paladar periférico e os sistemas visuais. Para um experimento de sequenciamento de RNA, planeje coletar entre 100 a 200 discos antenais ou antenas para quatro estágios diferentes de desenvolvimento. Para imuno-histoquímica, planeje dissecar 10 a 20 moscas.

Limpe todos os materiais envolvidos na dissecação usando etanol 70%. Em seguida, limpe ainda mais os materiais com neutralizadores de RNase. E faça todas as soluções usando água sem nuclease ou tratada com DEPC.

Para coletar pupas, monitore as larvas em intervalos de 30 minutos. E colete pupa no estágio pré-pupal APF de zero hora. As larvas ficarão imóveis e cercadas por uma caixa de pupa muito clara, quase branca.

Nesta fase, transfira as larvas para uma pequena placa de Petri de duas polegadas com um papel de filtro úmido. Para dissecções do estágio APF de zero hora, prossiga imediatamente para a coleta do disco antenal pré-pupal. Caso contrário, cubra o prato com filme de parafina e deixe os animais se desenvolverem a 25 graus Celsius, até que estejam no estágio de desenvolvimento de interesse.

Para encenar o desenvolvimento pupal de outras espécies de Drosophila, colete larvas pré-pupais de zero hora e separe-as em um frasco fresco. Em seguida, registre o número de dias desde a pré-pupa até a idade adulta. E simplesmente dimensione esse tempo para a linha do tempo para melanogaster.

Para começar, resfrie 150 microlitros de solução de isolamento de RNA em um tubo de 1,5 milímetro sem RNase. Em seguida, deposite várias gotículas separadas de PBS na almofada de dissecação. Em cada gota de PBS, coloque uma pupa para ser dissecada.

Para as pupas de zero a duas horas, use uma pinça para segurar os ganchos da boca e puxe essas estruturas para arrancar e expor os cérebros e os discos imaginários. Para as pupas de oito horas, primeiro retire suavemente a caixa da pupa do quarto mais anterior da pupa, para expor a cabeça em desenvolvimento. Em seguida, retire a cabeça na articulação do pescoço.

Os discos antenais estão na cabeça neste estágio de desenvolvimento. Agora transfira os tecidos contendo os discos antenais para outra gota de PBS. Em seguida, identifique o disco antenal do olho conectado ao cérebro nos lobos ópticos.

Usando uma pinça, desconecte o disco antenal do olho e transfira-o para uma nova gota. Em pupas de oito horas, os discos oculares cobrem os discos antenais e ambos são anteriores ao cérebro. Na próxima gota, divida o olho e os discos antenais usando uma pinça.

Em seguida, usando uma ponta de pipeta P20, colete suavemente o tecido dissecado com uma quantidade mínima de líquido. Depositar o disco no reagente da solução de isolamento de ARN e continuar a dissecar os discos antenais até que pelo menos 100 sejam recolhidos. 40 horas após a formação da pupa, a antena adulta assumiu sua forma final, mas ainda é transparente.

Pelo menos 50 pré-pupas nesta fase são necessárias para a coleta de sequências de RNA. Primeiro prepare 150 microlitros de solução de isolamento de RNA resfriada. Na almofada de dissecação, coloque uma pupa em uma gota de PBS.

Em seguida, estabilize o corpo com um par de pinças e retire suavemente a caixa de pupa do quarto mais anterior para expor a cabeça. Em seguida, remova cuidadosamente a cabeça na articulação do pescoço. Agora transfira suavemente a cabeça para uma gota limpa de PBS.

Para remover a membrana que envolve a cabeça, pipete a cabeça para cima e para baixo no PBS. Com esta limpeza, a antena deve ficar visível. Agora desconecte a antena da membrana entre o segundo e o terceiro segmentos na articulação segmentar.

O terceiro segmento contém os receptores olfativos antenais. Em seguida, use uma pipeta para transferir suavemente o tecido dissecado para a solução de isolamento de RNA, minimizando a quantidade de líquido transferido. Para extração de RNA, disseque os adultos enquanto eles estão anestesiados em uma almofada de CO2.

Primeiro, trate a almofada de CO2 e a pinça com inibidores de RNase. Em seguida, anestesiar os adultos e visualizar a almofada sob um microscópio de dissecação. Usando dois pares de pinças, estabilize o corpo e puxe ou belisque suavemente o terceiro segmento antenal do segundo segmento antenal para coletar os tecidos.

Transfira as antenas para um tubo de solução de isolamento de RNA mergulhando a pinça no líquido e soltando. A antena deve estar submersa. Se a antena ficar presa na parede lateral, o RNA se degradará prematuramente.

Depois de coletar antenas suficientes, prossiga com a extração do RNA. Ou armazene o tubo de coleta a 80 graus Celsius indefinidamente. Se a antena for destinada à imuno-histoquímica, faça esta dissecção em uma plataforma de dissecção com a mosca submersa em PBS com ou sem Tritão.

O tecido olfatório em desenvolvimento dissecado pode ser usado para extração de RNA seguida de RT-PCR para avaliar a expressão gênica. Por exemplo, a expressão de transcritos de receptores de superfície e transcritos de receptores olfativos pode ser estudada dessa maneira. Alternativamente, os tecidos podem ser usados para imuno-histoquímica para determinar o padrão de expressão e a localização subcelular de genes de interesse.

Por exemplo, as moscas transgênicas Rn-EGFP podem ser coradas com anticorpos anti-GFP e anti-Laminina. A análise mostra que 40 horas após a formação da pupa, o gene Or67d está ativo em células específicas na antena, impulsionando a expressão de GFP sob o sistema GAL4-UAS. Uma vez dominadas, as dissecções podem ser feitas em uma hora se forem realizadas corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter o tempo e a colheita, envelhecimento e dissecação adequadamente programados, com base no período de desenvolvimento da pupa para cada espécie de Drosophila. Após este procedimento, outros métodos como qRT-PCR, imuno-histoquímica, bem como outras técnicas de coloração in vivo e perfil transcricional podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre padrões e perfis de transcrição no nível de sistemas dentro de um tecido em desenvolvimento. Após seu desenvolvimento, essa técnica abrirá caminho para pesquisadores no campo da evolução e desenvolvimento de sistemas sensoriais explorarem a dinâmica transcricional e a descoberta de novos genes em outros sistemas sensoriais em espécies de Drosophila.

Não se esqueça de que trabalhar com pinças afiadas, algumas soluções de extração de RNA e formaldeído pode ser extremamente perigoso. Precauções como prática prévia com dissecções, para desenvolver habilidades motoras finas, alta atenção e uso de roupas de laboratório apropriadas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.