Uma abordagem de mutagénese romance saturação: Caracterização de única etapa de proteína reguladora vinculação Sites no RNA usando fosforotioatos

O objetivo geral desta abordagem de fosforotioato em RNA é realizar a mutagênese de saturação em uma única etapa. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia molecular, como a regulação gênica. O principal benefício desta técnica é que em uma única etapa pode-se realizar a mutagênese de saturação de um sítio de ligação a proteínas no RNA.

Um passo fundamental neste protocolo de mutagênese de saturação de etapa única é dopar o molde de DNA com nucleotídeos do tipo não selvagem dentro do local de ligação à proteína. Primeiro sintetize um primer T7 por síntese química em um sintetizador de DNA. Em seguida, sintetizar um oligonucleotídeo dopado correspondente ao local de ligação à proteína.

Neste exemplo, a sequência sublinhada contém o complemento reverso do local de ligação à proteína letal para o sexo das drosófilas, com cada local de dopagem representado por um X. Use uma proporção de 90% de nucleotídeo do tipo selvagem para 10% de nucleotídeo do tipo não selvagem para cada local de dopagem. A sequência em verde é complementar à sequência do primer T7 e é o promotor T7 para transcrição in vitro. O próximo passo neste protocolo é a síntese de RNAs separados com cada nucleotídeo fosforotioato, seguido pela radiomarcação 5-prime-end do RNA.

Sintetize RNAs para cada fosforotioato em uma reação de transcrição de 20 microlitros. Para cada tubo de microcentrífuga, adicione o seguinte: tampão de transcrição T7, um oligonucleotídeo T7 micromolar, um oligonucleotídeo dopado micromolar, 10 DTT milimolar, dois GTP milimolar, um milimolar de ATP, CTP e UTP e duas unidades por microlitro de RNA polimerase T7. Adicione 0,167 milimolar de alfa-tio ATP a um tubo e 0,05 milimolar de alfa-tio UTP ao outro tubo.

Incube as misturas de reação de síntese de RNA a 37 graus Celsius por duas horas. Após duas horas, adicione 2,5 microlitros de alfa fosfatase termolábil e 2,5 microlitros de tampão fosfatase 10X a cada amostra de RNA. Incube a 37 graus Celsius por 10 a 30 minutos para remover os fosfatos 5-prime.

Inative a enzima fosfatase alcalina aquecendo a 80 graus Celsius por dois a cinco minutos. As etapas restantes envolvem o uso de radioatividade e devem ser realizadas usando as devidas precauções e um escudo de acrílico para proteger da radioatividade. Para radiomarcar a extremidade 5-prime do RNA desfosforilado, use um microlitro de polinucleotídeo quinase T4 e um microlitro de Gamma P32 ATP em um volume de reação de 10 microlitros.

Incube as misturas de reação a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Inative a enzima polinucleotídeo quinase T4 aquecendo a 65 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Execute as reações em um gel de poliacrilamida 10% desnaturante.

Localize o RNA no gel por autorradiografia e excise a fatia de gel contendo RNA radiomarcado. Esmague a fatia de gel em um tubo de microcentrífuga pressionando-a contra o lado com uma ponta de pipeta e, em seguida, adicione o tampão de proteinase K. Gire os tubos em temperatura ambiente de duas horas para durante a noite.

Em seguida, centrifugue a pasta de gel, colete a solução tampão e descarte o gel. Extrair cada solução duas vezes com um volume igual de clorofórmio fenol. Depois disso, extraia a solução uma vez com clorofórmio.

Colete a fase aquosa e adicione a ela 0,1 volume de acetato de sódio trimolar pH 5,2, tRNA transportador ou glicogênio e 2,5 volumes de etanol. Mantenha as amostras a menos 80 graus Celsius por uma hora. Centrifugue as amostras em uma microcentrífuga de alta velocidade a 16.873 vezes g por cinco a 10 minutos.

Remova a solução tampão de etanol com cuidado sem perturbar o pellet de RNA. Lave os pellets com etanol 70% e centrifugue por dois a cinco minutos. Remova o etanol com cuidado e seque os pellets ao ar.

Ressuspenda cada pellet em 20 a 50 microlitros de água tratada com DEPC. Armazene a menos 20 graus Celsius até o uso. O conceito de particionamento devido a interferência é ilustrado aqui.

Durante o processo de ligação às proteínas, as moléculas de RNA se dividem entre a fração ligada à proteína e a fração não ligada. Se um nucleotídeo específico em uma determinada posição interferir na ligação à proteína, ele será preferencialmente excluído da fração ligada à proteína. Posteriormente, o iodo é usado para clivar os RNAs nos locais de incorporação do fosforotioato.

Para iniciar esses procedimentos, configure as reações de ligação proteína-RNA com cada reação contendo 10 Tris-HCl milimolar, um DTT milimolar, 50 cloreto de potássio milimolar, 0,5 unidades por microlitro de inibidor de RNase, 0,09 microgramas por microlitro de albumina de soro bovino acetilada, um EDTA milimolar, 0,15 microgramas por microlitro de tRNA, RNA radiomarcado de 5 extremidades primárias e seis microlitros de uma concentração apropriada da proteína. Incube as reações de ligação às proteínas a 25 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Separe a fração de RNA ligada à proteína da fração não ligada por ligação de filtro de nitrocelulose.

Aplique a reação de ligação em um filtro de nitrocelulose conectado a um coletor de vácuo à temperatura ambiente. Apenas o complexo de proteínas de RNA será retido no filtro enquanto o RNA não ligado flui através do filtro. Corte a parte do filtro de nitrocelulose que contém o RNA radioativo retido em pedaços menores para caber em um tubo de microcentrífuga e adicione tampão de proteinase K suficiente para imergir os pedaços do filtro.

Eluir o RNA das peças filtrantes por duas a três horas ou durante a noite. Em seguida, transfira a solução de cada tubo para um novo tubo e extraia com fenol, clorofórmio e clorofórmio, conforme demonstrado anteriormente. Recolha a fase aquosa e adicione-lhe 0,1 volume de acetato de sódio trimolar pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol e incube no congelador.

Depois de centrifugar, lavar e secar o RNA conforme mostrado anteriormente, ressuspenda o RNA em água tratada com DEPC. Todas as etapas que envolvem iodo devem ser executadas em um exaustor. Para clivar RNAs nos locais de incorporação de fosforotioato, adicione a cada amostra de RNA um iodo milimolar em 20 microlitros de água tratada com DEPC contendo até 10 microgramas de tRNA transportador.

Incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Precipitar o RNA clivado adicionando acetato de sódio e etanol, conforme mostrado anteriormente. Ressuspenda o RNA clivado em um corante de carregamento para géis desnaturantes.

Após o aquecimento, carregue as amostras em um gel de poliacrilamida 15-20% desnaturante e separe os fragmentos de RNA por eletroforese. Exponha o gel de poliacrilamida a um filme de raios-X e detecte bandas na fração ligada versus pool total usando autorradiografia. Este esquema ilustra o conceito de particionamento devido à interferência.

Na pista T, a fração total de RNA, a intensidade da banda é aproximadamente igual para todas as posições dopadas. Na fração de RNA ligada à proteína, nas posições 1, 4 e 7, o nucleotídeo não tem efeito sobre a ligação. No entanto, nas posições 3 e 6, interfere na ligação e é excluído da fração ligada.

Na posição 5, a interferência é parcial. As comparações de pistas emparelhadas para cada nucleotídeo permitem a análise de todos os quatro nucleotídeos. Esta autorradiografia mostra dois pares de pistas de um gel desnaturante.

A pista T é o RNA total e a pista B é o RNA ligado à proteína. A linha vertical marca o local de ligação sexual-letal. Para o par alfa-tioalina, as bandas 1, 2, 3 e 5 estão presentes na fração total de RNA, mas ausentes ou significativamente reduzidas na fração de RNA ligada.

Para o par alfa-tio-ulino, as bandas 7 e 8 são relativamente menos intensas na fração ligada. Os resíduos que são preferencialmente excluídos da fração ligada são importantes para a ligação às proteínas. Uma vez sintetizado o RNA e marcado com 5 prime-ends, essa técnica pode ser feita em 12 horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o nível apropriado de incorporação de fosforotioato e a determinação da concentração de proteína apropriada para ligação são considerações importantes. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios funcionais apropriados ou testes in vivo, podem ser feitos para validar o resultado da abordagem de mutagênese e entender a relevância biológica. Essa técnica fornece uma alternativa a outros métodos que são mais caros ou mais trabalhosos ou ambos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar e sintetizar a biblioteca de mutantes, realizar reações de ligação, identificar nucleotídeos mutantes em cada pool e analisar quantitativamente o efeito de nucleotídeos de tipo não selvagem em cada posição testada. Não se esqueça de que trabalhar com poliacrilamida e radioatividade pode ser perigoso e precauções como o uso de luvas, exaustão adequada e escudos radioativos devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.