Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish

Este método pode ajudar a entender questões importantes no campo das células beta. Como a função heterogênea IT entre células beta individuais dentro de uma ilhota. A principal vantagem desta técnica é a resolução espacial e temporal fornecida pela imagem ao vivo das células beta.

Podemos capturar as oscilações de cálcio dentro de células beta individuais. Depois de sacrificar um peixe de acordo com o protocolo de texto, transfira-o para uma placa de Petrie contendo solução HBSS com cálcio e magnésio. Em seguida, sob um microscópio estéreo equipado com uma lâmpada de fluorescência e um cubo de filtro vermelho, use uma pinça afiada para cortar a pele da boca até a barbatana anal.

Retire a pele cortada do lado direito para expor o abdômen, o que exporá os órgãos internos. Em seguida, usando a fluorescência vermelha para identificar a expressão de mKO2 em células beta, localize as ilhotas. Limpe a ilhota primária removendo cuidadosamente o tecido circundante, como fígado e adipócitos.

Tome precauções para não ferir ou cutucar a ilhota. Em seguida, pipete uma gota de 30 microlitros de HBSS no centro de um prato com fundo de vidro. Em seguida, transfira a ilhota dissecada para a gota.

Com HBSS, lave cuidadosamente a ilhota uma vez e use 30 microlitros de solução de trabalho de fibrinogênio para lavá-la uma vez. Evite secar a ilhota durante as etapas de lavagem, o que pode resultar em morte celular. Adicione lenta e suavemente 10 microlitros de 10 unidades por mililitro de solução de trombina à ilhota.

Deixe a ilhota e o prato intocados por 15 a 20 minutos. Observe que a gota de trombina do fibrinogênio se tornará viscosa e estável. Tempo suficiente precisa ser dado para que a trombina polimerize na solução de fibrinogênio.

Caso contrário, o molde não fornecerá estabilidade durante a sessão de imagem. Para realizar imagens ao vivo ex vivo da fluorescência GCaMP, adicione 200 microlitros de HBSS em cima do molde e coloque cuidadosamente a placa no suporte da placa do microscópio confocal. Em seguida, com uma objetiva de erro 20X 0,8 NA e a opção de campo claro, localize a ilhota.

Usando o filtro para fluorescência vermelha para visualizar a fluorescência nuclear mKO2 em células beta focadas na ilhota. Os núcleos individuais devem ser claramente visíveis. Localize um plano de imagem claro movendo-se manualmente pela espessura da ilhota ao longo de seu eixo Z.

Certifique-se de que o plano de imagem contenha 50 a 100 células beta para imagens e que o brilho da fluorescência nuclear mKO2 seja uniforme, especialmente no centro da ilhota. Em seguida, no menu de configuração inteligente, configure uma aquisição sequencial para fluorescência GCaMP6 e mKO2 usando as configurações a seguir. Para GCaMP6, escolha uma excitação de 488 nanômetros e uma emissão aproximada de 500 a 555 nanômetros.

Em cor falsa, selecione GFP. Para mKO2, escolha uma excitação de 561 nanômetros e uma emissão de 570 a 630 nanômetros. Para a cor falsa, selecione mCherry.

No modo de aquisição, defina a resolução da imagem para 1.024 por 1.024 pixels, a velocidade para 10 e a média para um. Inicie uma gravação contínua selecionando a opção Série Temporal e definindo a duração para 500 ciclos com aproximadamente dois segundos de tempo de aquisição por quadro. Fique de olho no ciclo de imagem.

Após os primeiros 50 quadros sem perturbar a aquisição da imagem, pipetar suavemente cinco microlitros de solução de D-glicose 200 milimolares em cima do gel que segura a ilhota. Em seguida, adquira 150 quadros a 10 milimolares de glicose. Os primeiros 50 quadros da série temporal correspondem à atividade das células beta em cinco milimolares de glicose.

Esta é a atividade basal. Uma célula beta que responde mostrará aumento e diminuição da fluorescência verde com o tempo. Em 200 quadros, aumente a concentração de glicose para 20 milimolares adicionando suavemente 10 microlitros de D-glicose 200 milimolares.

Em seguida, adquira 150 quadros na concentração de 20 milimolares. Para abrir o arquivo de imagem em FIJI, selecione Plugin, LSM Toolbox, show LSM Toolbox. Na caixa de ferramentas do LSM, clique em Abrir LSM e selecione o arquivo de imagem.

Em Ferramentas, no menu Analisar, abra o Gerenciador de ROI. Com a ferramenta de seleção de polígonos localizada na barra de ferramentas, desenhe manualmente o ROI. Desenhe o ROI no canal vermelho para que cubra uma área maior que um núcleo para incluir parte do citoplasma da célula.

Certifique-se de que a posição do ROI seja consistente entre os quadros e ajuste a posição, se necessário. Adicione os ROIs selecionados ao ROI Manager clicando no botão Adicionar. Selecione e adicione vários ROIs para obter dados em várias células.

Em seguida, no menu Analisar, selecione Definir medidas. Em seguida, selecione Densidade integrada para especificar a extração da intensidade total de fluorescência dentro da área. Mude para o canal verde que contém a fluorescência GCaMP e, no ROI Manager, selecione Multi Measure.

Isso fornecerá as medições de intensidade para as células ao longo da série temporal. Salve a saída FIJI como um arquivo de texto separado por vírgulas. Na Caixa de Ferramentas do LSM, obtenha os carimbos de data/hora dos quadros de imagem.

Use Aplicar carimbos, Aplicar carimbos T, Nome do arquivo, Despejar no arquivo de texto para obter os carimbos de data/hora. Salve os carimbos de data/hora usando a opção Salvar como ou copie-os para a planilha. Ao compilar os valores de intensidade para todas as células, execute a análise uma célula de cada vez ou automaticamente.

Consulte o protocolo de texto para obter detalhes adicionais. Neste experimento, células beta de ilhotas primárias individuais de 45 linhagens transgênicas DPF expressando mKO2 nuclear e GCaMP6 especificamente em células beta, foram estimuladas com uma rampa de glicose e depois despolarizadas com cloreto de potássio. A atividade das células foi analisada.

Usando FIJI e software de análise de dados, a intensidade de fluorescência GCaMP6 de células beta individuais foi extraída e normalizada. Como visto a partir desse traço de intensidade de fluorescência, as células beta individuais exibem oscilações na fluorescência do GCaMP6 quando estimuladas com glicose, e a adição de cloreto de potássio estabiliza a fluorescência. A técnica fornece uma resolução celular da capacidade de resposta à glicose da célula beta e uma janela para sua funcionalidade.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em 45 minutos se feita corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante verificar a viabilidade das células beta. Após este procedimento, outros métodos, como manipulações genéticas, podem ser realizados para entender o papel de genes específicos na função das células beta.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a resposta à glicose dentro de células beta individuais.