Name: Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a analisar a função de células beta em ilhotas de zebrafish utilizando imagens de cálcio de célula única com GCaMP6s. Este método permite estudar a heterogeneidade funcional e a resposta à glicose em tempo real.

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Agradecemos a membros do laboratório Ninov para comentários sobre o manuscrito, membros do centro para instalações de peixe e microscopia de Dresden de terapias regenerativas (poucos) para obter assistência técnica. N.N. é suportado pelo financiamento da DFG-poucos, Cluster de excelência no TU-Dresden, Fundação de pesquisa alemã (DFG) e o centro alemão para Diabetes pesquisa (DZD).

Todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo acto de bem-estar Animal e com a permissão do Landesdirektion Sachsen, Alemanha (AZ 24 – 9168.11 / 1/2013 / 14, T12/2016).
1. preparação
Nota: Este protocolo é para ex vivo por imagens do zebrafish ilhéu primário de duplo Tg transgénicos (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); TG (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 zebrafish. Nesta linha de transgênicos, o promotor de insulina (ins) conduz a expressão específica de células beta de dois transgenes: nls-Renilla-mKO2, que marca o núcleo das células-beta com monomérico Kusabira laranja 2 (mKO2) fluorescência; e GCaMP6s15, que emite fluorescência verde em resposta ao aumento nos níveis de cálcio intracelular. A expressão de beta-pilha-específico de GCaMP6s permite estudar a glicose-capacidade de resposta das células-beta sem a interferência de alterações de cálcio em torno de tipos de células.
<ol><li>Preparar o estoque fresco fibrinogênio (10 mg/mL) dissolvendo-se 10 mg de fibrinogênio bovino em 1 mL de Ca2 +/ mg2 +-que contém a solução de sal balanceada de Hanks (HBSS) num tubo de centrífuga 1,5 mL. Vórtice vigorosamente até que o pó de fibrinogênio se dissolve completamente. Manter a solução em temperatura ambiente por mais pelo menos de 15 min. Nota: O estoque pode ser mantido em temperatura ambiente por 2 – 3 h.. descarte o estoque se a solução começa a polimerizar-se e torna-se viscoso.</li>
	<li>Prepare a solução de trabalho de fibrinogênio (3,3 mg/mL) diluindo o estoque de fibrinogênio HBSS em triplo. Por exemplo, misture 300 µ l de caldo de fibrinogênio em 600 µ l de HBSS preparar 900 µ l da solução de trabalho de fibrinogênio.</li>
	<li>Preparar a solução de trombina (10 U/mL) dissolvendo-se 10 unidades de trombina em 1 mL de HBSS ou fosfato tampão salino (PBS). Nota: Esta solução pode ser preparada com antecedência, aliquotada em 50 partes µ l e congelada a-20 ° C.</li>
	<li>Prepare 200 mM D-glucosa dissolvendo 1,8 g de D-glicose em 50 mL de água. Manter em 4 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Prepare 300 mM solução KCl dissolvendo-se 1,1 g de KCl em 50 mL de água. Manter em 4 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Adquirir 35mm pratos de vidro-fundo de diâmetro para a montagem dos ilhéus.</li>
	<li>Para dissecação e fixar o ilhéu, usar um microscópio estéreo equipado com lâmpada de fluorescência e cubo filtro vermelho (TRITC: excitação: 554 – 532 nm, emissão: 613 – 570 nm; ou Texas-vermelho: excitação: 540 – 580 nm, emissão: 592-667 nm).</li>
	<li>Para o influxo de cálcio em células-beta, uso um microscópio confocal invertido (Zeiss LSM 780 ou similar) com 20 X (0,8 NA) objetivo do ar e equipado com um suporte de placa para os pratos de vidro-fundo de diâmetro 35mm de imagem.</li>
	<li>Prepare uma solução de 200 mg/L de sulfonato de metano metanosulfonato (MS222) para eutanásia o zebrafish.</li>
	<li>Requisitar pratos de Petri de 90 mm para a dissecação do zebrafish.</li>
</ol>2. Zebrafish primária ilhéu dissecação e montagem
<ol><li>Eutanásia em um peixe usando incubação prolongada em MS222. Para isso, delicadamente Retire o peixe do aquário usando uma rede de pesca e incube-lo em uma placa de Petri contendo a solução MS222 até que o animal não mostra nenhum movimento de odontódios (brânquias); Normalmente, este leva 5 min. transferência o peixe para um prato de Petri contendo a solução HBSS com Ca2 +/ mg2 +.</li>
	<li>
Sob um microscópio estéreo equipado com uma lâmpada da fluorescência e cubo filtro vermelho, disse a pele que cobre o lado direito do abdômen do animal para isolar o pâncreas.
	<ol>
<li>Para isso, corte a pele do zebrafish da boca a nadadeira anal usando Pinças afiadas. Descascar a pele cortada para expor o abdome; Este recorte expõe os órgãos internos. Usando a fluorescência vermelha de mKO2 expressão em células-beta, verificar a localização dos ilhéus através de exame visual, sob o microscópio. Se necessário, remova os lóbulos do fígado, como eles poderiam cobrir o ilhéu, tornando difícil de encontrar. Nota: O Ilhéu primário está localizado perto da região anterior do abdômen, geralmente no lado direito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpe o ilhéu primário removendo cuidadosamente o tecido circundante como fígado e adipócitos. Tomar precauções para não ferir ou picar o ilhéu; Depois de limpar o tecido circundante, as células individuais na superfície do Ilhéu tornam-se perceptíveis.</li>
	<li>Pipete uma gota de 30 µ l de HBSS no centro de um prato fundo de vidro. Transferi o ilhéu dissecado para essa queda.</li>
	<li>Lave cuidadosamente o ilhéu, uma vez com HBSS e uma vez com 30 µ l da solução de trabalho de fibrinogênio (3,3 mg/mL). Certifique-se de evitar a secagem do Ilhéu durante as etapas de lavagem, pois se assim resulta na morte celular.</li>
	<li>Lenta e suavemente, adicione 10 µ l da solução de trombina (10 U/mL). O ilhéu e o prato deixe intocado por 15 – 20 min, observar que a gota de fibrinogênio-trombina se torne viscoso e ligeiramente opaco neste momento.</li>
</ol>3. Ex Vivo ao vivo-imagem latente da intensidade de fluorescência GCaMP em ilhotas de Zebrafish primária
<ol><li>Adicionar 200 µ l de HBSS em cima do molde e coloque o prato com cuidado sobre o suporte da placa do microscópio confocal. Use um objectivo de ar X, at 0.8, 20 para a imagem latente confocal. Localize o ilhéu usando a opção brightfield.</li>
	<li>Usando o filtro para fluorescência vermelha para visualizar a fluorescência nuclear mKO2 em células-beta, o foco na ilhota. Núcleos individuais devem ser claramente visíveis.</li>
	<li>Localize um avião claro imagem alterando manualmente o plano focal do microscópio confocal a fim de mover-se através da espessura da ilhota ao longo de seu eixo z. Certifique-se de que o avião de imagem contém um número suficiente (50-100) de células-beta para a imagem latente, e o brilho da fluorescência nuclear mKO2 é uniforme, especialmente no centro da ilha.</li>
	<li>Configurar uma aquisição sequencial para GCaMP6s e mKO2 de fluorescência usando as seguintes configurações no "Menu Setup inteligente": GCaMP6s, excitação: 488 nm, emissão: 500 – 555 nm, falsa-cor: verde (selecione "GFP"); mKO2, excitação: 561 nm (mCherry), de emissão: 570 – 630 nm, falsa-cor: vermelho (selecione "mCherry"). Nota: Com esta configuração, o canal vermelho irá gravar a posição dos núcleos de células beta, enquanto o canal verde irá gravar a intensidade de fluorescência de GCaMP.</li>
	<li>No modo de"aquisição" definir a resolução da imagem a 1.024 x 1.024 pixels, a velocidade em 10 e em média em 1. Iniciar uma contínua gravação selecionando a opção para "Séries temporais", e definindo a "duração" para 500 ciclos, com tempo de aquisição de s aproximadamente 2 por quadro. Nota: Os primeiros 50 quadros do tempo-série correspondem a atividade das células-beta na concentração de glicose de 5 mM. Esta é a resposta de linha de base. Uma resposta beta-célula mostrará depilação e diminuindo a intensidade de fluorescência verde com o tempo. Temos observado que alguns (1 – 5%) das células-beta oscilar em glicose de 5 mM.</li>
	<li>
Fique de olho no ciclo de imagem. Após os primeiros 50 quadros, aumente a concentração de glicose da solução circundante de 10 mM sem parar a gravação.
	<ol>
<li>Sem distorçer a aquisição de imagens, gentilmente Pipete 5 µ l da solução de D-glicose em cima do gel segurando o ilhéu de 200 mM. Adquira 150 quadros na glicose 10 mM. Nota: O aumento da concentração de glicose aumentará o número de células-beta passando por GCaMP fluorescentes oscilações no canal verde.</li>
		<li>Certifique-se de que os núcleos das células permanecem estáveis durante o processo. Se o Ilhéu está tremendo extensivamente durante a aquisição e os núcleos estão se movendo fora do plano focal, descarte a amostra (se necessário).</li>
		<li>Espere um período suficiente para permitir a polimerização do molde de fibrinogênio-trombina para garantir a estabilidade das amostras subsequentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A 200 quadros, aumente ainda mais a concentração da solução de 20mm suavemente pipetando 10 µ l de 200 milímetros solução de D-glicose. Adquira 150 quadros para a concentração de 20 mM.</li>
	<li>Após 350 quadros, despolarizar o ilhéu com 30 mM de KCl. Para isso, adicione 20 µ l da 300 mM solução KCl. Nesta fase, observe que as oscilações de fluorescência GCaMP6s irão parar e consertar em uma alta intensidade; células-beta que não respondeu a glicose também podem exibir um aumento na intensidade de fluorescência verde sobre adição de KCL.</li>
</ol>4. quantificação do traço de fluorescência GCaMP Beta-células individuais
Nota: Para localizar e quantificar as respostas das células-beta individuais para diferentes níveis de glicose, quantificar a intensidade de fluorescência GCaMP durante todo o período de imagem. Quantificação é realizada no celular resolução. Para isso, use FIJI20 para extrair os valores de intensidade de fluorescência GCaMP das imagens (etapas 4.1 – 4.6) e software de planilha ou R21 para realizar a análise (etapas 4.8 – 4,9).
<ol><li>Abra o arquivo de imagem em FIJI, usando a caixa de ferramentas"LSM". Para isso, selecione "Plugin | Caixa de ferramentas LSM | Mostre a caixa de ferramentas LSM". No "Toolbox LSM", clique em "Open LSM" e selecione o arquivo de imagem. Nota: Para formatos não suportados pelo LSM "Toolbox", convertê-los primeiro para tiff para análise.</li>
	<li>Extrair as respostas das células usando a ferramenta de região de interesse (ROI) em FIJI. Abra o "Gerenciador de ROI" no menu "Analisar" em "Ferramentas". Desenhe manualmente o ROI usando a ferramenta de seleção"polígono" localizada na barra de ferramentas.</li>
	<li>Desenhe o ROI no canal vermelho em que os núcleos de células beta são visíveis. Selecione o ROI tal que cobre uma área que é maior do que o núcleo da célula, a fim de incluir alguns do citoplasma da célula. Certifique-se de que a posição de ROI é consistente entre quadros e ajustar a posição, se necessário.</li>
	<li>Adicione o ROIs selecionado para o "Gerenciador de ROI", clicando no botão "Adicionar [t]". Selecionar e adicionar ROIs múltiplos para o ROI para a obtenção de dados em várias células.</li>
	<li>Em seguida, no menu "Analisar", selecione "Definir medidas". Selecione "Densidade integrada" para especificar a extração da intensidade de fluorescência total dentro da área.</li>
	<li>Mudar para o canal verde, contendo a fluorescência GCaMP e selecione "Multi medida" no "Gerenciador de ROI". Nota: Isto irá fornecer as medições de intensidade para as células em toda a série de tempo.</li>
	<li>No caso da posição de ROI precisa ser ajustada devido ao movimento de ilhota, compile manualmente as medições de intensidade em diferentes quadros. Copiar e colar os valores para uma planilha separada.</li>
	<li>Obter os carimbos de hora dos quadros da imagem da caixa de ferramentas"LSM". Uso "aplicar selos | Aplicar selos t | Nome do arquivo | Despejar a textfile"para obter os carimbos de hora. Salvar os carimbos de hora usando a opção "Salvar como", ou copiá-los para a planilha.</li>
	<li>Após compilar os valores de intensidade para todas as células, realize a análise uma célula de cada vez ou automaticamente (por exemplo, usando fórmulas do Excel ou R).</li>
	<li>
Analise as células individuais em duas etapas.
	<ol>
<li>Na primeira etapa, calcule a intensidade de fluorescência acima da linha de base. Para este fim, calcule a intensidade fluorescente de base (F0) como a média das intensidades de fluorescência para os primeiros 50 quadros (glicose de 5 mM). Subtrair a linha de base (F0) toda a série de tempo (F – F0). Nota: algumas células podem mostrar clara GCaMP oscilações sob glicose basal, que normalmente continuam após estimulação com concentrações mais elevadas. Para tais células, somente é possível estimar F0 , tendo a intensidade média dos quadros iniciais no qual as células mostraram uma gota em fluorescência.</li>
		<li>Na segunda etapa da análise, obter a intensidade de fluorescência GCaMP final normalizando a intensidade de fluorescência. Nota: Esta é realizada para remover as diferenças entre ilhotas de animais diferentes. Ilhéus individuais exibem diferentes níveis de emissão de fluorescência após estimulação de glicose.</li>
		<li>Normalize a intensidade da fluorescência, dividindo-o com o valor mais alto de intensidade. Para isso, calcular a intensidade de pico (Fmáx – F0) e dividir os valores basais subtraído pelo pico de intensidade para produzir a final GCaMP a intensidade de fluorescência (F – F0) / (Fmáx – F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descarte as células que não apresentam uma alteração na intensidade após estimulação de KCl, como eles podem ser insalubre ou danificados.</li>
	<li>Para realizar a análise (medidas 4.9 – 4.10) em R, use o script de R (plotcelltrace. R) fornecido com este manuscrito.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Aqui vamos demonstrar uma técnica para a quantificação de células beta glicose capacidade de resposta na resolução de célula única. Isto é possibilitado pela concentração de cálcio intracelular, utilizando um indicador de cálcio geneticamente codificado, GCaMP6s de monitoramento. A atividade de células beta é capturado ex vivo montando o Ilhéu em um molde de fibrinogênio-trombina. Uma etapa crítica do protocolo é a estabilidade do molde. Tempo suficiente deve ser dada para o fibrinogênio dissolver na solução HBSS. Sem isso, o molde não polimerizar-se suficientemente para fornecer estabilidade durante a sessão de imagens. Um ilhéu montado no molde de fibrinogênio-trombina e imersos em meios de cultura celular pode permanecer viável pelo menos uma semana (dados não mostrados). Alternativas para o molde de fibrinogênio-trombina, como agarose de baixo ponto de fusão, podem ser utilizadas para montar o ilhéu22. Outro parâmetro crítico é a dissecção da ilhota. Durante esta etapa, o tecido circundante a ilhota precisa ser removido sem ferir ou picar o ilhéu. Uma dissecação hábil vem com prática.
Uma limitação do protocolo de imagem é a restrição a um avião confocal de ilhota. Isso é feito para capturar a dinâmica do influxo de cálcio dentro beta-células individuais. Um Z-pilha através de toda espessura da ilhota leva à baixa de imagem velocidades e perda de sinal oscilatório de células individuais. Esta limitação pode ser melhorada usando meios mais rápidos de confocal de imagem tais como a microscopia de disco giratório, para permitir a captura a dinâmica de cálcio em 3 dimensões. Outra fronteira seria na vivo cálcio imagem12. A natureza transparente do zebrafish embrião ou o uso de cepas de pigmento-menos de zebrafish adultos23 poderia abrir a possibilidade para na vivo de imagens no futuro.
A imagem da atividade de células beta em alta resolução espacial e temporal permite investigar a heterogeneidade funcional entre beta-células individuais. Esta abordagem pode ajudar a lançar luz sobre a existência de sub-populações de células beta. Recentemente, vários estudos têm demonstrado a existência de sub-populações em células-beta nominalmente homogênea24,25,26. Ex vivo de imagem pode ser combinada com repórteres genéticos para caracterizar da resposta do subpopulação de glicose. Além disso, combinando a configuração de imagem com estimulação farmacológica pode permitir para rastreio de compostos que poderiam melhorar a funcionalidade de células beta.
Em resumo, a técnica aqui apresentada permite a quantificação e comparação entre a capacidade de resposta de glicose para beta-células individuais. Ele fornece uma janela direta para funções de células beta, um parâmetro importante no desenvolvimento do diabetes.

Nossa glicose no sangue é mantida em uma estreita faixa, em grande parte devido a função do pâncreas endócrino. A função endócrina do pâncreas é executada por ilhotas de Langerhans, que contêm células secretoras de hormônio. As beta-células secretoras de insulina são responsáveis pela redução dos níveis de glicose sanguínea após uma refeição contendo carboidratos. A secreção de insulina inadequada de células beta pode resultar em diabetes1, que é caracterizada por glicemia alta sustentada. Tipo 1 e Diabetes tipo 2, que atualmente atinge mais de 400 milhões de pessoas no mundo, leva a morbidade e mortalidade2. Investigando os fatores moleculares e ambientais que contribuem para a disfunção da célula beta, entenderemos melhor como diabetes tipo 2 começa e progride. Além disso, a capacidade de diferenciar células estaminais humanas em células-beta funcional em vitro pode fornecer uma fonte de novas células-beta das terapias de reposição celular no Diabetes tipo 1. Para este fim, é importante estudar a função da célula beta e maturação em organismos-modelo genético a fim de obter o conhecimento necessário para fazer as células-beta funcionais em um prato.
Funcionalidade de células beta pode ser monitorada no nível de conjunto-ilhéu por quantificar a quantidade total de insulina secretada em resposta à glicose-estimulação. Esta abordagem cumulativa estuda o ilhéu como um único grupo de células sem diferenciação individual Propriedades da célula. No entanto, a análise das respostas de glicose de beta-células individuais revelou uma diversidade nas propriedades funcionais das células beta e a presença de heterogeneidade3. Para avaliar a função das células beta-individuais, é possível monitorar as alterações intracelulares que levam à secreção de insulina4. A secreção de insulina é precedida por uma entrada de glicose para as células-beta. A glicose que entra nas células-beta é rapidamente metabolizada a ATP. Altas concentrações de ATP intracelulares diminuem a probabilidade aberta de canais de íons de potássio sensíveis ao ATP levando a despolarização da célula beta. Despolarização abre os canais iônicos de cálcio voltagem-sensíveis e aumenta cálcio intracelular. Por sua vez, cálcio desencadeia a exocitose de insulina, que é liberada na circulação e reduz os níveis de glicose através da promoção da utilização de glicose5,6,7.
Várias estratégias foram aplicadas para investigar a função das células beta, incluindo monitoramento do potencial de membrana8, visualização directa de insulina-vesículas de exocitose9e quantificação de intracelular Ca2 + afluxo como um proxy para glicose-resposta10. Entre eles, imagem latente de intracelular Ca2 + fornece a vantagem da extrapolação da análise de várias células individuais dentro da mesma ilhéu11,12, permitindo a comparação direta da glicose-resposta entre beta-células individuais. Concentração de Ca2 + intracelular pode ser monitorada usando corantes fluorescentes sensíveis ao cálcio13 ou cálcio geneticamente codificado indicadores (GECIs)14. Considerando que o cálcio-indicador corantes falta especificidade de tipo de célula, GECIs pode ser expressa em um tipo específico de célula pelos promotores específicos. Além disso, a nova geração do GECIs, tais como GCaMP6, fornece a melhor relação sinal-ruído juntamente com mais rápido temporal dinâmica15. Aqui descrevemos o utilitário da novo-geração do GECIs, em particular GCaMP6s, Visualizar o cálcio em células-beta em resolução de célula única. Podemos aplicar esse método para o ilhéu primário zebrafish como nosso modelo de escolha. Durante o desenvolvimento embrionário, células-beta no Ilhéu do primário originam a dorsal e ventral do pâncreas botões16. A ilha principal está localizada em uma posição anatômica estereotipada dentro do pâncreas zebrafish, permitindo a sua fácil identificação e isolamento. Células-beta no Ilhéu do primário são necessárias para glicose-regulamento, conforme sua genética ablação leva à hiperglicemia17,18. Além disso, estas células-beta se tornar glicose responsivo durante o início do zebrafish desenvolvimento19. Este protocolo pode ser também aplicado a imagem latente as ilhotas secundárias, que se formam durante as fases pós-embrionárias. O protocolo permite a imagem beta-células ex vivo, em fases posteriores de desenvolvimento e sob as concentrações de glucose definidos.

<table><tbody><tr><td>Linha de peixe-zebra transgênico: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td><td></td><td></td><td>A pedido dos autores</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>ZEISS</td><td>495015-0001-000</td><td>SteREO Discovery.V8</td></tr><tr><td>Lâmpada de fluorescência</td><td>ZEISS</td><td>423013-9010-000</td><td>Iluminador HXP 120 V</td></tr><tr><td>Cubo de filtro vermelho</td><td>ZEISS</td><td>000000-1114-462&nbsp;</td><td>Conjunto de filtros 45 HQ TexasRed</td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>ZEISS</td><td>LSM 780</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogênio bovino</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (solução salina balanceada de Hanks)</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>35 mm de diâmetro com fundo de vidro</td><td>ThermoFisher</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>tricaine metano sulfonato</td><td>Sigma</td><td>E10521&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11445-12</td><td></td></tr><tr><td>FIJI, usando ImageJ Versão: 2.0.0-rc-43/1.50e</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>R, versão 3.2.4</td><td></td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/</td></tr> <tr><td>plotcelltrace. R</td><td></td><td></td><td>Um script personalizado fornecido com o manuscrito</td></tr></tbody></table>

análise da função de células beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de zebrafish

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

As células-beta do pâncreas respondem ao aumento das concentrações de glicose do sangue através da secreção da hormona insulina. A disfunção das células beta leva a hiperglicemia e consequências graves, com risco de vida. Compreensão de como as células-beta operam sob condições fisiológicas e que fatores genéticos e ambientais podem causar sua disfunção pode levar a melhores opções de tratamento para pacientes diabéticos. A capacidade de medir os níveis de cálcio em células-beta serve como um importante indicador da função de células beta, como o fluxo de liberação de insulina de gatilhos de íons de cálcio. Aqui descrevemos um protocolo para monitorar o influxo de cálcio glicose-estimulada em células-beta do zebrafish usando GCaMP6s, um sensor geneticamente codificado de cálcio. O método permite o monitoramento da dinâmica de cálcio intracelular com resolução de célula única em ex vivo montado ilhotas. A glicose-capacidade de resposta das células-beta dentro da mesma ilha pode ser capturado simultaneamente sob concentrações diferentes de glicose, que sugere a presença de heterogeneidade funcional entre as células-beta do zebrafish. Além disso, a técnica fornece a alta resolução temporal e espacial, que revela a natureza oscilatória o influxo de cálcio após estimulação de glicose. Nossa abordagem abre as portas para usar o zebrafish como um modelo para investigar a contribuição de fatores genéticos e ambientais para a função de células beta e disfunção.

Usando o protocolo descrito acima, foram analisadas as respostas de glicose das células-beta em um ilhéu de um zebrafish pós fertilização (dpf) de 45 dias. Para isso, a ilhota principal foi dissecada de um animal euthanized e montada no molde trombina fibrinogênio em um prato fundo de vidro. O ilhéu foi imerso em HBSS contendo glicose de 5 mM. A concentração de glicose foi aumentada de forma faseada de 10 mM e 20 mM. As respostas das células-beta para o aumento das concentrações de glicose foram gravadas. Finalmente, as células-beta foram despolarizadas usando 30 mM KCl (Figura 1). A despolarização usando KCl induz a entrada de cálcio nas células-beta saudáveis.
Usando a FIJI e um software de análise de dados, a intensidade de fluorescência GCaMP6s de beta-células individuais é extraída e normalizado (Figura 2). Como visto o rastreamento da intensidade de fluorescência, beta-células individuais exibem oscilações na GCaMP6s de fluorescência após estimulação de glicose, que para após estimulação de KCl. A técnica fornece uma resolução de celular de glicose-capacidade de resposta da célula beta- e uma janela em sua funcionalidade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> Figura 1: Ex vivo ao vivo-imagem latente do influxo de cálcio usando GCaMP6s em células-beta do zebrafish. Uma ilhota primária de Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); TG(ins:GCaMP6s) zebrafish (45 dpf) foi montado no molde de fibrinogênio-trombina e incubada com glicose de 5 mM (basal). Células-beta foram rotuladas com um marcador vermelho nuclear, enquanto a fluorescência de GCaMP6s está presente no canal verde. O ilhéu foi estimulado com uma glicose-rampa consistindo de incubação sequencial com 10 mM e 20 mM D-glicose e despolarizada através da adição de 30 mM que KCl. setas marcam beta-células individuais, cuja actividade foi analisada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> Figura 2: normalizado GCaMP6s intensidade de fluorescência-traço beta-células individuais. Normalizado GCaMP6s fluorescência intensidade-rastreamento para as células-beta marcado com setas na Figura 1. O eixo x indica o tempo em segundos. No topo, barras mostram a concentração de glicose e de KCl no meio HBSS. O eixo y denota a intensidade de fluorescência normalizado durante a série de tempo. Por isso, intensidade da linha de base (F0) é calculada como a média intensidade durante incubação em glicose de 5 mM. Isto é subtraído os todo série de tempo dados (F - F0). A intensidade de linha de base é normalizada pela intensidade máxima exibida pela célula (F - F0) / (Fmáx- F0). O registo normalizado mostra uma resposta oscilatória das células beta à glicose, que estabiliza quando as células são despolarizadas com 30 mM KCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Funcionalidade de células beta é importante para a homeostase de glicose sanguínea, que é avaliada em célula única resolução usando um repórter geneticamente codificado para o influxo de cálcio.

Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Este método pode ajudar a entender questões importantes no campo das células beta. Como a função heterogênea IT entre células beta individuais dentro de uma ilhota. A principal vantagem desta técnica é a resolução espacial e temporal fornecida pela imagem ao vivo das células beta.Podemos capturar as oscilações de cálcio dentro de células beta individuais. Depois de sacrificar um peixe de acordo com o protocolo de texto, transfira-o para uma placa de Petrie contendo solução HBSS com cálcio e magnésio. Em seguida, sob um microscópio estéreo equipado com uma lâmpada de fluorescência e um cubo de filtro vermelho, use uma pinça afiada para cortar a pele da boca até a barbatana anal.Retire a pele cortada do lado direito para expor o abdômen, o que exporá os órgãos internos. Em seguida, usando a fluorescência vermelha para identificar a expressão de mKO2 em células beta, localize as ilhotas. Limpe a ilhota primária removendo cuidadosamente o tecido circundante, como fígado e adipócitos.Tome precauções para não ferir ou cutucar a ilhota. Em seguida, pipete uma gota de 30 microlitros de HBSS no centro de um prato com fundo de vidro. Em seguida, transfira a ilhota dissecada para a gota.Com HBSS, lave cuidadosamente a ilhota uma vez e use 30 microlitros de solução de trabalho de fibrinogênio para lavá-la uma vez. Evite secar a ilhota durante as etapas de lavagem, o que pode resultar em morte celular. Adicione lenta e suavemente 10 microlitros de 10 unidades por mililitro de solução de trombina à ilhota.Deixe a ilhota e o prato intocados por 15 a 20 minutos. Observe que a gota de trombina do fibrinogênio se tornará viscosa e estável. Tempo suficiente precisa ser dado para que a trombina polimerize na solução de fibrinogênio.Caso contrário, o molde não fornecerá estabilidade durante a sessão de imagem. Para realizar imagens ao vivo ex vivo da fluorescência GCaMP, adicione 200 microlitros de HBSS em cima do molde e coloque cuidadosamente a placa no suporte da placa do microscópio confocal. Em seguida, com uma objetiva de erro 20X 0,8 NA e a opção de campo claro, localize a ilhota.Usando o filtro para fluorescência vermelha para visualizar a fluorescência nuclear mKO2 em células beta focadas na ilhota. Os núcleos individuais devem ser claramente visíveis. Localize um plano de imagem claro movendo-se manualmente pela espessura da ilhota ao longo de seu eixo Z.Certifique-se de que o plano de imagem contenha 50 a 100 células beta para imagens e que o brilho da fluorescência nuclear mKO2 seja uniforme, especialmente no centro da ilhota. Em seguida, no menu de configuração inteligente, configure uma aquisição sequencial para fluorescência GCaMP6 e mKO2 usando as configurações a seguir. Para GCaMP6, escolha uma excitação de 488 nanômetros e uma emissão aproximada de 500 a 555 nanômetros.Em cor falsa, selecione GFP. Para mKO2, escolha uma excitação de 561 nanômetros e uma emissão de 570 a 630 nanômetros. Para a cor falsa, selecione mCherry.No modo de aquisição, defina a resolução da imagem para 1.024 por 1.024 pixels, a velocidade para 10 e a média para um. Inicie uma gravação contínua selecionando a opção Série Temporal e definindo a duração para 500 ciclos com aproximadamente dois segundos de tempo de aquisição por quadro. Fique de olho no ciclo de imagem.Após os primeiros 50 quadros sem perturbar a aquisição da imagem, pipetar suavemente cinco microlitros de solução de D-glicose 200 milimolares em cima do gel que segura a ilhota. Em seguida, adquira 150 quadros a 10 milimolares de glicose. Os primeiros 50 quadros da série temporal correspondem à atividade das células beta em cinco milimolares de glicose.Esta é a atividade basal. Uma célula beta que responde mostrará aumento e diminuição da fluorescência verde com o tempo. Em 200 quadros, aumente a concentração de glicose para 20 milimolares adicionando suavemente 10 microlitros de D-glicose 200 milimolares.Em seguida, adquira 150 quadros na concentração de 20 milimolares. Para abrir o arquivo de imagem em FIJI, selecione Plugin, LSM Toolbox, show LSM Toolbox. Na caixa de ferramentas do LSM, clique em Abrir LSM e selecione o arquivo de imagem.Em Ferramentas, no menu Analisar, abra o Gerenciador de ROI. Com a ferramenta de seleção de polígonos localizada na barra de ferramentas, desenhe manualmente o ROI. Desenhe o ROI no canal vermelho para que cubra uma área maior que um núcleo para incluir parte do citoplasma da célula.Certifique-se de que a posição do ROI seja consistente entre os quadros e ajuste a posição, se necessário. Adicione os ROIs selecionados ao ROI Manager clicando no botão Adicionar. Selecione e adicione vários ROIs para obter dados em várias células.Em seguida, no menu Analisar, selecione Definir medidas. Em seguida, selecione Densidade integrada para especificar a extração da intensidade total de fluorescência dentro da área. Mude para o canal verde que contém a fluorescência GCaMP e, no ROI Manager, selecione Multi Measure.Isso fornecerá as medições de intensidade para as células ao longo da série temporal. Salve a saída FIJI como um arquivo de texto separado por vírgulas. Na Caixa de Ferramentas do LSM, obtenha os carimbos de data/hora dos quadros de imagem.Use Aplicar carimbos, Aplicar carimbos T, Nome do arquivo, Despejar no arquivo de texto para obter os carimbos de data/hora. Salve os carimbos de data/hora usando a opção Salvar como ou copie-os para a planilha. Ao compilar os valores de intensidade para todas as células, execute a análise uma célula de cada vez ou automaticamente.Consulte o protocolo de texto para obter detalhes adicionais. Neste experimento, células beta de ilhotas primárias individuais de 45 linhagens transgênicas DPF expressando mKO2 nuclear e GCaMP6 especificamente em células beta, foram estimuladas com uma rampa de glicose e depois despolarizadas com cloreto de potássio. A atividade das células foi analisada.Usando FIJI e software de análise de dados, a intensidade de fluorescência GCaMP6 de células beta individuais foi extraída e normalizada. Como visto a partir desse traço de intensidade de fluorescência, as células beta individuais exibem oscilações na fluorescência do GCaMP6 quando estimuladas com glicose, e a adição de cloreto de potássio estabiliza a fluorescência. A técnica fornece uma resolução celular da capacidade de resposta à glicose da célula beta e uma janela para sua funcionalidade.Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em 45 minutos se feita corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante verificar a viabilidade das células beta. Após este procedimento, outros métodos, como manipulações genéticas, podem ser realizados para entender o papel de genes específicos na função das células beta.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a resposta à glicose dentro de células beta individuais.

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Research

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