Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Este método pode ter resposta a perguntas-chave no campo de ilhotas pancreáticas sobre diferenciação de linhagem de ilhotas pancreáticas, maturação e regeneração. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a coleta de células únicas de ilhotas pancreáticas para a geração de dados de sequenciamento de RNA unicelular de alta qualidade. A aplicação dessa técnica estende-se à terapia do diabetes e de outras doenças endócrinas pancreáticas por meio da análise transcriômica de células únicas endocrinas pancreáticas sobre as condições patológicas.

A demonstração visual deste método é fundamental, pois a inserção da agulha no estreito ducto biliar do pâncreas para a perfusão pode ser complicada. Para embrionário dia 17,5 embriões. Depois de abrir a cavidade abdominal, use pinças de cotovelo para transferir o tecido visceral para uma antena de fundo preto de seis centímetros contendo PBS frio.

Use fórceps para separar o pâncreas do tecido visceral. E coloque o tecido pancreático em um frasco de 20 mililitros contendo cinco mililitros de solução de colagem fria. Para o pós-natal dia zero a 15 ratos, disseque cuidadosamente todos os lóbulos do pâncreas antes de colocar o tecido na colagemnase.

Para o pós-natal dia 18 a 60 camundongos, primeiro remova o xifoide e extraia o intestino para o lado direito da cavidade abdominal. Empurre os lóbulos medial esquerdo e direito do fígado para cada lado para expor a vesícula biliar e o ducto biliar comum. E aperte o duodeno com um par de pequenos grampos de vaso nas posições superior e inferior para flanquear o local onde o ducto biliar entra no duodeno.

Em seguida, carregue uma seringa de 5 mililitros equipada com uma agulha calibre 30 com solução de colagem a frio. E use o microscópio para inserir a ponta da agulha na vesícula biliar. Manipule com cuidado e suavemente a agulha através do ducto biliar comum.

E deprimir o êmbolo para perfundir o pâncreas com um a cinco mililitros da solução de colagem de acordo com o tamanho do mouse. Quando toda a solução tiver sido perfundida, use fórceps para transferir imediatamente o pâncreas para um frasco de 20 mililitros contendo cinco mililitros de solução de colagem fria fresca. Quando todo o tecido pancreático tiver sido coletado, coloque o frasco em um banho de água de 37 graus Celsius por três minutos, seguido de três a cinco minutos de agitação suave.

Em seguida, filtre o produto digerido através de um coador de nylon de 0,25 milímetros em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros. E use uma seringa de 20 mililitros contendo PBS gelado para lavar completamente o coador. Para o pós-natal dia 18 a 60 pancreata, centrifugar a amostra filtrada e resuspensar o tecido em 30 mililitros de PBS frio.

Em seguida, decantar a suspensão do tecido em um prato de fundo preto de seis centímetros, e usar uma pipeta de 200 microliter e um microscópio dissecando para colher as ilhotas para transferência em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro contendo um pequeno volume de PBS frio. Para o dia embrionário 17,5 pós natal dia 15 pancreata, centrifugar o tecido pancreático filtrado e resuspensar a pelota em solução trypsin-EDTA para uma incubação de quatro minutos em um banho de água Celsius de 37 graus. No final da incubação, tente suavemente classificar a pelota por um minuto com uma pipeta de 200 microliter, seguida pela adição de 0,5 vezes o volume de soro bovino fetal frio com um vórtice suave para parar a digestão.

Em seguida, colete o digestor por centrifugação e resuspenja as células em 200 microliters de tampão FACS em um tubo FACS de 5 mililitros para classificação por citometria de fluxo. Para a colheita e lise de células únicas, aliquot recém-preparado tampão de lise celular em oito tubos PCR de tiras, e transferir uma única célula para cada. Vórtice as amostras para lise as células para liberação do RNA, seguidas de centrifugação por 30 segundos a quatro graus Celsius, e armazenamento imediato no gelo.

Para transcrição reversa, incubar os lises por três minutos a 72 graus Celsius seguido de um minuto no gelo. Centrifufique brevemente as amostras por 30 segundos a quatro graus Celsius e adicione 5,7 microliters de mistura de transcrição reversa a cada amostra para levar o volume total a 10 microlitres para cada amostra. Após vórtice suave e centrifugação, carregue as amostras em um termociclador e inicie o programa de transcrição reversa.

Para pré-amplificação de reação em cadeia de polimerase, ou PCR, adicione 15 microliters de mistura PCR a cada amostra contendo as reações do primeiro fio, seguido por vórtice suave e centrifugação. Em seguida, carregue as amostras no termociclador e inicie o programa PCR. Para purificação de PCR, adicione 25 microliters de contas de purificação de DNA resuspended em cada amostra, e misture bem com vórtice.

Em seguida, gire rapidamente as amostras à temperatura ambiente para coletar o líquido, evitando a liquidação das contas. Após cinco minutos em temperatura ambiente, coloque as amostras em um suporte magnético apropriado, removendo cuidadosamente e descartando o sobrenante quando a solução estiver clara. Lave as contas com duas lavagens de 30 segundos em 200 microliters de 80% de etanol recém-preparado por lavagem.

E descarte o etanol restante após a segunda lavagem. Quando as contas secarem o ar, adicione 11 microliters de água sem nuclease para elutar o alvo de DNA das contas, seguido de vórtice. Em seguida, centrifufique rapidamente as amostras, devolva as amostras ao suporte magnético até que a solução esteja clara e transfira 10 microliters de cada amostra para um novo tubo PCR.

CDNA amplificada com sucesso deve ter um comprimento completo acima de 500 pares de base, e ser enriquecido de 1,5 a dois pares de base de dois quilos. Além disso, geralmente há um enriquecimento de par de 500 a 600 bases de cDNA observado em insulina um RFP mais células, o que pode representar as transcrições de insulina. No entanto, os fragmentos de cDNA perto de 100 pares de base são dimers primer, que geralmente são causados por primers excessivos e que devem ser removidos repetindo a etapa de purificação de DNA.

Os fragmentos de CDNA entre 100 e 500 pares de base geralmente representam cDNA degradado, que é causado por problemas de estado celular ruim ou região, como a contaminação rnase e deve ser excluído. Após a purificação das bibliotecas cDNA para sequenciamento, cDNA variando de 250 a 450 pares de base pode ser obtido através da adição de contas de purificação de DNA à primeira e segunda rodadas de purificação. Após a purificação das contas de DNA, o escore de qualidade de sequenciamento deve ser superior a 30 durante a avaliação da qualidade do sequenciamento.

Para obter células de alta qualidade para análises a jusante, são excluídas células com menos de 0,5 milhões de leituras mapeadas ou com menos de 4.000 genes detectados, facilitando a caracterização de diferentes grupos de células e a identificação de genes heterogêneos expressos em diferentes grupos após análise de componentes principais e agrupamento hierárquico. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de perfumar o pâncreas rapidamente antes da digestão da colagem para evitar a digestão da ilhota sobre a digestão e manter o ambiente livre de RNase durante os procedimentos de célula única. Após este procedimento, outros métodos como imagem de ilhotas e cultura podem ser realizados para facilitar a visualização da estrutura da ilhota e examinar as respostas celulares e estimulação de medicamentos.

Após o desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da pesquisa pancreática explorarem os mecanismos de desenvolvimento e regeneração da linhagem de ilhéus, bem como a progressão do diabetes em mamíferos.