Name: Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a isolar células endócrinas pancreáticas de ratos para sequenciamento de RNA de célula única. Este método permite analisar a diferenciação e heterogeneidade das ilhotas pancreáticas, auxiliando pesquisas sobre diabetes.

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Agradecemos o centro nacional para Ciências da proteína, Beijing (Peking University) e do centro de Pequim-Tsinghua para a plataforma de computação de Ciências da vida. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia da China (2015CB942800), Nacional Natural Science Foundation da China (31521004, 31471358 e 31522036) e financiamento de Pequim-Tsinghua centro para Ciências da vida para R.X.-C.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Neste protocolo, temos demonstrado um método eficaz e fácil de usar para estudar os perfis de expressão de célula única das células β do pâncreas. Esse método pode ser usado para isolar células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal e realizar análises de transcriptomic de célula única.
O passo mais crítico é o isolamento das células β único em boas condições. Totalmente perfundidos pancreases respondem melhor à digestão subsequente. Insuficiente perfusão, que normalmente...

O pâncreas é um órgão vital metabólico em mamíferos. O pâncreas é composto por compartimentos endócrinos e exócrinas. Células endócrinas no pâncreas, incluindo células β produtoras de insulina e glucagon-produzindo células α, cluster juntos em ilhotas de Langerhans e coordenada regulam a homeostase de glicose sistémica. Disfunção das células endócrinas resulta em diabetes mellitus, que se tornou uma questão de saúde pública em todo o mundo.
Células endócrinas do pâncreas são derivadas de Ngn3+ progenitores durante a embriogênese1. Mais tarde, durante o período perinatal, as células endócrinas proliferaram para Ilhéus imaturo de formulário. Estas células imaturas continuam a desenvolver e tornar-se progressivamente ilhotas maduras, que se tornam ricamente vascularizadas regular homeostase de glicose do sangue em adultos2.
Embora foi identificado um grupo de fatores de transcrição que regulam a diferenciação de células β, o caminho exato de maturação das células β é ainda incerto. Além disso, o processo de maturação de células β envolve também o Regulamento da cela número expansão3,4 e a geração de heterogeneidade celular5,6. No entanto, os mecanismos de regulação desses processos não foram bem estudados.
A sequenciação do ARN-célula única é uma abordagem poderosa que pode perfil subpopulações de células e rastrear celular linhagem caminhos do desenvolvimento7. Aproveitando esta tecnologia, a chave de eventos que ocorrem durante o desenvolvimento de ilhotas pancreáticas podem ser decifrados a célula única nível8. Entre os protocolos de célula única-a sequenciação do ARN, Smart-seq2 permite a geração de cDNA completo com sensibilidade melhorada e precisão e a utilização de reagentes padrão no menor custo9. Inteligente-seq2 leva cerca de dois dias para construir uma biblioteca de cDNA para sequenciamento10.
Aqui, propomos um método para o isolamento de células β fluorescência-etiquetada dos pancreases de fetal adulto Ins1-RFP11ratos transgénicos, usando fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e o desempenho de transcriptomic analisa na nível de célula única, usando a tecnologia Smart-seq2 (Figura 1). Este protocolo pode ser estendido para analisar a transcriptomes de todos os tipos de célula endócrina do pâncreas em Estados normais, patológicos e envelhecimento.

<table><tbody><tr><td>Colagenose P</td><td>Roche</td><td>11213873001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 4 Fórceps</td><td>Roboz</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fórceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD Agulha 1/2 " Comprimento</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência estéreo</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de poliestireno de fundo redondo com tampa de filtro de células</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de PCR de 96 poços</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-C</td><td></td></tr><tr><td>Tapete de vedação de silicone</td><td>Axygen</td><td>AM-96-PCR-RD</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PCR de poço fino</td><td>Extragene</td><td>P-02X8-CF</td><td></td></tr><tr><td>Classificador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta capilar</td><td>Sutter</td><td>B100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>mistura dNTP New</td><td>England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase recombinante</td><td>Takara</td><td>2313</td><td></td></tr><tr><td>Superscript II transcriptase reversa</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de primeira fita (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Betaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-43-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA Clean Beads XP beads</td><td>Vazyme</td><td>N411-03</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q121-02</td><td></td></tr><tr><td>TruePrep DNA Library Prep Kit V2 para Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD502</td><td>Inclui 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td></tr><tr><td>Kit de Índice TruePrep V3 para Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD203</td><td>Inclui 16 N6XX e 24 N8XX</td></tr><tr><td>Kit de Análise de Fragmentos NGS de Alta Sensibilidade</td><td>Advanced Analytical Technologies</td><td>DNF-474</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS sem Ca2+ e Mg2+</td><td></td><td></td><td>NaCl 138 mM; 5,34 mM KCl 4,17 mM NaHCO3; 0,34 mM Na2HPO4 0,44 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>Buffer</td><td></td><td></td> de isolamento <td>1 &vezes; HBSS contendo 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM de glicose, pH 7,4</td></tr><tr><td>tampão</td><td></td><td></td> FACS <td>1 &vezes; HBSS contendo 15 mM HEPES, 5,6 mM de glicose, 1% FBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>D-+ (+) -glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT 30 VN primer</td><td></td><td></td><td>5 '-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT 30 VN-3'TSO</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR</td></tr> <tr><td>primers</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'</td></tr><tr><td>Gapdh Primer</td><td></td><td></td> direto <td>5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'</td></tr><tr><td>Gapdh Primer reverso</td><td></td><td></td><td>5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'</td></tr><tr><td>Ins2 Primer</td><td></td><td></td> direto <td>5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'</td></tr><tr><td>Ins2 Primer</td><td></td><td></td> reverso <td>5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'</td></tr></tbody></table>

análises de célula única transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Células endócrinas no pâncreas, que são agrupadas em Ilhéus, regulam a estabilidade de glicose do sangue e metabolismo energético. Os tipos de células distintas em Ilhéus, incluindo células secretoras de insulina β, são diferenciados de progenitores endócrinas comuns durante a fase embrionária. Células endócrinas imaturas expandir através da proliferação celular e amadurecem durante um período de tempo pós-natal do desenvolvimento. No entanto, os mecanismos subjacentes a esses processos não estão claramente definidos. A sequenciação do ARN-célula única é uma abordagem promissora para a caracterização das populações de células distintas e vias de diferenciação de linhagem de célula rastreamento. Aqui, descrevemos um método para a célula única-a sequenciação do ARN de células β do pâncreas isolado de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal.

Pancreases foram dissecados de ratos embrionários, Neonatais e pós-natal (Figura 2A e 2B). Para os ratos mais velhos que pós-Natal dia 18, o efeito digestivo depende do grau de perfusão; Portanto, a injeção é o passo mais importante para isolamento ilhéu (Figura 2-2E e tabela 6). Tanto colagenase foi injetado como era possível preencher o pâncreas durante esta e...

Nós descrevemos um método para o isolamento de células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal, seguidos por sequenciação do ARN de célula única. Esse método permite que as análises do desenvolvimento de linhagem endócrina do pâncreas, heterogeneidade e transcriptomic dinâmica de células.

Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Este método pode ter resposta a perguntas-chave no campo de ilhotas pancreáticas sobre diferenciação de linhagem de ilhotas pancreáticas, maturação e regeneração. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a coleta de células únicas de ilhotas pancreáticas para a geração de dados de sequenciamento de RNA unicelular de alta qualidade. A aplicação dessa técnica estende-se à terapia do diabetes e de outras doenças endócrinas pancreáticas por meio da análise transcriômica de células únicas endocrinas pancreáticas sobre as condições patológicas.A demonstração visual deste método é fundamental, pois a inserção da agulha no estreito ducto biliar do pâncreas para a perfusão pode ser complicada. Para embrionário dia 17,5 embriões. Depois de abrir a cavidade abdominal, use pinças de cotovelo para transferir o tecido visceral para uma antena de fundo preto de seis centímetros contendo PBS frio.Use fórceps para separar o pâncreas do tecido visceral. E coloque o tecido pancreático em um frasco de 20 mililitros contendo cinco mililitros de solução de colagem fria. Para o pós-natal dia zero a 15 ratos, disseque cuidadosamente todos os lóbulos do pâncreas antes de colocar o tecido na col

single-cell-transcriptomic-analyses-mouse-pancreatic-endocrine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui, nós descrevemos um método para a cultura de isolamento e manipulação de pâncreas de rato embrionário. Isto representa uma...

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Nesta publicação, é descrito um procedimento rápido e conveniente para o isolamento e cultura de células acinares pancreáticas primárias do pâncreas murino. Este método constitui uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiologia das células primárias normais do pâncreas fresco / não transformada exócrinas.

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

Em ensaios de colónias in vitro para a detecção de auto-renovação e diferenciação de células progenitoras isoladas a partir de pâncreas de murino adulto são concebidos. Nestes ensaios, progenitores pancreáticas dar origem a colónias de células no espaço 3-dimensional em meio semi-sólido contendo metilcelulose. Protocolos para a manipulação de células individuais e caracterização de colónias individuais são descritos.

In Vitro Colony Os ensaios para a caracterização de células progenitoras Tri-potentes Isolado das adultas murino Pâncreas

Aqui, nós descrevemos um processo para o isolamento de células no microambiente pâncreas do rato a partir de tecido embrionário, neonatal e adulto, incidindo sobre o isolamento de células do mesênquima. Este método permite que perfis de expressão gênica celular e secreção de proteínas, a fim de elucidar os sinais extrínsecos que regulam o desenvolvimento pâncreas, função e tumorigênese.

Isolando e analisando células do pâncreas Mesênquima por citometria de fluxo

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar insulina expressando 3D pancreatoids murino de progenitores pancreático flutuantes e10.5 dissociada e a mesênquima associada.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

Aqui, nós apresentamos um protocolo para gerar de alta qualidade, dados do transcriptoma em grande escala das únicas pilhas das ilhotas pancreatic humanas isoladas usando uma tecnologia de sequenciamento microfluídico do RNA da único-pilha da gota-baseada.

Sequenciamento de RNA de célula única e análise de ilhotas pancreáticas humanas

As células metaplásicas pancreáticas são precursoras de células malignas que dão origem a tumores pancreáticos. No entanto, isolar células pancreáticas viáveis intactas é um desafio. Apresentamos aqui um método eficiente para dissociação do tecido pancreático. As células podem então ser usadas para sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) ou para co-cultivo bidimensional ou tridimensional.

Dissecção do tecido pancreático para isolar células únicas viáveis

Este protocolo descreve como gerar fatias de pâncreas humano de doadores de órgãos falecidos para estudar a função celular em condições quase fisiológicas. Essa abordagem inovadora permite a investigação de ilhotas normais e estruturalmente danificadas e a intrincada interação entre os compartimentos endócrino e exócrino.

Geração de fatias de tecido pancreático humano para estudar a fisiologia endócrina e exócrina do pâncreas

Este protocolo descreve o isolamento de células endoteliais de camundongos de todo o pâncreas.

Isolamento de células endoteliais pancreáticas de camundongo

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

Aprenda a isolar células endócrinas pancreáticas de ratos para sequenciamento de RNA de célula única. Este método permite analisar a diferenciação e heterogeneidade das ilhotas pancreáticas, auxiliando pesquisas sobre diabetes.

Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

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