Isolando e analisando células do pâncreas Mesênquima por citometria de fluxo
28 de janeiro de 2017
Aqui, nós descrevemos um processo para o isolamento de células no microambiente pâncreas do rato a partir de tecido embrionário, neonatal e adulto, incidindo sobre o isolamento de células do mesênquima. Este método permite que perfis de expressão gênica celular e secreção de proteínas, a fim de elucidar os sinais extrínsecos que regulam o desenvolvimento pâncreas, função e tumorigênese.
O objetivo geral deste procedimento é isolar células mesenquimais pancreáticas para análise de expressão de marcadores genéticos e de superfície. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento do pâncreas, como quais pistas são expressas pelas células mesenquimais e como elas influenciam o desenvolvimento epitelial. As principais vantagens desta técnica são que ela é relativamente simples e rápida, e que permite um bom rendimento de células classificadas.
Comece depositando os órgãos internos em uma placa de cultura contendo HBSS e colocando a placa sob um microscópio estéreo. Separe o fígado e os rins para expor o pâncreas usando uma pinça fina para remover o pâncreas do estômago, duodeno e baço. À medida que cada pâncreas é coletado, transfira o tecido para um tubo cônico contendo tampão digestivo recém-preparado e coloque o tubo no gelo.
Quando todo o pâncreas tiver sido colhido, transfira os tecidos para um bloco de aquecimento a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação a 700 RPM, invertendo manualmente os tubos três a quatro vezes após 15 minutos. Se grandes pedaços de pâncreas ainda estiverem presentes após a primeira metade da digestão, inverta o tubo a cada cinco minutos nos últimos 15 minutos e incube o tecido por mais cinco a 10 minutos, conforme necessário. No final da digestão, coloque os tubos no gelo e adicione 10 mililitros de HBSS frio a cada amostra.
Colete as células por centrifugação e ressuspenda os pellets em dois mililitros de PBS fresco. Em seguida, filtre as células através de filtros de 35 mícrons em tubos de coleta de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros e lave os tubos de digestão com dois mililitros de PBS fresco, coando as lavagens em seus tubos de coleta correspondentes. Em seguida, centrifugue novamente as células e aspire cuidadosamente os sobrenadantes sem perturbar os pellets.
Ressuspenda as células em tampão de triagem de acordo com a idade dos animais e filtre-as através de novos filtros de células de 35 mícrons em novos tubos de coleta de cinco mililitros. Alíquota de volumes de 50 a 100 microlitros de células em novos tubos FACS para os controles de coloração, incluindo um tubo para cada fluoróforo, o corante de viabilidade, as proteínas fluorescentes e um controle não corado. Lave cada tubo com até quatro mililitros de tampão de classificação e centrifugue.
Em seguida, ressuspenda os pellets em tampão de triagem fresco de acordo com a idade dos animais. Em seguida, core as células com o corante de viabilidade. Para classificação de células antes da extração de RNA, imediatamente antes do início da classificação, cubra um tubo de coleta estéril de 1,5 mililitro com um mililitro de tampão de classificação contendo inibidor de RNAse.
Após cinco minutos, agite o tubo de coleta e remova o líquido. Vortex o primeiro controle de coloração e carregue o tubo no citômetro de fluxo para começar a determinar os parâmetros de classificação. Quando todos os parâmetros de classificação tiverem sido definidos, carregue as amostras e classifique as células em tubos de coleta de 1,5 mililitro.
Em seguida, colete as células classificadas por centrifugação. Aspirar o sobrenadante até ao sedimento e extrair o ARN de acordo com os protocolos de extracção de ARN normalizados. Aqui, todo o trato gastrointestinal isolado, incluindo estômago, baço, intestino e pâncreas de um embrião do dia 15,5 e um filhote do quarto dia pós-natal, são mostrados.
A análise por citometria de fluxo de células únicas de tecidos pancreáticos embrionários, neonatais e adultos isolados como acabamos de demonstrar revela que os tecidos pancreáticos transgênicos de todas as idades analisadas contêm populações distintas de células marcadas com YFP. Após a classificação, essas células mesenquimais podem ser cultivadas para estabelecer uma linha celular por pelo menos cinco passagens. Observe a morfologia fibrótica das células cultivadas típicas das células mesenquimais.
As células selecionadas expressam o marcador panmesenquimal vementina, conforme analisado por qPCR após extração de RNA e síntese de cDNA. Além disso, a expressão isolada do marcador de superfície celular pancreática indica que todas as células marcadas com fluorescência no pâncreas YFP transgênico expressam CD9, uma glicoproteína de superfície celular supostamente expressa por fibroblastos. Após este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento de RNA, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a expressão gênica das células mesenquimais.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para o isolamento de células mesenquimais pancreáticas a partir de tecidos de camundongos embriônicos, neonatais e adultos. A técnica permite a análise da expressão gênica e da secreção de proteínas, fornecendo informações sobre os sinais extrínsecos que influenciam o desenvolvimento do pâncreas e a tumorigênese.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Biologia do desenvolvimento
- Oncologia
Antecedentes
- Compreender o papel das células mesenquimais no desenvolvimento do pâncreas é fundamental.
- As células mesenquimais fornecem sinais extrínsecos que influenciam o desenvolvimento epitelial.
- O isolamento dessas células pode ampliar nosso conhecimento sobre a função pancreática e doenças relacionadas.
- Este método é aplicável a diversas fases de desenvolvimento em camundongos.
Objetivo do Estudo
- Isolar células mesenquimais pancreáticas para análise de genes e marcadores de superfície.
- Investigar os sinais expressos por células mesenquimais.
- Compreender como esses sinais influenciam o desenvolvimento epitelial.
Métodos Utilizados
- Coleta de tecidos pancreáticos de camundongos e digestão com um tampão.
- Filtração e separação de células usando citometria de fluxo.
- Coloração de células para viabilidade e marcadores de superfície.
- Extração de RNA para análises adicionais.
Resultados Principais
- Foram identificadas populações distintas de células mesenquimais marcadas com YFP em diferentes idades.
- As células classificadas exibiram morfologia típica de fibrose.
- Foi confirmada a expressão do marcador pan-mesenquimal vimentina.
- A expressão de CD9 foi observada em células marcadas fluorescentemente.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem confiável para o isolamento de células mesenquimais pancreáticas.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar estudos futuros sobre o desenvolvimento do pâncreas e a tumorigênese.
- Outras aplicações incluem sequenciamento de RNA para análise abrangente da expressão gênica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento e a análise precisos de células mesenquimais pancreáticas por citometria de fluxo permitem a investigação direcionada de sinais microambientais que regulam o desenvolvimento e as doenças do pâncreas. Essa capacidade apoia a desmistificação mecanicista e a validação de alvos para programas voltados à biologia pancreática, tumorigênese e medicina regenerativa. A integração desses fluxos de trabalho aumenta a confiança preditiva em pontos iniciais de descoberta e pré-clínicos ao longo dos portfólios de biotecnologia e farmacêutica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de sinais derivados de células mesenquimais que influenciam a diferenciação e a proliferação epitelial.
- Apóia a validação funcional de alvos ao isolar populações celulares para perfis de expressão gênica e proteica.
- Facilita a eliminação de riscos mecanicistas em vias candidatas implicadas no desenvolvimento e na doença do pâncreas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece populações celulares mesenquimais altamente enriquecidas e viáveis para o desenvolvimento de ensaios posteriores.
- Padroniza o isolamento e rotulagem celular para análise reprodutível por citometria de fluxo em diferentes estágios de desenvolvimento.
- Permite a avaliação quantitativa da expressão de marcadores de superfície para apoiar a preparação para triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha populações celulares isoladas com modelos relevantes para doenças, facilitando a descoberta translacional de biomarcadores.
- Garante continuidade do processo de descoberta até a validação pré-clínica, permitindo análises de RNA e proteínas.
- Reduz a ambiguidade biológica em modelos pré-clínicos ao esclarecer as contribuições do microambiente.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir o isolamento, a caracterização e a análise posterior de células mesenquimais pancreáticas desde as fases embrionárias até a fase adulta.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre interações mesenquimais-epiteliais e a elucidação de vias de sinalização.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis de citometria de fluxo para classificação celular baseada em marcadores.
- Análises: Fornece dados de expressão gênica e proteica para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta populações celulares isoladas a modelos de doenças para alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e escalonável para uso repetido em diferentes programas e estágios de desenvolvimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa pancreática.
- Valor Operacional: Oferece fluxos de trabalho padronizados, reprodutíveis e escaláveis de isolamento e análise celular.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir e a eficiência do capital ao esclarecer os fatores determinantes do microambiente.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos focados no pâncreas e no microambiente.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos, digestão enzimática e operação de citometria de fluxo.
- Exige acesso a citômetros de fluxo de alta qualidade e infraestrutura para classificação celular.
- Necessita de protocolos padronizados para marcação celular, avaliação de viabilidade e extração de RNA.
- Adaptável a modelos de camundongos embriónicos, neonatais e adultos, com ajustes nos protocolos.
- Depende da seleção e validação robustas de marcadores para o isolamento preciso das populações celulares.
