Isolando e analisando células do pâncreas Mesênquima por citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é isolar células mesenquimais pancreáticas para análise de expressão de marcadores genéticos e de superfície. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento do pâncreas, como quais pistas são expressas pelas células mesenquimais e como elas influenciam o desenvolvimento epitelial. As principais vantagens desta técnica são que ela é relativamente simples e rápida, e que permite um bom rendimento de células classificadas.

Comece depositando os órgãos internos em uma placa de cultura contendo HBSS e colocando a placa sob um microscópio estéreo. Separe o fígado e os rins para expor o pâncreas usando uma pinça fina para remover o pâncreas do estômago, duodeno e baço. À medida que cada pâncreas é coletado, transfira o tecido para um tubo cônico contendo tampão digestivo recém-preparado e coloque o tubo no gelo.

Quando todo o pâncreas tiver sido colhido, transfira os tecidos para um bloco de aquecimento a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação a 700 RPM, invertendo manualmente os tubos três a quatro vezes após 15 minutos. Se grandes pedaços de pâncreas ainda estiverem presentes após a primeira metade da digestão, inverta o tubo a cada cinco minutos nos últimos 15 minutos e incube o tecido por mais cinco a 10 minutos, conforme necessário. No final da digestão, coloque os tubos no gelo e adicione 10 mililitros de HBSS frio a cada amostra.

Colete as células por centrifugação e ressuspenda os pellets em dois mililitros de PBS fresco. Em seguida, filtre as células através de filtros de 35 mícrons em tubos de coleta de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros e lave os tubos de digestão com dois mililitros de PBS fresco, coando as lavagens em seus tubos de coleta correspondentes. Em seguida, centrifugue novamente as células e aspire cuidadosamente os sobrenadantes sem perturbar os pellets.

Ressuspenda as células em tampão de triagem de acordo com a idade dos animais e filtre-as através de novos filtros de células de 35 mícrons em novos tubos de coleta de cinco mililitros. Alíquota de volumes de 50 a 100 microlitros de células em novos tubos FACS para os controles de coloração, incluindo um tubo para cada fluoróforo, o corante de viabilidade, as proteínas fluorescentes e um controle não corado. Lave cada tubo com até quatro mililitros de tampão de classificação e centrifugue.

Em seguida, ressuspenda os pellets em tampão de triagem fresco de acordo com a idade dos animais. Em seguida, core as células com o corante de viabilidade. Para classificação de células antes da extração de RNA, imediatamente antes do início da classificação, cubra um tubo de coleta estéril de 1,5 mililitro com um mililitro de tampão de classificação contendo inibidor de RNAse.

Após cinco minutos, agite o tubo de coleta e remova o líquido. Vortex o primeiro controle de coloração e carregue o tubo no citômetro de fluxo para começar a determinar os parâmetros de classificação. Quando todos os parâmetros de classificação tiverem sido definidos, carregue as amostras e classifique as células em tubos de coleta de 1,5 mililitro.

Em seguida, colete as células classificadas por centrifugação. Aspirar o sobrenadante até ao sedimento e extrair o ARN de acordo com os protocolos de extracção de ARN normalizados. Aqui, todo o trato gastrointestinal isolado, incluindo estômago, baço, intestino e pâncreas de um embrião do dia 15,5 e um filhote do quarto dia pós-natal, são mostrados.

A análise por citometria de fluxo de células únicas de tecidos pancreáticos embrionários, neonatais e adultos isolados como acabamos de demonstrar revela que os tecidos pancreáticos transgênicos de todas as idades analisadas contêm populações distintas de células marcadas com YFP. Após a classificação, essas células mesenquimais podem ser cultivadas para estabelecer uma linha celular por pelo menos cinco passagens. Observe a morfologia fibrótica das células cultivadas típicas das células mesenquimais.

As células selecionadas expressam o marcador panmesenquimal vementina, conforme analisado por qPCR após extração de RNA e síntese de cDNA. Além disso, a expressão isolada do marcador de superfície celular pancreática indica que todas as células marcadas com fluorescência no pâncreas YFP transgênico expressam CD9, uma glicoproteína de superfície celular supostamente expressa por fibroblastos. Após este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento de RNA, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a expressão gênica das células mesenquimais.