Ensaio de triagem à base de SA-β-galactosidase para a identificação de medicamentos Senoterapêuticos

A senescência celular é o fator-chave no desenvolvimento de patologias crônicas relacionadas à idade. A identificação da terapêutica que visam as células senescentes mostra a promessa de estender o envelhecimento saudável. Aqui, nós apresentamos um ensaio novo à tela para a identificação do senotherapeutics baseado na medida da atividade associada da senescência β-galactosidase em únicas pilhas.

Descrevemos aqui pela primeira vez um método que permite a triagem de medicamentos de alto rendimento para compostos senoterapêuticos que têm se mostrado benéficos em doenças relacionadas ao envelhecimento. De fato, vários ensaios clínicos com medicamentos testados nesta essência estão em andamento. A principal vantagem desta técnica é distinguir entre dois tipos de drogas senoterapêuticas, senolíticos e senomórficos, usando a detecção bem estabelecida de SA-beta-Galactosidase em células senescentes.

Esta técnica é uma importante ferramenta de triagem para novos compostos senoterapêuticos. De fato, vários compostos que foram identificados com a ajuda desta tela são apresentados em várias publicações de alto perfil, e estão atualmente em teste clínico. Esta técnica é extremamente versátil, e pode ser adaptada a várias telas de alto rendimento.

Na verdade, é possível telas multiplex, e tela para compostos que suprimem a senescência através da ativação ou inibição de uma das várias vias. Pique cada embrião em pedaços de um milímetro e encose-o várias vezes. Em seguida, adicione 10 mililitros de crescimento médio aos tecidos de cada embrião.

Emplaque-os em um prato de cultura de 10 centímetros, e incubar a 37 graus Celsius em 3% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por dois a três dias. E incubar o resto de cada embrião com 0,25% de mistura EDTA de trippsina por 10 minutos. Para tentar experimentar as células, primeiro, remova cuidadosamente o meio de crescimento e lave as células com 10 mililitros de 1X PBS duas vezes.

Em seguida, adicione dois mililitros de uma solução EDTA de trippsina 025 às células, e incuba-os a 37 graus Celsius por dois a três minutos. Em seguida, inspecione as células sob um microscópio para garantir que as células sejam separadas da superfície. Adicione a mesma quantidade de meio de crescimento para terminar a digestão de trippsina e transfira as células para um tubo cônico.

Em seguida, centrifugar as células a 200 vezes G por três minutos. Descarte o supernasce e adicione meio de crescimento fresco para suspender as células. Em seguida, conte as células e semee as em novas placas na densidade celular projetada.

Para subcultivação não senescente, primeiro, células confluentes divididas em uma proporção de um para quatro. Em seguida, incubar células a 37 graus Celsius em 3% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono para estender para outra passagem. Em seguida, para induzir a senescência celular, as sementes dividem as células confluentes da passagem um a uma proporção de um a quatro e incubam-nas a 37 graus Celsius em 20% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por três dias.

Para monitorar a senescência celular, com um avançado sistema Coulter Cell Counter, meça o aumento gradual do diâmetro celular e do volume celular durante cada etapa de trypsinização. Para iniciar o ensaio de triagem beta-Gal, sementes 5.000 células senescentes ou 3.000 células não senescentes por poço em 96 placas de poço. Em seguida, adicione 100 microliters de crescimento médio a cada poço e incubar células a 37 graus Celsius e 20% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por seis horas.

Em seguida, adicione diluições de drogas às células MEF e incuba as células a 37 graus Celsius em 20% de oxigênio e 5% dióxido de carbono por 24 a 48 horas. Após a incubação, remova a solução de medicamentos e lave células com 100 microliters de 1X PBS. Para induzir a alcalinização lisesômica, pré-tratar células com 90 microlitadores de solução bafilomicina A1, diluídas em meio de cultura celular fresca em uma concentração final de 100 nanomolar.

Em seguida, incubar células a 37 graus Celsius em 20% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por uma hora. Para análise de fluorescência da atividade SA-beta-Gal, faça uma nova solução de trabalho de C12FDG diluída em meio de crescimento, em uma concentração final de 100 micromolar. Em seguida, adicione 10 microliters da solução de trabalho ao meio da cultura em uma concentração final de 10 micromolares, e incubar células a 37 graus Celsius em 20% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por duas horas.

Lave células com 100 microliters de 1X PBS. Em seguida, adicione dois microliters de um corante Hoechst 33342 de 100 microgramas por mililitro, a uma concentração final de dois microgramas por mililitro. Incubar as células a 37 graus Celsius, 20% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por 20 minutos.

Após a incubação, remova a mídia, adicione 100 microliters de meio de crescimento fresco e prossiga para a imagem. Neste estudo, uma plataforma de aquisição e análise de imagem fluorescente de alto teor permitiu a identificação de medicamentos senolíticos, como o 17-DMAG, que reduziu as atividades globais de SA-beta-Gal em culturas de células fibroblastos embrionárias murinas contendo células senescentes na passagem cinco. As análises quantitativas geradas pelo software de misturas de células senescentes e não senescentes permitem a demonstração clara de efeitos senescentes específicos das células, e a eliminação da atividade beta-galactosidase de fundo por bafilomicina A.Certifique-se de que todos os controles celulares necessários estão incluídos, especialmente células senescentes não tratadas e células senescentes tratadas com um controle positivo.

Este ensaio inclui trabalhar com células primárias sob estresse oxidativo, o que pode levar a variações que precisam ser monitoradas. Este procedimento é o primeiro passo na detecção de medicamentos senoterapêuticos. Viabilidade celular adicional e ensaios senescentes celulares precisam ser realizados para confirmar os resultados da triagem.

Várias novas drogas senolíticas foram detectadas usando este ensaio, incluindo a primeira combinação de drogas senolíticas dasatinib quercetin, inibidores de proteína de choque térmico 90, inibidores familiares Bcl-2, e a fisetina polifenol.