Um método sensível para quantificar células senescentes Câncer

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a senescência celular de forma rápida e sensível. Aqui demonstramos a utilidade deste método na triagem de fármacos quimioterápicos potenciais. Primeiro, induzir a senescência celular.

O fármaco quimioterápico doxorubicina é adicionado às células cancerígenas. Em seguida, Bain A um é aplicado para neutralizar o pH ácido dos lisossomos celulares. Então, o substrato permeável às células beta-galacto C 12 FDG é adicionado após a captação celular.

A FDG C 12 é hidrolisada e fluoresce. Uma vez que a beta-GCSE está enriquecida nos lisossomos de células senescentes, essas tornam-se mais fluorescentes do que as células não senescentes. Para quantificar a diferença na fluorescência, as células são analisadas em um citômetro de fluxo. A análise dos dados resultantes permite a quantificação da porcentagem de células cancerosas senescentes sob diferentes condições de tratamento.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o ensaio de beta-galactosidase, é que ela facilita a quantificação rápida e sensível de células senescentes. Na verdade, tivemos a ideia para este método ao enfrentar dificuldades na quantificação de células senescentes utilizando o ensaio de beta-galactosidase comumente empregado. Embora utilizemos esta técnica para detectar senescência em células cancerígenas, ela também pode ser usada em células normais.

Este método pode ajudar a responder rapidamente perguntas na área do câncer, como se uma droga quimioterápica induziu as células cancerígenas a sofrerem ESS, o que poderia promover a malignidade. Assim, essa técnica poderia, em última instância, ajudar a indicar novos tratamentos terapêuticos para o câncer. Em uma capela de exaustão química, dissolveu-se o pó de C12FDG em DMSO até uma concentração final de 20 milimolar, distribuindo alíquotas em tubos einor de 0,5 mililitro e armazenando a menos 80 graus Celsius.

O DMSO deve ser usado com as condições apropriadas de segurança e também deve-se dissolver o CIN A em pó em DMSO até uma concentração final de 0,1 milimolar. Aliquotar a solução em tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitro e armazená-los a menos 20 graus Celsius.

Observe que o CIN deve ser usado com as precauções de segurança apropriadas. Este procedimento pode ser realizado usando células aderentes ou não aderentes. Aqui, o procedimento é demonstrado utilizando a linhagem celular de mieloma humano RPMI 8 2 2 6.

Essas células crescem em suspensão; cultive as células RPMI 8 2 2 6 em meio contendo 10% de FBS e 1% de antibióticos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, 24 horas antes de realizar o experimento. Semeie as células em placas de seis poços para que estejam na fase log da curva de proliferação celular. No momento do experimento para determinar a porcentagem de células senescentes, serão necessárias três amostras celulares: células não tratadas e não coradas com ST, células não tratadas coradas com C 12 FDG e células tratadas coradas com C 12 FTG.

Para cada condição, é necessário um mínimo de cinco vezes 10 elevado à quinta células para citometria de fluxo induzida à senescência de células cancerígenas. Ao adicionar o fármaco quimioterápico doxorubicina, a concentração do fármaco e a duração do tratamento devem ser adaptadas ao tipo celular. Testado para células rpmi 8 2 2 6.

A senescência pode ser induzida tratando 10ª parte das seis células por mililitro com doxorrubicina 15 nanomolar por 48 horas. Não se esqueça de incluir uma amostra não tratada como controle negativo, incubada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. O tratamento com medicamentos quimioterápicos pode levar à apoptose celular.

Portanto, após dois dias, verifique a viabilidade celular pelo método de exclusão de azul de trian usando um hemocitômetro e um microscópio. Se a porcentagem de viabilidade for inferior a 70%, remova as células mortas utilizando um kit apropriado, como o kit de remoção de células mortas da Milton E, para garantir que as células mortas não interfiram na análise subsequente. Caso contrário, remova o meio de cultura centrifugando as células a 300 ×g durante cinco minutos.

Em seguida, após remover o sobrenadante, adicione meio de cultura fresco pré-aquecido contendo 100 nm de anom ou cin para neutralizar o pH ácido dos lisossomos e incube por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Dissolva o substrato beta-galacto C12 FDG em meio de cultura fresco pré-aquecido até uma concentração final de dois milimolares. Após a incubação com beilomicina.

Adicione C12 FDG diretamente às células e ao meio até uma concentração final de 33 micromolar. Incube por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, centrifugue as células a 300 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, lave as células duas vezes com PBS, centrifugando cada vez como antes e removendo o sobrenadante após a segunda lavagem. Ressuspenda o pellet celular em 500 microlitros de PBS frio e, em seguida, realize uma marcação co-imunológica para caracterizar melhor a população de células senescentes. Se você não tiver experiência com citometria de fluxo, o aspecto mais difícil deste procedimento será a realização da análise por citometria de fluxo.

Para garantir o sucesso, certifique-se de incluir os controles apropriados e procure assistência de uma pessoa inexperiente, conforme necessário. Antes de executar a primeira amostra, prepare um gráfico de dois parâmetros exibindo o canal de dispersão direta (FSC) versus o canal de dispersão lateral (SSC). Em seguida, execute a primeira amostra contendo células não marcadas.

Configure os tubos fotomultiplicadores ou PMTs e defina uma região de interesse, excluindo células mortas e detritos celulares que possam ter surgido durante o preparo da amostra. Esta região de interesse em um histograma de um único parâmetro exibe a fluorescência de C 12 FDG como FL1 no eixo X na escala logarítmica e o número de eventos no eixo Y. O número total de eventos representa a quantidade de células analisadas.

Configure o PMT de modo que as células não marcadas apareçam na primeira década na escala logarítmica do eixo x. Determine a autofluorescência das células, se necessário, executando as células não marcadas no fluxo. Execute no citômetro o segundo exemplo contendo células não tratadas no histograma de um parâmetro exibindo FL, posicionando o cursor após a população fracamente marcada.

Este limiar permitirá a discriminação entre células não senescentes, que são fracamente marcadas, e células senescentes, que são intensamente marcadas. Execute a terceira amostra contendo as células tratadas. As células senescentes intensamente marcadas aparecem acima do limiar determinado na etapa anterior.

Avalie a porcentagem de células senescentes dividindo o número de eventos brilhantes pelo número total de eventos, se necessário. A atividade da beta-galactosidase também pode ser estimada utilizando a intensidade média de fluorescência para avaliar a senescência induzida por um procedimento quimioterápico. A linhagem celular comercialmente disponível de mieloma múltiplo RPMI 8226 foi tratada por dois dias com doxorrubicina, uma droga quimioterápica, e analisada quanto à senescência conforme descrito neste vídeo; esses histogramas mostram a fluorescência das células não tratadas à esquerda e das células tratadas à direita.

Uma população de células intensamente marcadas, representando células senescentes, aparece na região V. Paralelamente, a mesma amostra celular foi corada utilizando o ensaio de beta-galactosidase. Nesta imagem representativa, são mostradas células totalmente azuis e parcialmente azuis para ilustrar a dificuldade em distinguir células senescentes verdadeiramente azuis. Para ilustrar a especificidade do C12FDG na determinação da porcentagem de células senescentes, as células também foram tratadas com várias concentrações de doxorrubicina.

O percentual de células senescentes foi determinado pela divisão do número de eventos brilhantes pelo número total de eventos. Os percentuais de células senescentes foram de 0,8%, 15,78% e 26,31% para doses de 5, 25 e 50 nanomolares de doxorrubicina, respectivamente. Isso demonstra que a marcação com C 12 FTG é específica para células senescentes.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar células senescentes em série ou não por citometria de fluxo, seguindo este procedimento em que métodos como marcação imunológica podem ser realizados para caracterizar células senescentes. Não se esqueça de que trabalhar com DMSO ou células cancerígenas pode ser extremamente perigoso. Precauções devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.