Um método sensível para quantificar células senescentes Câncer

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a senescência celular de forma rápida e sensível. Aqui demonstramos a utilidade desse método na triagem de possíveis drogas quimioterápicas. Primeiro a induzir a senescência celular.

A droga quimioterápica doxorrubicina é adicionada às células cancerígenas. Em seguida, Bain A one é aplicado para neutralizar o pH ácido dos lisossomos celulares. Em seguida, o substrato beta galacto de permeado celular C 12 FDG é adicionado após a captação celular.

O C 12 FDG é hidrolisado e fluorescente. Como os GCSEs beta são enriquecidos em lisossomos de células senescentes, eles se tornam mais fluorescentes do que as células não senescentes. Para quantificar a diferença na fluorescência, as células são executadas em um citômetro de fluxo A análise dos dados resultantes permite a quantificação da porcentagem de células cancerígenas senescentes sob diferentes condições de tratamento.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a beta galactose, é que ela facilita a quantificação rápida e sensível das células senescentes. Na verdade, primeiro adicionamos a ideia para esses métodos quando temos dificuldade em quantificar células senescentes usando o ensaio beta galactose comumente usado. Embora usemos essa técnica para detectar senescência em células cancerígenas, ela também pode ser usada em células normais.

Este método pode ajudar a responder a perguntas rápidas no campo do câncer, como se uma droga quimioterápica induziu células cancerígenas a sse, o que pode promover malignidade. Assim, essa técnica poderia ajudar a notificar novos tratamentos terapêuticos para o câncer. Trabalhando em uma capela de exaustão química, dissolveu o pó de C 12 FDG em DMSO até uma concentração final de 20 alíquotas milimolares em tubos einor de 0,5 mililitro e armazenou a 80 graus Celsius negativos.

O DMSO deve ser usado com condições de segurança adequadas, também se dissolver. CIN A um pó em DMSO até uma concentração final de 0,1. Eloqua milimolar a solução em tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitro e armazene-os a menos 20 graus Celsius.

Observe que o CIN deve ser usado com as devidas precauções de segurança. Este procedimento pode ser realizado usando células aderentes ou não aderentes. Aqui, o procedimento é demonstrado usando a linha celular de mieloma humano RPMI 8 2 2 6.

Essas células crescem em suspensão, cultivam RPMI 8 2 2 6 células em meio contendo 10% de FBS e 1% de antibióticos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono 24 horas antes de realizar o experimento, semeiam as células em seis placas de poços para que estejam na fase logarítmica da curva de proliferação celular. No momento do experimento para determinar a porcentagem de células senescentes, serão necessárias três amostras de células. Células não tratadas e não coradas com ST, células não tratadas coradas com C 12 FDG e células tratadas coradas com C 12 FTG.

Para cada condição, um mínimo de cinco vezes 10 para a quinta células são necessárias para a senescência induzida por citometria de fluxo de células cancerígenas. Ao adicionar o medicamento quimioterápico doxorrubicina, a concentração do medicamento e a duração do tratamento devem ser adaptadas ao tipo de célula. Testado para rpmi 8 2 2 6 células.

A senescência pode ser induzida tratando 10ª das seis células por mililitro com doxorrubicina 15 nanomolares por 48 horas. Não se esqueça de incluir a amostra não tratada como uma incubação de controle negativo a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. O tratamento com drogas quimioterápicas pode levar à apoptose celular.

Portanto, após dois dias, verificar a viabilidade celular por exclusão de azul trian usando hemo, citômetro e microscópio. Se a porcentagem de viabilidade for inferior a 70%, remova as células mortas usando um kit apropriado, como o kit de remoção de células mortas da Milton E, para garantir que as células mortas não influenciem a análise subsequente. Caso contrário, remova o meio de cultura girando as células a 300 GS por cinco minutos.

Em seguida, depois de remover o sobrenadante em meio de cultura fresco pré-aquecido contendo 100 anom ou cin, um para neutralizar o pH ácido dos lisossomos incubar por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, dissolver o beta galacto um substrato C 12 FDG em cultura fresca pré-guerra. Concentração média a final de dois milimolares. Após a incubação com beil micina.

Adicione C 12 FDG diretamente às células e meio até uma concentração final de 33. Incubar micromolar por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, centrifugue as células a 300 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, lave as células duas vezes com PBS girando para baixo a cada vez como antes e removendo o sobrenadante após a segunda lavagem. Resus suspende o pellet celular em 500 microlitros de PBS frio e, em seguida, realiza uma marcação imunológica para caracterizar ainda mais a população de células senescentes. Se você não tem experiência com citometria de fluxo, o aspecto mais difícil deste procedimento será realizar a análise de citometria de fluxo.

Para garantir o sucesso, certifique-se de incluir os controles apropriados e procure ajuda de uma pessoa inexperiente, conforme necessário. Antes de executar o primeiro exemplo, prepare um gráfico de dois parâmetros exibindo o canal de dispersão direta ou FSC versus o canal de dispersão lateral SSC. Em seguida, execute a primeira amostra contendo células não rotuladas.

Defina os tubos fotomultiplicadores ou PMTs e defina uma região de interesse, excluindo células mortas e detritos celulares que possam ter aparecido durante a porta de preparação da amostra. Esta região de interesse em um histograma de um parâmetro exibindo a fluorescência de C 12 FDG como FL um na escala logarítmica do eixo x e o número de eventos no eixo Y. O número total de eventos representa o número de células analisadas.

Defina o PMT para que as células não rotuladas apareçam na primeira década na escala logarítmica do eixo x. Determine a autofluorescência das células, se necessário, executando as células não marcadas no fluxo. O citômetro executa a segunda amostra contendo células não tratadas no histograma de um parâmetro exibindo FL um lugar no cursor após a população vagamente rotulada.

Este limite permitirá a discriminação entre células não senescentes, que são vagamente marcadas, e células senescentes, que são brilhantemente rotuladas. Execute a terceira amostra contendo células tratadas. Células senescentes marcadas com cores brilhantes aparecem acima do limite determinado na etapa anterior.

Avalie a porcentagem de células senescentes dividindo o número de eventos brilhantes pelo número total de eventos, se necessário. A atividade da beta galacto tase também pode ser estimada usando a intensidade média de fluorescência para avaliar a senescência induzida por um procedimento quimioterápico. A linha celular de mieloma múltiplo disponível comercialmente R RRP I 8 2 2 6 foi tratada por dois dias com doxorrubicina, um medicamento quimioterápico e ensaio para senescência conforme descrito neste vídeo, esses histogramas mostram a fluorescência de células não tratadas à esquerda e células tratadas à direita.

Uma população de células brilhantemente marcadas representando células senescentes aparece na região V.In paralelo, a mesma amostra de célula foi corada usando o ensaio beta galacto sase. Nesta imagem representativa, células inteiramente azuis e células parcialmente azuis são mostradas para ilustrar a dificuldade em distinguir células senescentes verdadeiramente azuis. Para ilustrar a especificidade do C 12 FDG na determinação da porcentagem de células senescentes, as células também foram tratadas com várias concentrações de doxorrubicina.

A porcentagem de células senescentes foi determinada dividindo-se o número de eventos brilhantes. De acordo com o número total de eventos, as porcentagens de células senescentes foram de 0,8%, 15,78% e 26,31% para uma dose de 5, 25 e 50 doxorrubicina nanomolar, respectivamente. Isso demonstra que a marcação de C 12 FTG é específica para células senescentes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar as células senescentes podem ser seriadas ou não por citometria de fluxo seguindo este procedimento de métodos como imunomarcação ser realizada para caracterizar células senescentes. Não se esqueça de que trabalhar com DMSO ou células cancerígenas pode ser extremamente perigoso. Precauções devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.