Name: Extração de cafeína, atividade enzimática e expressão gênica de cafeína sintase de suspensões celulares de planta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a extrair e quantificar cafeína em suspensões celulares de C. arabica L. e avaliar a atividade enzimática da cafeína sintase. Este método auxilia no estudo da biossíntese de cafeína em modelos vegetais in vitro.

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O trabalho do nosso laboratório foi financiado por uma concessão do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) para SMTHS. Esta pesquisa também foi apoiada por uma bolsa de estudos concedida a RJPK (n. º 37938) pelo CONACyT e o Sistema Nacional de Investigadores (4422). Os autores graças a CIATEJ para a utilização das suas instalações durante a escrita deste manuscrito. Agradecimentos especiais são estendidos ao Dr. Víctor Manuel González Mendoza para todas as recomendações na seção de biologia molecular e Valentín Rodríguez de Mendoza, IFC, UNAM para as instalações durante as filmagens deste artigo.

1. cafeína extração em suspensões celulares de c. arabica L.
<ol><li>Use o c. arabica célula suspensões9. Manter as suspensões por subculturas quinzenais em meio de Murashige e Skoog em pH 4.3 com constante 100 rpm agitando a 25 ° C, sob luz contínua (8,3 W/m2).</li>
	<li>Colha as células sob vácuo filtração utilizando papel de filtro 11 µm poro e um funil de Buchner.</li>
	<li>Registrar o peso fresco das células coletadas usando uma escala, embrulhe em papel alumínio, congelá-los em nitrogênio líquido e mantê-los a-80 ° C até análise.</li>
	<li>Lyophilize o material celular congelado por 72 h.</li>
	<li>Registar-se o peso das células liofilizados para estimar o rendimento de peso seco.</li>
	<li>Armazene o material em pó em sacos de polietileno reutilizáveis (9 x 7,5 cm). Macerar o material a um pó fino e armazenar num exsicador até o uso.</li>
	<li>Medem de 0,5 g de matéria seca de celular na balança analítica e adicioná-lo para um balão de vidro (25 mL).<ol>
<li>Adicionar 10 mL de acetona para as células liofilizadas e misturar em um misturador de vórtice para 30 s para homogeneização. Em seguida, feche o balão com folha de alumínio.</li>
		<li>Misture a 100 rpm usando um rotador à temperatura ambiente (25 ° C) por 5 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir todo o material para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar 13.000 x g por 10 min. transferência o líquido para um novo tubo de fase e reduzir a ele seca à temperatura ambiente na coifa.</li>
	<li>Resuspenda a amostra com 25 µ l de acetona.</li>
</ol>2. condições para a avaliação de cafeína por fina camada de cromatografia (TLC)-densitometria
<ol><li>Aplica 1 µ l do extrato de cafeína ressuspensão anteriormente à fase estacionária. Nota: placas de sílica gel (F254) são usadas como fase estacionária. Antes de aplicar as amostras, as placas foram desenvolvidas com 10 mL de clorofórmio-metanol [9:1 v/v] em uma câmara de cromatografia (14 x 12 cm x 9,5 cm), e as placas foram secas à temperatura ambiente. As características da placa de cromatografia em fase gasosa, onde as amostras são aplicadas são mostradas na Figura 1. A câmara estava saturada por 30 min com solvente antes de desenvolver a placa. Placas do TLC devem lidar com a utilização de luvas para evitar contaminação.</li>
	<li>Desenvolva o TLC na câmara de cromatografia com 10 mL de ciclo-hexano-acetona da fase móvel [40:50 v/v]. Nota: Esta mistura permite a separação de cafeína em um fator de retenção (Rf) de 0,34.<ol>
<li>Remover a placa de TLC da câmara e deixe secar completamente em temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualizar bandas de cafeína em luz ultravioleta de curto comprimento de onda (UV, 254 nm). Use uma lâmpada compacta de UV. Além disso, para esta etapa, uso óculos com proteção UV.</li>
	<li>Quantificar os níveis de cafeína por densitometria em 273 nm. O instrumento é controlado com software de cromatografia.</li>
</ol>3. ácido ribonucleico (RNA) isolamento
<ol><li>Leve as suspensões celulares da etapa 1.1 e vácuo filtrado com filtro de papel (tamanho de poro de 11 µm).</li>
	<li>Coletar o material celular do papel de filtro, pesar 0,5 g de material celular em uma balança analítica e embalá-lo em papel de alumínio. Congele a amostra com líquido N2.</li>
	<li>Macerar a amostra de células em um almofariz de porcelana com nitrogênio líquido e adicione 1 mL do reagente de isolamento de RNA até homogeneizado. Nota: Esterilize os morteiros de porcelana em um forno de mufla a 300 ° C para reagente de isolamento de 6 h. RNA contém fenol, isotiocianato de guanidina e outros componentes.<ol>
<li>Transferi 500 µ l da amostra para um tubo estéril microcentrifuga (1,5 mL). Adicione 300 µ l de álcool de clorofórmio-isoamílico (24:1) e 300 μL de fenol equilibrado (pH 8.0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misturar a amostra com um misturador do vortex e centrifugá-la a 20.000 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Transfira 300 μL da fase superior para um tubo de microcentrifugadora. Adicione 200 μL de isopropanol. Incubar o tubo para 1 h a-20 ° C.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e em seguida, decante a fase líquida.<ol>
<li>Adicione 1 mL de etanol (70%) para formar um pellet no tubo. Centrifugar a 12.000 x g por 10 min e decantar. Repita duas vezes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seca a amostra por 1,5 h em temperatura ambiente (25 ° C). Ressuspender o extrato de RNA com 25 μL de dietilo pyrocarbonate (DEPC)-água tratada. Nota: Para a extração de RNA, utilize água tratada com DEPC de 0,1% v/v.</li>
</ol>4. incubação de transcrição de RNA com desoxirribonuclease (DNase)
<ol><li>Em um tubo estéril microcentrifuga, adicione o extrato de 2 µ g de RNA total. Adicione 1 μL de tampão de reação 10 x (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1mm CaCl2). Adicione 1 μL de 1 U / µ l de DNase.<ol>
<li>Trazer a reação a um volume final de 10 μL com água tratada DEPC. Misture a amostra e centrifugar brevemente 2.000 x g por 1 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube a amostra a 37 ° C por 30 min.</li>
	<li>Parar a reação com a adição de 1 μL de 50mm dissódico dihidratado de tetrassódio (ND2EDTA) e incubar a amostra a 65 ° C por 10 min.</li>
	<li>Analise a integridade do RNA por eletroforese em gel de agarose.<ol>
<li>Preparar um gel de agarose 1% padrão e manchá-la com 1 µ l de 3x intercalante solução de mancha de ácido nucleico.</li>
		<li>Aplicar 500 ng do RNA para o agarose gel e funcione o gel.</li>
		<li>Visualize a integridade do RNA usando um sistema de documentação de foto do gel.</li>
		<li>Uso do RNA como modelo para a síntese do cDNA por transcriptase reversa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) síntese
<ol><li>Adicione 2,5 μg de RNA total para um tubo de microcentrifugadora. Adicionar 1 μL de primer oligo-deoxythymine (dT) e encha o tubo até um volume final de 13 μL com água livre de nuclease. Misturar a amostra e centrifugar um de 2.000 x g por 1 min.</li>
	<li>Incube a amostra a 65 ° C por 5 min e, em seguida, a 4 ° C por 2 min.</li>
	<li>Adicione 4 μL de 5 x reação buffer usado para transcriptase reversa, 2 μL de mistura de trifosfatos (dNTPs) deoxynucleotide (10 mM de cada dNTP) e 1 μL de transcriptase reversa (200 U / µ l). Misture delicadamente e centrifugar a 2.000 x g por 1 min.</li>
	<li>Incube a amostra a 45 ° C, durante 50 min e depois a 70 ° C por 10 min.</li>
	<li>Quantificar a concentração de cDNA usando um espectrofotômetro UV.</li>
	<li>Uso o cDNA como modelo para a reação em cadeia do polymerase (PCR). Nota: O amortecedor da reação foi usado como 10 x (etapa 4.1.1) e 5 x vezes concentraram (etapa 5.3), respectivamente.</li>
</ol>6. real-time PCR quantitativo (qPCR) para amplificar o Gene CCS1
<ol><li>Adicione 7,5 μL Taq DNA polimerase 2 x (0.1 U/mL) e 0,1 μm de 5-carboxy-X-rodamina (ROX) para um tubo de microcentrifugadora PCR. Nota: O começo quente Taq DNA polimerase 2 x foi usado como uma solução de 2 x concentrado.<ol>
<li>Adicione 5 μL de água livre de nuclease.</li>
		<li>Adicione 0,75 μL de 10 μM para diante e reverso da primeira demão para amplificar o gene CCS1 (AB086414) (para a frente: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' e inversa: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Use primers para tubulina como o gene domésticas em uma reação separado (para a frente: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' e inversa: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.</li>
		<li>Adicione 600 ng de cDNA modelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar a reação de amplificação a 50 ° C por 2 min e 95 ° C por 5 min. incubam a reação no sistema de PCR em tempo real para 40 ciclos de 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s.</li>
	<li>Incubar a amostra a 50 ° C por 30 s e 20 ° C, durante 10 s.</li>
	<li>Analise os dados com o software PCR.</li>
	<li>Calcular a expressão relativa pelo 2-ΔΔCT método descrito por Livak e Schmittgen (2001)12. Nota: Analise uma reação de controle que contém todos os componentes, exceto o modelo de DNA (sem controle de modelo, NTC) para descartar contaminado reagentes ou amplificação da primeira demão-dímeros.</li>
</ol>7. total extrato de proteína de suspensões celulares de c. arabica L.
<ol><li>Suspensões celulares sob vácuo com um papel de filtro médio-poro do filtro.</li>
	<li>Pesar 1 g de material celular e embalá-lo em papel de alumínio.<ol>
<li>Congele a amostra com nitrogênio líquido. Macerar a amostra em um almofariz de porcelana esterilizado para obter um pó fino.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir a amostra para um frasco de vidro e adicionar 2,5 mL de solução tampão (400 mM tris (hidroximetil) aminometano cloridrato (Tris-HCl), em pH 8,0, contendo 10 mM β-Mercaptoetanol, 5mm Na2EDTA e ascorbato de sódio 0,5% (p/v).<ol>
<li>Misture a amostra em um misturador de vórtice por 2 min. Nota: É importante que a amostra é mantida no gelo para evitar a desnaturação de proteínas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 20.000 x g por 20 min a 4 ° C e transferir 500 alíquotas µ l em frascos criogênicos (2 mL). Armazenar as amostras em-72 ° C até o uso.</li>
	<li>Medir a concentração de proteína da amostra em 562 nm num espectrofotómetro usando ácido ensaio bicinchoninic com albumina de soro bovino como padrão.</li>
</ol>8. ensaio enzimático para cafeína sintase
<ol><li>Prepare uma mistura de reação em um tubo de microcentrifugadora contendo 200 µM SAM, kBq 4,07 de metilo [3H]-SAM, teobromina µM 200, 200 µM MgCl2e cafeína 5 µM. Aumente o volume a 200 µ l com 100 mM Tris-HCl a um pH de 8,0.</li>
	<li>Mantenha o tubo microcentrifuga no gelo e adicionar um volume de fração solúvel, contendo 7-9 mg de proteína. Em seguida, misture por vórtex e incubar durante 30 min a 30 ° C em um banho termostático/circulador. Para um lote de várias amostras, incube cada amostra em duplicado em períodos de 1 min para dar tempo suficiente para parar as reações para todas as amostras em um período de tempo exato de 30 min.<ol>
<li>Adicione 1 mL de clorofórmio para parar a reação e, em seguida, agitar a amostra com um misturador do vortex. Agite a amostra usando um misturador do vortex para 3 min para remover a cafeína radioativa no solvente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 11.000 x g por 5 min e cuidadosamente recuperar um volume de 900 µ l. Em seguida, transferi as amostras para frascos de cintilação.</li>
	<li>Evaporar o clorofórmio para completar a secura do capuz em temperatura a 25 ° C. Adicionar 5 mL de líquido de cintilação para o frasco e misturar a amostra.</li>
	<li>Analise a radioatividade incorporada a cafeína em um contador de cintilação.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Apresentamos aqui as condições ideais para avaliar a conteúdo de cafeína, os níveis de atividade e transcrição de CS em um em vitro planta cultura de tecidos, tais como suspensões celulares de c. arabica. Relatórios anteriores confirmaram que mantém as células sob irradiação de luz e na presença de teobromina em meio de cultura são parâmetros adequados para aumentar o nível de cafeína, tornando possível a avaliação dos métodos de separação de cafeína usando a cromatografia líquida de alta performance de...

A cafeína é um metabólito secundário que é biossintetizados por plantas do gênero Coffea1. Este alcaloide pertence à família de methylxanthine e é considerado como uma defesa da planta química, porque ele pode agir contra os efeitos nocivos de patógenos e herbívoros de2,3. Além disso, este metabólito é responsável para as propriedades estimulantes da bebida café, que é comumente consumida em todo o mundo4,5. Devido a suas propriedades, diversos grupos de pesquisa estão interessados em estudar o caminho biossintético e catabolismo de cafeína6,7. Atualmente, a planta em vitro culturas de célula/tecido servem como uma alternativa para avaliar acúmulo de cafeína sob várias estratégias bióticos e abióticos8,9.
Biossíntese de cafeína envolve a liberação hidrolítica de 7-methylxanthine do correspondente nucleosídeo ribose seguido por ordenada de N-methylations nas posições 3 e 1. Um específico S- adenosilmetionina (SAM)-N-metiltransferase dependente (NMT) catalisa a metilação na posição 7, Considerando que a teobromina sintase (TS) e CS estão envolvidos na 3 - e 1-methylations, respectivamente, produzindo teobromina e cafeína. O estudo dos genes que codificam NMTs distintas permitiu compreender o mecanismo que regula a produção de cafeína10,11. CS, que tem N -metiltransferase atividade, catalisa as duas últimas etapas da via biossintética de cafeína11. Em mudas de árvores de café, ficou demonstrado que a radiação luminosa pode aumentar atividade CS, o que resulta em um aumento na biossíntese de cafeína. Recentemente, nós mostramos que a manutenção das suspensões celulares de c. arabica L. sob irradiação de luz é a condição ideal para avaliar os efeitos que produzem fatores de estresse abiótico que impactam o caminho biossintético de cafeína8. As informações obtidas nesses estudos podem ter aplicações em biologia de sistemas e engenharia metabólica para maximizar o estudo da via biossintética de cafeína em tais sistemas em vitro .
Dadas as vantagens de se obter um modelo adequado para o estudo da biossíntese de cafeína, nós aperfeiçoamos as condições de extração de cafeína em suspensões celulares de c. arabica L. Também foi possível desenvolver um protocolo útil para estudar a atividade enzimática, bem como os passos metodológicos para avaliação do nível de transcritos do gene de Coffea cafeína sintase 1 (CCS1) codificação desta enzima. Neste documento, nós relatamos um protocolo para extrair e quantificar a cafeína em suspensões celulares de c. arabica por cromatografia em camada delgada e densitometria (TLC-densitometria).

<table><tbody><tr><td>Murashige & Mistura de sal basal Skoog</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M524</td><td>Tamanho da embalagem: 50 L Reagente (mg/L) Nitrato de amônio (1650) Ácido bórico (6.2) Cloreto de cálcio, anidro (322.2) Cloreto de cobalto&bull; H2O (0.025) Sulfato Cúprico&bull; 5H2O (0,025) Na2EDTA&bull; 2H2O (37.26) Sulfato Ferroso&bull; 7H2O (27.8) Sulfato de Magnésio, Sulfato de Manganês Anidro (180.7) &bull; H2O (16,9) Ácido Molibdico (Sal de Sódio)&bull; 2H2O (0,25) Iodeto de Potássio (0,83) Nitrato de Potássio (1900) Fosfato de Potássio, Sulfato de Zinco Monobásico (170) &bull; 7H2O (8,6) Suplementado com ><<mio-inositol (100) tiamina (10) > cisteína (25) sacarose (30000) ácido 2,4-diclorofenoxiacético (3) 6-benzilamina purina (1)</td></tr><tr><td>Cafeína</td><td>SIGMA</td><td>C0750-5G</td><td>STANDARD-5g</td></tr><tr><td>Teobromina</td><td>SIGMA</td><td>T4500</td><td>20 g</td></tr><tr><td>CAMAG TLC Scanner-4</td><td>CAMAG</td><td>27.62</td><td></td></tr><tr><td>WinCATS Software Gerenciador de Cromatografia Planar</td><td>CAMAG</td><td>1.4.10</td><td>Software</td></tr><tr><td>Álcool isoamílico (24:1)</td><td>SIGMA</td><td>C-0549</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Ciclohexano</td><td>JALMEX</td><td>C4375-13</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>J.T. BAKER</td><td></td> 900643 <td>4 L</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T. BAKER</td><td>9093-03</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>JALMEX</td><td>C-4425-15</td><td>3,5 L</td></tr><tr><td>TLC sílica gel 60 F254</td><td>Merck</td><td>1,05554.0001</td><td>TLC placa</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>M6250</td><td>SIGMA</td><td>100 mL</td></tr> <tr><td>(+)-sódio L-ascorbato</td><td>A4034</td><td>SIGMA</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA</td><td>T6066</td><td>1 Kg</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico 36,5-38%</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo scientific</td><td>232227</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Metil [3H] -S-adenosil metionina</td><td>Perkin</td><td>Elmer NET155</td><td>Atividade específica de 15 Ci / mmol</td></tr><tr><td>Frascos de cintilação líquida</td><td>SIGMA</td><td>Z253081</td><td></td></tr><tr><td>Banho/circulador termostático</td><td>Cole Parmer</td><td>60714</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubo</td> <td>centrífugoEppendorf</td><td></td> Tubo de frascos criogênicos <td>de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Heathrow Scientific</td><td>HS23202A</td><td>Centrífuga de 2 mL</td><td></td></tr><tr><td>5804</td><td>Eppendorf</td><td>5804 000925</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Thermolyne</td><td>LR 5947</td><td></td></tr><tr><td>Argamassa de porcelana</td><td>Fisherbrand</td><td>FB961B</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>Z274844</td><td>Meio</td></tr> <tr><td>de porosidadePicofuge</td><td>Stratagene</td><td>400550</td><td>2000 x g</td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>E</td><td>HR-120</td><td>Modelo HR-120</td></tr><tr><td>Contador de cintilação</td><td>Beckman Coulter</td><td>6500</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de fotodocumentação em gel</td><td>Bio-Rad</td><td>Chemic XRS</td><td>Modelo Chemic XRS</td></tr><tr><td>Lâmpada UV compacta</td><td>UVP</td><td>95002112</td><td>UVGL-25</td></tr><tr><td>Scienceware HDPE Funil de Buchner</td><td>SIGMA</td><td>2419907</td><td>Tipo 37600 misturador</td></tr><tr><td>TRIzol reagente</td><td>Thermo scientific</td><td>15596-018</td><td>200 mL</td></tr><tr><td>ReverdAid Transcriptase</td><td>reversa Thermo scientific</td><td>#EP0441</td><td>10000 U</td></tr><tr><td>Oligo (dT)18 primer</td><td>Thermo scientific</td><td>#S0131</td><td>100 &micro; M</td></tr><tr><td>DNase I, livre de RNase</td><td>Thermo scientific</td><td>#EN0525</td><td>1000 U</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0525</td><td>1,25 mL</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0525</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>de mistura dNTP</td><td>Thermo scientific</td><td>R0191</td><td>R0191</td></tr><tr><td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo scientific</td><td>K0251</td><td>Para 200 reações de 25 &micro; L</td></tr><tr><td>PikoReal</td><td>Thermo scientific</td><td>2.2</td><td>Software</td></tr><tr><td>Fenol, pH 8.0, equilibrado, Grau de Biologia Molecular, Ultrapuro</td><td>USB</td><td>J75829</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Karal</td><td>2040</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Álcool etílico</td><td>SIGMA</td><td>64175</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Dietil pirocarbonato</td><td>SIGMA</td><td>D5758</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Rotador de laboratório</td><td>LW Científico</td><td>Mod. LW210</td><td></td></tr></tbody></table>

extração de cafeína, atividade enzimática e expressão gênica de cafeína sintase de suspensões celulares de planta

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

(1,3,7-trimethylxanthine) a cafeína é um alcaloide de Purina, presente em bebidas populares como café e chá. Este metabolito secundário é considerado como uma defesa química, porque tem atividade antimicrobiana e é considerado um inseticida natural. Cafeína também pode produzir efeitos alelopático negativos que impedem o crescimento das plantas circunvizinhas. Além disso, as pessoas ao redor do mundo consomem cafeína para seus efeitos analgésicos e estimulante. Devido ao interesse nas aplicações tecnológicas da cafeína, pesquisa sobre o caminho biossintético deste composto tem crescido. Estes estudos centraram-se principalmente na compreensão dos mecanismos bioquímicos e moleculares que regulam a biossíntese de cafeína. Cultura de tecidos in vitro tornou-se um sistema útil para estudar este caminho biossintético. Este artigo irá descrever um protocolo passo a passo para a quantificação de cafeína e para medir os níveis de transcrição do gene (CCS1) codificação cafeína sintase (CS) em suspensões celulares de c. arabica L., bem como a sua actividade.

Extratos de cafeína, obtidos através do processo aqui apresentado foram analisados por TLC-densitometria sujeitando as amostras para a placa de cromatografia de acordo com o esquema mostrado na Figura 1. Para quantificar os níveis de cafeína em extratos de células, uma curva com diferentes concentrações de padrão comercial para este composto foi usado (Figura 2A). O padrão de absorvância para cafeína foi analisado no espectro da ...

Este protocolo descreve uma metodologia eficiente para a extração e quantificação de cafeína em suspensões celulares de c. arabica L. e um processo experimental para avaliar a atividade enzimática da cafeína sintase com o nível de expressão de o gene que codifica esta enzima.

Extração de cafeína, atividade enzimática e expressão gênica de cafeína sintase de suspensões celulares de planta

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Este método pode ajudar a responder questões-chave nos campos de química analítica, bioquímica e biotecnologia. Tais como, quais são as mudanças que ocorrem na biossíntese da cafeína. A principal vantagem dessa técnica, é que ela pode ser aplicada a modelos de plantas invitro que produzem cafeína.Para começar, adicione 10 mililitros de acetona às células liofilizadas e sele o frasco antes de misturar com o misturador de vórtice por 30 segundos. Em seguida, misture a amostra a 100 rpm com um rotador por cinco horas em temperatura ambiente. Depois disso, suspenda a amostra com 25 microliters de acetona.Primeiro, aplique um microliter do extrato de cafeína previamente preparado nas placas de gel de sílica. Em seguida, desenvolva o TLC na câmara de cromatografia com 10 mililitros da fase móvel, acetona ciclohexana. Visualize as faixas de cafeína em ultravioleta de comprimento de onda curto, com uma lâmpada UV compacta.Depois disso, quantifique os níveis de cafeína por densitometria a 273 nanômetros. Utilizando papel filtro, filtro de vácuo a suspensão celular previamente preparada. Em seguida, use uma argamassa de porcelana para macerar a amostra celular, com nitrogênio líquido e reage

caffeine-extraction-enzymatic-activity-gene-expression-caffeine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Assaying Toxicidade β-amilóide utilizando um transgênico C. elegans Modelo

Nós descrevemos um baixo custo, o método de alto rendimento para a tela para a atividade endoglucanase fúngicas...

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Fonte: Rufián, J. S., et al. Análise de célula única da expressão dos genes de Pseudomonas syringae no tecido vegetal. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra um método para analisar a expressão gênica em bactérias patogênicas extraídas de plantas no nível de célula única, usando um fator de transcrição marcado fluorescente. A imagem confocal revela heterogeneidade na expressão gênica da virulência, destacando a diversidade funcional dentro de uma população bacteriana clonal.

Análise de Expressão Gênica de Células Únicas a partir de Patógenos Extraídos de Plantas

O relógio circadiano regula a cerca de um terço do transcriptoma de Arabidopsis, mas a percentagem de genes que se alimentam de volta para cronometragem permanece desconhecida. Aqui nós visualizamos um método para avaliar rapidamente os fenótipos circadianos em qualquer linha mutante de Arabidopsis utilizando imagens luminescentes de um repórter circadiano transitoriamente expressa em protoplastos.

Rápida análise de fenótipos circadianos em Arabidopsis Protoplastos transfectadas com um relógio Reporter luminescentes

Este artigo apresenta um método para a detecção e quantificação de ácidos orgânicos a partir de material vegetal, utilizando electroforese capilar de zona livre. Um exemplo do potencial aplicação do presente método, a determinação dos efeitos de uma fermentação secundária em níveis de ácidos orgânicos em sementes de café, é fornecida.

Usando Eletroforese Capilar para quantificar ácidos orgânicos a partir de tecido da planta: um caso de teste de exame<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Sementes

Competência metabólica de sistemas in vitro é um requisito chave para a biotransformação e disposição de drogas e substâncias tóxicas. Neste protocolo, descrevemos a aplicação de sondas metabólicas referência para avaliar metabolismo de fase I em culturas de células.

Espectrometria de Massa e abordagens baseadas no Luminogenic Caracterizar Fase I Metabolic Competência de<em&gt; In Vitro</em&gt; culturas de células

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Aqui, apresentamos um método para expressar e purificar S100A12 (calgranulina C). Descrevemos um protocolo para medir sua atividade antimicrobiana contra o patógeno humano H. pylori .

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Extração de cafeína, atividade enzimática e expressão gênica de cafeína sintase de suspensões celulares de planta

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