Ligação covalente de moléculas únicas para espectroscopia de força baseada em AFM

A espectroscopia de força de molécula única nos permite medir parâmetros físicos que descrevem as propriedades mecânicas e adesivas dos polímeros. Ao usar espectroscopia de força baseada em AFM para estudar moléculas únicas, é essencial ter um protocolo confiável e eficiente para ligar essas moléculas covalentemente a uma ponta de cantilever AFM. Este protocolo pode ser adotado para muitos polímeros diferentes, independentemente do comprimento do contorno ou hidroofobidade.

Todas as etapas devem ser realizadas em um capô de fumaça para evitar a inalação de vapores orgânicos. Além disso, são necessários vidros resistentes a solventes, jaleco e proteção ocular. Primeiro use pinças recém-limpas para colocar chips de cantilever AFM na câmara de plasma.

Inicie o programa de ativação da superfície da câmara de plasma selecionando o início e, em seguida, sim. Verifique se o processo de plasma está funcionando corretamente. Um processo de plasma com alto teor de oxigênio mostra uma cor azul clara.

Enquanto o programa de ativação da superfície está executando, dissolva silano-PEG-mal em tolueno para obter uma concentração de 1,25 miligramas por mililitro. Coloque três mililitros da solução em uma placa de Petri plana. Depois que o processo de plasma estiver concluído, ventile a câmara de plasma selecionando confirmar e, em seguida, ventilando.

Prossiga imediatamente para o próximo passo, a fim de evitar a absorção de contaminantes. Coloque as batatas na placa de Petri e incubar as batatas fritas por três horas a 60 graus Celsius. Retire a placa de Petri do forno e deixe esfriar por pelo menos 10 minutos.

Em seguida, enxague as fichas. Para a ligação PEG ou poliestireno, enxágue os chips com tolueno três vezes. Para a ligação de polinipâm, os chips devem ser enxaguados uma vez com tolueno e duas vezes com etanol.

Para reduzir o impacto das forças capilares no cantilever AFM, incline ligeiramente os chips ao enxaguar. Os chips de cantilever AFM precisam ser enxaguados adequadamente para remover qualquer excesso de polímeros físicos que possam influenciar o experimento. A lavagem deve ser realizada cuidadosamente para evitar qualquer dano às latas AFM.

Por fim, prepare pelo menos dois chips para servir como controles que não passarão por um acessório de polímero covalente. Para controles versus f PEG e chips de poliestireno, enxágue duas vezes com etanol e uma vez com água. Para controles versus chips de polinipam, enxágue duas vezes com água.

Para realizar a fixação covalente de PEG ou poliestireno, prepare três mililitros de solução de polímero em tolueno a uma concentração de 1,25 miligramas por mililitro. Adicione a solução e os chips a uma placa de Petri e incubar as lascas a 60 graus Celsius por uma hora. Após a incubação com PEG ou poliestireno, deixe os chips esfriarem por 10 minutos.

Enxágüe as lascas duas vezes com tolueno, duas com etanol e uma com água. Para realizar a fixação covalente de polinipam, prepare três mililitros de solução de polímero em etanol a uma concentração de 1,25 miligramas por mililitro. Adicione a solução e os chips a uma placa de Petri e incubar as lascas em temperatura ambiente por três horas.

Após a incubação com polinipam, enxágue os chips duas vezes com etanol e duas vezes com água. Para armazenar os chips até o uso em um experimento, coloque cada chip separadamente em uma placa de Petri de um mililitro cheia de água. Mantenha as placas de Petri a quatro graus Celsius.

Primeiro, insira o chip de cantilever AFM funcionalizado em um suporte de chip. Cole a superfície preparada em um suporte de amostra adequado para medições em líquido. Use uma pipeta para mergulhar o chip na água.

Monte a superfície da amostra no AFM. Mergulhe a superfície da amostra na água. Conecte o suporte do chip ao AFM.

Em seguida, aproxime-se do chip para a superfície da amostra. Use o painel ambiental para definir a temperatura alvo e mudar o modo e os botões de rádio de feedback para ligar. Em seguida, deixe o sistema equilibrar por cerca de 15 minutos.

Para pegar uma curva de extensão de força, aproxime-se da ponta de cantilever AFM à superfície e selecione uma única força. A curva resultante exibe a deflexão contra a distância piezo com a aproximação à superfície mostrada em vermelho e a retração mostrada em azul. Expanda a porção da curva que representa o recuo da ponta de cantilever AFM na superfície subjacente.

Para realizar um ajuste linear, defina os cursores na abordagem ou na curva de retração e selecione atualizar INVOLS no menu de contexto. O valor resultante para o valor inverso da sensibilidade da alavanca óptica aparece no painel no canto superior esquerdo. Depois de repetir este procedimento pelo menos cinco vezes, calcule uma média para sensibilidade da alavanca óptica inversa e digite a média no painel.

Posicione o cantilever AFM a uma altura de aproximadamente 100 micrômetros acima da superfície, selecionando mover-se para pré-engajamento. Para obter uma relação sinal-ruído satisfatória para o espectro de ruído térmico, defina a contagem média para pelo menos 10 e escolha a maior resolução de frequência possível. Em seguida, regise o espectro de ruído térmico selecionando dados térmicos de captura.

Para encaixar o espectro de ruído térmico com uma simples função oscilante harmônica, expanda a porção da curva representando o primeiro pico de ressonância. Em seguida, selecione o ajuste inicial. Por fim, refine o ajuste usando o botão de dados térmicos de ajuste.

A respectiva constante de força aparecerá no painel. Para começar a coletar os dados, defina os parâmetros para o experimento. Defina a velocidade de puxar para um micrômetro por segundo e force o gatilho para um nanonewton.

Aproxime-se da ponta de cantilever afmever à superfície e selecione uma força única para registrar uma única curva e determinar se os parâmetros precisam ser ajustados conforme descrito no manuscrito. Selecione o mapa F no painel mestre. Para obter um mapa de força com 100 curvas, defina o número de pontos de força e linhas de força para 10.

Comece a gravar o mapa de força selecionando o mapa do F. Faça curvas de extensão de força de forma semelhante à grade para evitar quaisquer efeitos de superfície locais e para áreas de superfície diferentes. Após o experimento, repita a determinação da sensibilidade da alavanca óptica inversa e da constante de mola para verificar a consistência e a estabilidade do sistema.

Polinídeos únicos e polímeros PEG foram covalentemente ligados a uma ponta de cantilever AFM em uma extremidade e fissículas na superfície do dióxido de silício na outra extremidade. Para medir o comportamento de alongamento dependente da temperatura, foi identificado um evento de alongamento de molécula única claro seguido de um máximo final no final da respectiva curva de extensão de força. Em seguida, uma única curva mestre foi gerada para cada temperatura.

Para o PEG, observou-se diminuição da força de alongamento com o aumento da temperatura. Para o polinpâmbo, observou-se tendência oposta. A desorção do poliestireno de uma superfície SAM na água pode ser usada para determinar a força e o comprimento da desorção.

Quando o acessório do polímero foi bem sucedido, as curvas de extensão de força mostraram platôs de força constante. Cada platô foi equipado com uma curva sigmoidal para determinar a força de desorção e o comprimento da desorção. As forças de desorção observadas corresponderam aos valores obtidos anteriormente.

Quando mais de um polímero ligado à ponta de cantilever AFM, cascatas de platôs foram observadas nas curvas de extensão da força. Com dois polímeros ligados, foi encontrada uma distribuição bimodal para o comprimento da desorção, enquanto a força de desorção mostrou uma distribuição estreita. Uma ponta de cantilever AFM funcionalizada pode ser usada para quantificar a resposta de força de moléculas únicas em um ambiente líquido e com estímulos externos.

O uso de equipamentos limpos, solventes, pontas de cantilever AFM e lavagem repetida é muito importante para atingir um alto nível de limpeza que deve ser confirmado antes dos experimentos controlados descritos. Os protocolos e procedimentos apresentados abriram caminho para uma melhor compreensão dos sistemas de polímeros responsivos de estímulos. Os resultados podem ser comparados diretamente com simulações dinâmicas moleculares.