Name: Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar Genes-alvo NFAT2 novela em leucemia linfocítica crônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprenda o ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar genes-alvo NFAT2 em leucemia linfocítica crônica. Este método permite detectar interações proteína-DNA e revelar mecanismos patogênicos para intervenções terapêuticas.

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Este trabalho foi apoiado pelo DFG conceder MU 3340/1-1 e a Deutsche Krebshilfe concedem 111134 (ambos premiados para M.R.M.). Agradecemos Elke Malenke pela excelente assistência técnica).

Todos os experimentos realizados com material humano foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade de Tübingen e escrito consentimento informado foi obtido de todos os pacientes que contribuíram amostras para este estudo.
1. isolamento e estimulação de Jurkat células
Nota: Para otimizar o protocolo, use a linha de células Jurkat que é conhecida por expressar os altos níveis de NFAT2. Todas as etapas são executadas sob uma capa de fluxo laminar.
<ol><li>Prepare 50 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% FCS e 1% penicilina/estreptomicina por aquecimento-37 ° c em banho-maria.</li>
	<li>Cultura de células Jurkat para 1-2-d em um frasco de cultura celular a 37 ° C e 5% CO2 em 20 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% FCS e 1% penicilina/estreptomicina para uma densidade de aproximadamente 2 x 106 células/mL (células são contadas com Trypan coloração azul e um Câmara de Neubauer ao microscópio) e colhê-las por centrifugação por 5 min a 200 x g.</li>
	<li>Remover o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender as células em 10 mL de RPMI 1640 suplementado com FCS de 10% e 1% penicilina/estreptomicina. Posteriormente, conte as células com uma coloração convencional trypan azul e uma câmara de Neubauer ao microscópio.</li>
	<li>Centrifugar as células da etapa 1.3 por 5 min a 200 x g e remover o sobrenadante por aspiração. Então, Ressuspender as células em uma densidade de 2 x 107 células/mL em RPMI 1640 suplementado com FCS de 10% e 1% penicilina/estreptomicina e transferência 1 mL em um novo tubo convencional de 5ml por pipetagem.</li>
	<li>Estimula as células, adicionando 32,4 nM phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) e ionomycin de 1 µM. Então, Incube as celulas para 16 h a 37 ° C e 5% CO2 com a tampa do tubo aberto (para evitar contaminação, um filme de vedação permeável ao ar pode ser usado).</li>
</ol>2. isolamento e estimulação das células CLL primário de pacientes humanos
Nota: As amostras dos pacientes foram adquiridas e estimuladas como descrito anteriormente,7. Todas as etapas são executadas sob uma capa de fluxo laminar.
<ol><li>Preparar o equipamento necessário para tirar o sangue dos pacientes e realizar uma separação de gradiente de densidade: 21-G agulhas, torniquete, NH4-heparina-sangue seringas de coleção (por exemplo, S-monovettes), 1X PBS e médio gradiente de densidade (densidade 1,077 g/mL) .</li>
	<li>Após punção venosa, atrair o sangue de pacientes CLL (ca. 40 mL sangue por paciente) para as seringas. Depois, transferi o sangue em tubos de Erlenmeyer de 50 mL. Lave a seringa com 10 mL de PBS e piscina no sangue-PBS-suspensão em tubos de 50 mL (ajustar o número de tubos para o volume de sangue).</li>
	<li>Prepare-se 15 mL do meio de gradiente de densidade em um tubo de cónico de 50 mL. Posteriormente, camada 35 mL de sangue-PBS-suspensão com cuidado no meio de gradiente de densidade. Para este fim, segure o tubo em um ângulo plano e pipetar lentamente a sangue-PBS-suspensão contra a parede do fundo do tubo cónico de 50 mL. Como mais da sangue-PBS-suspensão é acumular no tubo cónico de 50 mL, aumente o ângulo do tubo até um ângulo reto. Repita este passo de acordo com o volume de sangue-PBS-suspensão.</li>
	<li>Realizar a centrifugação a 560 x g por 20 min (sem freio) e, em seguida, extrair a fase de células mononucleares que contém as células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Para isso, coletar a interfase branca da separação de gradiente de densidade com uma pipeta sorológica 5ml e transferi-lo para um novo tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Enchem a suspensão de eritrócitos a 50 mL de PBS e centrifugar durante 5 min à 360 x g. Retire o sobrenadante por aspiração. Repita este passo com centrifugação por 5 min a 275 x g. Em seguida, juntar as células de um paciente em 5-10 mL de PBS em um tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Conte as células conforme descrito no ponto 1.3. Nota: Depende da proporção de células CLL os PBMCs isolados, se as células podem ser usadas diretamente para este procedimento ou um isolamento de célula B tem de ser realizado, por exemplo, através de célula magnética classificação (MACS). O isolamento de células B é recomendado, mas pode ser omitido se a proporção de células CLL é acima de 95% dos linfócitos totais (determinados através de citometria de fluxo). Pacientes de sangue de CLL é fixo e lysed de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, uma coloração com anticorpos CD19-FITC e CD5-PE é realizada de acordo com as instruções do fabricante e as células são analisadas através de citometria de fluxo. Uma paciente exemplar é mostrada na Figura 1, na qual a proporção de células CLL é 89.03%. Assim, um isolamento de célula B tem de ser realizada nesse paciente. A proporção de células de B fisiológicas é negligenciável (3.72% no exemplo).</li>
	<li>Lavar as células com 10 mL de pré-aquecido (37 ° C) RPMI 1640 suplementado com FCS de 10%, 1% penicilina/estreptomicina, 100 mM não aminoácidos essenciais, piruvato de sódio 1 mM e 50 mM β-Mercaptoetanol durante 5 min à x 200 g e remover o sobrenadante por aspiração.</li>
	<li>Ajuste as células a 2 x 107 células/mL em RPMI 1640 suplementado com FCS de 10%, 1% penicilina/estreptomicina, 100 mM não aminoácidos essenciais, 1mm de sódio piruvato e 50mm β-mercaptoetanol (37 ° C) e 1 mL de suspensão de células de preenchimento para um tubo de 5 mL. Nota: A ß-Mercaptoetanol é empregado para combater o stress oxidativo.</li>
	<li>Estimula as células, adicionando 32,4 nM PMA e ionomycin de 1 µM. Então, Incube as celulas para 16 h a 37 ° C e 5% CO2 com a tampa do tubo aberto (para evitar contaminação, um filme de vedação permeável ao ar pode ser usado). Nota: Para reduzir o nível de estresse, as células podem estar descansadas para 1 h a 37 ° C e 5% CO2 na incubadora antes a 16 h de estimulação.</li>
</ol>3. fixação, lise celular e cromatina tosquia
Nota: As amostras dos pacientes e células Jurkat fixas e lysed com um kit de ChIP comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante com modificações conforme descrito anteriormente,7. A fixação é realizada sob uma capa de fluxo laminar.
<ol><li>Prepare um tubo de 1,5 mL com 1 mL de formol 37%, um tubo de 1,5 mL com 1 mL de 1,25 M de glicina, um tubo de 5 mL com 4 mL de 1X PBS e uma caixa com gelo para a fixação das células.</li>
	<li>Após a estimulação das células para o tempo de incubação respectivos na etapa 1.5 ou 2.9, gire os tubos de 5ml a 200 x g por 5 min e ressuspender as células em 500 µ l de PBS em tubos de 5 mL.</li>
	<li>Adicione 340 formaldeído µM (13,5 µ l de 37% de formaldeído) para as células. Após a breve mistura cuidadosamente pipetando sobem e descem incube a suspensão para 2,5 min (células Jurkat) ou 5 min (amostra do paciente) à temperatura ambiente. Nota: Tempo de fixação prolongado é necessário para as células primárias assegurar o corte ideal.</li>
	<li>Adicionar glicina 125mm (57 µ l de 1,25 M glicina) para parar a fixação e incube por mais 5 min. Coloque as pilhas no gelo imediatamente depois e centrifugar 500 x g por 5 min a 4 ° C. Retire o sobrenadante por aspiração.</li>
	<li>Lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS gelado a 200 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante de cada vez por aspiração. Nota: Após a fixação, o protocolo pode ser pausado. Células fixas devem ser armazenadas a-80 ° C. Para testar, se o epítopo do anticorpo a intenção de usar o protocolo a seguir não é mascarado através de fixação, as amostras adicionais podem ser usadas para análise através de electroforese do gel de SDS-PAGE e Western blot. Essas etapas são executadas com 100 µ g de proteína de acordo com as instruções do fabricante. Todos os αNFAT2 de anticorpos são utilizados numa diluição de 1: 1000, o anticorpo GAPDH numa diluição de 1: 10000. Uma imagem exemplar de fixas amostras de células Jurkat com anticorpos adequados e inadequados é mostrada na Figura 2.</li>
	<li>Ressuspender as células em 5 mL de tampão de Lise comercialmente disponível 1 pipetando para cima e para baixo. Em seguida, colocar as amostras no gelo em uma coqueteleira e incube-os por 10 minutos agitando. Nota: Antes da lise, as células podem ser desintegradas por 10 s em nitrogênio líquido. Isto é útil para células Jurkat, mas deve ser evitado em amostras de pacientes primárias. Para a desintegração, coloque os tubos de 5 mL por 5 s em 5-10 mL de nitrogênio líquido em um recipiente específico. Use óculos de segurança e luvas de segurança adequadas.</li>
	<li>Posteriormente, centrifugar os tubos a 500 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante cuidadosamente por pipetagem.</li>
	<li>Homogeneizar as células em 5 mL de tampão de Lise comercialmente disponível 2 pipetando para cima e para baixo e incubar durante 10 min no gelo e agitando. Em seguida centrifugar os tubos a 500 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante cuidadosamente por pipetagem.</li>
	<li>Ressuspender as células em 500 µ l (células Jurkat) ou µ l 140 (amostras) de cisalhamento buffer 1 contendo 1 x inibidor da protease (5 µ l ou 1,4 µ l, respectivamente) e incubar a mistura durante 10 minutos no gelo.</li>
	<li>Para a tosquia de cromatina, transferi 140 µ l de suspensão de células da etapa 3,9 para tubos de sonicador (evitar produzir bolhas de ar e repita este passo se necessário devido ao volume de amostra). Coloque os tubos no ultrasonicador focado a uma temperatura de 7 ° C e de cisalhamento por 10 min (linha de celular) ou 7,5 min (amostras) com uma potência média de incidente de 9.375 W para obter fragmentos de DNA 200-500 bp.</li>
	<li>Finalmente, centrifugar a 15700 x g durante 10 minutos a 4 ° C, na pequena centrífuga e recolher o sobrenadante em um novo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Para testar o tamanho do fragmento apropriado, analise 20 µ l da cromatina cortada através do gel-eletroforese em gel de agarose 1,5% TBE. Uma imagem exemplar da cromatina distorcida de células Jurkat de boa e má qualidade é mostrada na Figura 3. Neste ponto, o protocolo pode ser potencialmente pausado. Cromatina cortada deve ser armazenada a-80 ° C.</li>
</ol>4. imunoprecipitação da cromatina
Nota: A imunoprecipitação da cromatina foi realizada com um kit de ChIP comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante com modificações7.
<ol><li>Calcular o número de moleculas (70 µ l (células Jurkat) ou 15 µ l (amostras) de cromatina cortada mais um anticorpo) e prepare-se 20 µ l de grânulos de proteína A revestido por precipitação em um tubo de 1,5 mL. Lave os grânulos em 40 µ l de tampão de ChIP 1 por precipitação 1x pipetando para cima e para baixo, deixe os grânulos descansar em um rack magnético para 1 min e retire o sobrenadante por pipetagem. Execute esta etapa quatro vezes no total. Eventualmente, resuspenda os grânulos do volume original com buffer de ChIP 1 x 1.</li>
	<li>Para a imunoprecipitação em si, use 10 µ g do anticorpo αNFAT2 (7A6) para capturar NFAT2 com suas sequências de destino vinculado. Use 2,5 µ g de um anticorpo de IgG de coelho (DA1E) como um controle de IgG. Prepare as reações em tubos fresca 1,5 mL conforme indicado na tabela 1. Nota: É importante o uso de um anticorpo monoclonal com alta afinidade cujo epítopo não é mascarado durante a fixação para este protocolo. Anticorpos policlonais de introduzir um nível adicional de variação tornando significativamente mais difícil interpretar adequadamente os resultados recebidos.</li>
	<li>Incube a mistura da etapa 4.2 durante a noite a 4 ° C em uma roda rotativa a 6 rpm.</li>
	<li>No próximo dia girar os tubos para 5 s a 7.000 x g na pequena centrífuga, incube-os em um rack magnético por 1 min e retire o sobrenadante por aspiração. Lave os grânulos uma vez com cada um dos buffers de lavagem 1, 2, 3 e 4, consecutivamente.</li>
	<li>Para fazer isso, resuspenda os grânulos em 350 µ l de tampão de lavagem e incube-os por 5 min a 4 ° C em uma roda rotativa a 6 rpm.</li>
	<li>Depois, gire os tubos para 5 s a 7000 x g na pequena centrífuga. Em seguida, colocá-los por 1 min em um rack magnético, remover o sobrenadante e adicionar o seguinte tampão de lavagem.</li>
	<li>Após a última etapa de lavagem, remover o sobrenadante por pipetagem, ocupam os grânulos em 100 µ l de tampão de eluição 1 e incube-os por 30 min em uma roda rotativa a 6 rpm.</li>
	<li>Girar os tubos em breve (5 s a 7000 x g na pequena centrífuga) e colocá-los em um rack magnético por 1 min.</li>
	<li>Em seguida, transferir o sobrenadante pipetando para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar 4 µ l de tampão de eluição 2.</li>
	<li>Para criar o controle de entrada, misture 1 µ l da cromatina cortada com 99 µ l de eluição buffer 1 e 4 µ l de tampão de eluição 2 (nesta instalação, existem três tubos por paciente: uma entrada de controle, um controle de IgG e uma amostra de αNFAT2).</li>
	<li>Incube as amostras por 4 h a 65 ° C e 1300 rpm em um agitador de tubo de 1,5 mL. Adicionar 100 µ l de isopropanol 100%, vórtice e girar as amostras para 5 s a 7000 x g na pequena centrífuga.</li>
	<li>Resuspenda as esferas magnéticas disponíveis completamente vortexing, adicionar 10 µ l dos grânulos para cada amostra e incubar por 1h à temperatura ambiente em uma roda rotativa a 6 rpm.</li>
	<li>Após a incubação, girar os tubos para 5 s a 7000 x g em pequenas centrifugue e colocá-los por 1 min em um rack magnético. Retire o sobrenadante por aspiração.</li>
	<li>Resuspenda as contas em 100 µ l de tampão de lavagem 1. Inverta os tubos para misturar e incubar durante 5 min à temperatura ambiente em uma roda rotativa a 6 rpm.</li>
	<li>Girar os tubos para 5 s a 7000 x g na pequena centrífuga, colocá-los por 1 min em um rack magnético e remover o sobrenadante por pipetagem. Repita as etapas 4.13-4.14 com tampão de lavagem 2.</li>
	<li>Posteriormente, remova o tampão de lavagem por aspiração, resuspenda os grânulos em 55 µ l de tampão de eluição e incube por 15 min à temperatura ambiente na roda rotativa a 6 rpm para Eluir o DNA precipitado. Finalmente, gire os tubos para 5 s a 7000 x g na pequena centrífuga, colocá-los por 1 min em um rack magnético e transferir o sobrenadante para novos tubos de 1,5 mL. Nota: Aqui o protocolo pode ser potencialmente pausado. O DNA eluted então deve ser armazenado a-20 ° C.</li>
</ol>5. detecção de genes-alvo NFAT nas células CLL.
<ol><li>Realizar a reação de qRT-PCR em duplicado para cada amostra, conforme indicado na tabela 2. Nota: Para a detecção de genes-alvo um PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) é realizado usando uma mistura de qRT-PCR comercialmente disponíveis com um instrumento de PCR em tempo real.</li>
	<li>Placas de 96 poços reação uso branco para as reações e o instrumento de RT-PCR. As condições de ciclismo são os seguintes: 95 ° C por 30 s, [95 ° C por 5 s, 60 ° C por 30 s] x 40 ciclos. Nota: Uma diluição serial da entrada (não diluído ou diluído 01:10, 1: 100 e 1: 1000 em água livre de nuclease) é usada para calcular o enriquecimento relativo. Nas células Jurkat, IL-2 foi usado como um controle positivo32. CD40L, um destino bem conhecido de NFAT2 nas células B, foi usado como controle positivo em células CLL e LCK como exemplo para um gene alvo romance de NFAT2 em CLL33,34. Os primers para região promotora CD40L, o Il-2 e LCK são descritos na tabela de equipamentos e reagentes específicos.</li>
</ol>6. normalização e análise de dados
Nota: Enriquecimento relativo para as regiões de promotor de interesse (IL-2, CD40L ou LCK) é calculado usando o IgG-controle para normalização.
<ol><li>Primeiro, determine valores de Ct (ciclo de limiar) para a diluição de entrada serial, o IL-2, CD40L e região promotora LCK através do software de avaliação de dados qRT-PCR.</li>
	<li>Defina uma curva padrão para as concentrações através da diluição serial da entrada. Com esta curva padrão Calcule a concentração para o IL-2, CD40L e região promotora LCK para cada duplicata de cada amostra.</li>
	<li>Em seguida, calcule a média das duplicatas. Em seguida, defina a amostra de imunoprecipitação de IgG como referência. Definir o enriquecimento relativo para esta amostra como 1.0 e comparar a outra amostra (a partir da imunoprecipitação de NFAT2) para essa referência.</li>
	<li>Finalmente, calcule o enriquecimento relativo dividindo a concentração das amostras pela concentração de referência IgG.</li>
</ol>

<ol><li>Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+Era+of+Targeted+Therapy+for+Chronic+Lymphocytic+Leukemia%3A+Impact+on+the+Practicing+Clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician.</a> Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).</li>
<li>Woyach, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+the+weak+%28signalers%29%3A+anergy+in+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Survival of the weak (signalers): anergy in CLL.</a> Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).</li>
<li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+diagnosis%2C+indications+for+treatment%2C+response+assessment+and+supportive+management+of+chronic+lymphocytic%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+calcium%2C+calcineurin%2C+and+NFAT%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT.</a> Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).</li>
<li>Macian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFAT+proteins%3A+key+regulators+of+T-cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).</li>
<li>Muller, M. R., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFAT%2C+immunity+and+cancer%3A+a+transcription+factor+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).</li>
<li>Marklin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFAT2+is+a+critical+regulator+of+the+anergic+phenotype+in+chronic+lymphocytic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia.</a> Nature Communications. 8 (1), 755(2017).</li>
<li>Geertz, M., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+strategies+for+studying+transcription+factor-DNA+binding+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).</li>
<li>Slattery, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+a+simple+code%3A+how+transcription+factors+read+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Absence of a simple code: how transcription factors read the genome.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).</li>
<li>Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+transcription+factor+synergism+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Investigating transcription factor synergism in humans.</a> DNA Research. , (2017).</li>
<li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Immunoprecipitation+Assay+as+a+Tool+for+Analyzing+Transcription+Factor+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity.</a> Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).</li>
<li>Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ChIP-seq+in+the+discovery+of+transcription+factor+binding+sites%2C+differential+gene+regulation+mechanism%2C+epigenetic+marks+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond.</a> Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).</li>
<li>Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+development+in+heterocyst-forming+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).</li>
<li>Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+MADS-box+genes+in+monocot+floral+development+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity.</a> Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).</li>
<li>Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+transcription+factor+UNC-130%2FFOXD+integrates+both+BMP+and+Notch+signaling+to+regulate+dorsoventral+patterning+of+the+C.+elegans+postembryonic+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm.</a> Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).</li>
<li>Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+POU%2FOct+Transcription+Factor+Nubbin+Controls+the+Balance+of+Intestinal+Stem+Cell+Maintenance+and+Differentiation+by+Isoform-Specific+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation.</a> Stem Cell Reports. , (2018).</li>
<li>Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pleiotropic+transcriptional+regulator+coup-tfi+plays+multiple+roles+in+neural+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease.</a> Brain Research. , (2018).</li>
<li>Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GATA+factors+in+development%2C+differentiation%2C+and+homeostasis+of+the+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium.</a> American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).</li>
<li>Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+transcription+factors+in+development%2C+differentiation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).</li>
<li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+role+of+Forkhead+box+O+4+transcription+factor+in+cancer%3A+bringing+out+the+good+or+the+bad%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad.</a> Seminars in Cancer Biology. , (2018).</li>
<li>Daniel, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+Activation+in+Neural+Stem+Cells+Drives+Tumorigenesis+which+can+be+Ameliorated+by+Targeting+the+cAMP+Response+Element+Binding+%28CREB%29+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein.</a> Neuro-Oncology. , (2018).</li>
<li>Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperforin+Suppresses+Tumor+Growth+and+NF-kappaB-mediated+Anti-apoptotic+and+Invasive+Potential+of+Non-small+Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer.</a> Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. , Wiley & sons. (1994).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+Analysis+of+Genome+Functions+Using+Locus-Specific+Chromatin+Immunoprecipitation+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Regulation+and+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies.</a> Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12893176">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+cellular+regulation+by+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of cellular regulation by protein degradation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).</li>
<li>Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+link+between+core+histone+acetylation+and+transcriptionally+active+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin.</a> EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).</li>
<li>Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+growth+response+protein+%28EGR-1%29+regulates+interleukin-2+transcription+by+synergistic+interaction+with+the+nuclear+factor+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).</li>
<li>Grammer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD40+ligand+expressed+by+human+B+cells+costimulates+B+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses.</a> Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).</li>
<li>Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+NF-kappaB+and+NFAT+activation+in+aggressive+B-cell+lymphomas+synergistically+activates+the+CD154+gene+and+maintains+lymphoma+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival.</a> Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).</li>
<li>Zhou, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acid-sensing+ion+channel%2C+ASIC2%2C+promotes+invasion+and+metastasis+of+colorectal+cancer+under+acidosis+by+activating+the+calcineurin%2FNFAT1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130(2017).</li>
<li>Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+calsequestrin+gene+transcription+is+modulated+at+the+promoter+by+NFAT+and+MEF-2+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors.</a> PloS One. 12 (9), e0184724(2017).</li>
<li>Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CacyBP%2FSIP+expression+by+NFAT1+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor.</a> Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).</li>
<li>Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-specific+binding+of+Rap1+revealed+by+genome-wide+maps+of+protein-DNA+association%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association.</a> Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li>
<li>Iyer, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+binding+sites+of+the+yeast+cell-cycle+transcription+factors+SBF+and+MBF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF.</a> Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li>
<li>Schmid, C. D., Bucher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+data+reveal+nucleosome+architecture+of+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters.</a> Cell. 131 (5), author reply 832-833 831-832 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os passos críticos da realização de um ensaio da microplaqueta bem-sucedida estão a seleção de um anticorpo adequado e a otimização da tosquia processo25a cromatina. A seleção do anticorpo αNFAT2 provou para ser particularmente desafiador durante o desenvolvimento do presente protocolo. Embora existam vários anticorpos αNFAT2 comercialmente disponíveis e a maioria destes funciona bem para a mancha ocidental e outras aplicações, clone 7A6 foi o único anticorpo que pode ser usado com sucesso para o ...

Leucemia linfocítica crônica (CLL) representa a leucemia mais comum em adultos nos países ocidentais, exibindo distinto acúmulo de CD5, CD23 e CD19 expressar B maduro células1. A maioria dos pacientes apresentam um curso de doença indolente, que não necessita tratamento específico por muitos anos. Pelo contrário, alguns pacientes mostram progressão rápida, que exigem intervenções terapêuticas imediatas com imune-quimioterapia ou outras terapias alvo2,3. Fator nuclear das células T ativadas (NFAT) é uma família de factores de transcrição, controlando vários no desenvolvimento e processos de ativação em numerosas células tipos4,5,6. Recentemente demonstramos superexpressão e ativação constitucional de NFAT2 nas células CLL de pacientes com doença indolente7. Aqui, regula um estado sem resposta à estimulação do receptor de células B chamado anergy7. Para demonstrar que o NFAT2 vincula-se à promotora linfócitos específicos da proteína tirosina quinase (LCK) e regula a expressão LCK em células humanas CLL, um ensaio de imunoprecipitação de cromatina específico (ChIP) foi desenvolvido e empregado.
ChIP é uma das várias técnicas para investigar o papel de factores de transcrição do gene expressão8. Expressão gênica é firmemente orquestrada de uma forma muito complexa por vários reguladores com fatores de transcrição, levando uma parte insubstituível deste processo9,10,11,12. Fatores de transcrição que regulam a expressão do gene em um contexto espacial e temporal foram identificadas em várias espécies (por exemplo, para o desenvolvimento e diferenciação)13,14,15, 16,17,18. Erros nos mecanismos de controle intrincadas envolvendo fatores de transcrição podem levar a uma variedade de processos patológicos, incluindo câncer19,20. Daí, identificação de fatores de transcrição e seus respectivos destinos pode oferecer novas avenidas terapêutico21,22. Para investigar este campo intrigante vários métodos estão disponíveis como ChIP, ensaio de turno de mobilidade electrophoretic (EMSA), vários ensaios suspensos de DNA e repórter-ensaios de11,8,12, 23 , 24.
Para demonstrar que um determinado fator de transcrição interage com regiões específicas do genoma in vivo ChIP é uma técnica ideal25. Para este efeito, DNA e proteínas associadas em células vivas são reticuladas utilizando irradiação UV ou formaldeído (ChIP reticulado, XChIP). Esta etapa é omitida para obter melhor DNA e proteína recuperação em nativo chamado ChIP (NChIP)26. Os complexos DNA-proteína são posteriormente cortados pelo sonication em fragmentos de aproximadamente 200-500 pares de bases (bp) e immunoprecipitated a partir dos escombros de célula, usando um anticorpo específico contra o fator de transcrição de interesse. Os fragmentos de DNA associados são então purificados e caracterizados por PCR, clonagem molecular e sequenciamento. Técnicas alternativas usam microarrays (ChIP-on-Chip) ou o sequenciamento de nova geração (ChIP-Seq) para analisar o DNA de immunoprecipitated.
Microplaqueta foi introduzido pela primeira vez por Gilmour e Lis em 1984 quando usaram UV e luz covalentemente ligação transversal DNA e ligado a proteínas na vida bactérias27. Após a lise celular e imunoprecipitação de bacteriana RNA polimerase, sondas específicas de genes conhecidos foram usadas para mapear a distribuição na vivo e densidade da RNA polimerase. O método foi posteriormente usado pelos mesmos investigadores para analisar a distribuição dos eucariota RNA polimerase II em genes de proteínas de choque térmico em Drosophila28. O ensaio de XChIP aperfeiçoado por Varshavsky e colegas de trabalho que primeiro usou o cross-linking para estudar a associação de histona H4 com calor choque proteína genes29,30de formaldeído. A abordagem NChIP, que leva a vantagem de uma melhor recuperação de DNA e proteína devido a epitopos naturalmente intactas e, portanto, maior especificidade do anticorpo, foi primeiramente descrito por Hebbes e colegas em 198831.
A vantagem do ChIP em comparação com outras técnicas para analisar interações da ADN-proteína na verdade, é que a interação real de um factor de transcrição pode ser investigado in vivo e sem sondas ou condições artificiais criadas pelos buffers ou géis empregado de11,8,12. Combinando o ChIP com o sequenciamento de nova geração, podem ser identificados múltiplos alvos simultaneamente.
Principais limitações desta técnica são a sua aplicabilidade limitada para ensaios em grande escala em organismos intactos25. A análise de padrões de expressão diferencial do gene também pode ser desafiador, usando técnicas de ChIP, se as respectivas proteínas são expressas somente em níveis baixos ou durante as janelas de tempo estreita. Outro fator potencialmente limitante é a disponibilidade de um anticorpo adequado adequado para o ChIP11.
O protocolo de ChIP aqui apresentado pode ser empregado para identificação de genes-alvo de um fator de transcrição na vivo por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Especificamente, o objetivo era identificar genes alvo romance de NFAT2 em CLL. Microplaqueta foi escolhida devido ao seu potencial para demonstrar diretamente a vinculação de NFAT2 para as regiões de promotor dos genes-alvo diferente em condições naturais no pacientes células CLL.

<table><tbody><tr><td>1 X PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL agitador de tubo Themomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>Pode ser substituído por instrumentos similares</td></tr><tr><td>10X Parafuso Agente Redutor de Amostra</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0009</td><td></td></tr><tr><td>20X Parafuso MES SDS Running Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0002</td><td></td></tr><tr><td>37 % Formaldeído p.a., ACS</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td></td></tr><tr><td>4X Parafuso LDS Amostra Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NFAT2 anticorpo</td><td>Alexis</td><td>1008505</td><td>Clone 7A6</td></tr><tr><td>Anti-NFAT2 anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>8032S</td><td>Clone D15F1</td></tr><tr><td>Anti-NFAT2 anticorpo ChIP Grau</td><td>Abcam</td><td>ab2796</td><td>Clone 7A6</td></tr><tr><td>grande Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Pode ser substituído por instrumentos semelhantes</td></tr><tr><td>Camundongo CD19-FITC Anti-humano</td><td>BD Biosciences</td><td>555412</td><td>Clone HIB19</td></tr><tr><td>CD5-PE camundongo Anti-humano CD5</td><td>BD Biosciences</td><td>555353</td><td>Clone UCHT2</td></tr><tr><td>Meio de gradiente de densidade Biocoll (Densidade 1.077 g/ml)</td><td>Merck</td><td>L 6115</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1,5 mL</td><td>eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior</td><td>Citômetro de Fluxo Merck</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>Pode ser substituído por instrumentos semelhantes</td></tr><tr><td>Halt Protease e Coquetel Inibidor de Fosfatase (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Dispositivo de Transferência de Gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Pilhas de Transferência, nitrocelulose, tamanho regular</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>IB23001</tr><tr><td>kit iDeal ChIp-seq para histonas</td><td>Diagenode</td><td>C01010059</td><td></td></tr><tr><td>sal de cálcio ionomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680LT Burro anti-coelho IgG (H + L), 0,5 mg</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68023</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Cabra anti-rato IgG (H + L), 0,1 mg</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Imagem Infravermelha LI-COR Odyssey</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>B446</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Placa Multipoços 96, branco</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>Pode ser substituído por outras placas em diferentes instrumentos de PCR em tempo real</td></tr><tr><td>Solução de lise OptiLyse B</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1400</td><td></td></tr><tr><td>M220 Água de grau AFA</td><td>Covaris</td><td>520101</td><td></td></tr><tr><td>M220 Ultrassônico focalizado</td><td>Covaris</td><td>500295</td><td></td></tr><tr><td>Rack magnético, DynaMag-15 Magnet</td><td>Thermo Scientific</td><td>12301D</td><td>Pode ser substituído por instrumentos semelhantes</td></tr><tr><td>Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM 100X</td><td>Thermo Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Axiovert 25</td><td>Zeiss</td><td>451200</td><td>Pode ser substituído por instrumentos semelhantes</td></tr><tr><td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer câmara de contagem melhorada</td><td>Karl Hecht GmbH & &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Co KG</td><td>40442012</td><td>Pode ser substituído por instrumentos semelhantes</td></tr><tr><td>NH4 Heparina Monovette</td><td>Sarstedt</td><td>02.1064</td><td></td></tr><tr><td>Água sem nuclease</td><td>Promega</td><td>P1193</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey&reg; Tampão de bloqueio (TBS) 500 mL</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina 100X</td><td>Merck</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td><td>Quanta Bio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Primer CD40L região promotora para a frente</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'- ACTCGGTGTTAGCCAGG-3'</td></tr><tr><td>Primer CD40L região promotora reversa</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3'</td></tr><tr><td>Iniciador IL-2 região promotora direta</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3'</td></tr><tr><td>Iniciador IL-2 região promotora reversa</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3'</td></tr><tr><td>Primer LCK promotor da região para a frente</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3'</td></tr><tr><td>Primer LCK região promotora reversa</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3'</td></tr><tr><td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td><td>Cell Signaling</td><td># 3900S</td><td>Clone DA1E</td></tr><tr><td>Instrumento de PCR em tempo real</td><td>Roche</td><td>LightCycler 480</td><td>Pode ser substituído por instrumentos semelhantes</td></tr><tr><td>Misturadores de rolos</td><td>Phoenix Instrument</td><td>RS-TR 5</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Suplemento</td><td>Thermo Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Safety-Multifly-needle 21G</td><td>Sarstedt</td><td>851638235</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Proteína Pré-corada Padrão</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Duomax 1030</td><td>Heidolph Instruments</td><td>543-32205-00</td><td>Pode ser substituído por instrumentos semelhantes</td></tr><tr><td>pequeno Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Fresco 17</td><td>Pode ser substituído por instrumentos semelhantes</td></tr><tr><td>Pyruvate de Sódio</td><td>Thermo Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td><td>Cell Signaling</td><td>#12498</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Azul de Tripano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar genes-alvo nfat2 novela em leucemia linfocítica crônica

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Leucemia linfocítica crônica (CLL) é caracterizada pela expansão dos clones de células malignas de B e representa a leucemia mais comum em países ocidentais. A maioria dos pacientes CLL mostra um curso indolente da doença, bem como um fenótipo anérgicas das suas células de leucemia, referindo-se a um receptor de células B não responde a estímulos externos. Nós recentemente têm mostrado que o fator de transcrição NFAT2 é um regulador essencial de anergy em CLL. Um grande desafio na análise do papel do fator de transcrição em diferentes doenças é a identificação de seus genes-alvo específicos. Isto é de grande importância para a elucidação dos mecanismos moleculares e possíveis intervenções terapêuticas. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma técnica clássica para demonstrar as interações proteína-ADN e pode, portanto, ser usada para identificar genes-alvo direto de fatores de transcrição em células de mamíferos. Aqui, o ChIP foi usado para identificar LCK como um gene alvo direto de NFAT2 em células humanas de CLL. DNA e proteínas associadas são quitosana utilizando formaldeído e posteriormente cortado pelo sonication em fragmentos de DNA de cerca de 200-500 de pares de bases (bp). Reticulado fragmentos de DNA associados com NFAT2 então são seletivamente immunoprecipitated de detritos celulares usando um anticorpo αNFAT2. Após a purificação, fragmentos de DNA associados são detectados através de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Sequências de DNA, com evidente enriquecimento representam regiões do genoma que são alvo de NFAT2 na vivo. Corte adequado de DNA e a seleção do anticorpo necessário são particularmente crucial para o sucesso da aplicação desse método. Este protocolo é ideal para a manifestação de interações diretas de NFAT2 com genes-alvo. Sua principal limitação é a dificuldade de empregar o ChIP em ensaios em grande escala, analisando os genes alvo de múltiplos fatores de transcrição em organismos intactos.

A Figura 1 mostra uma análise de citometria de fluxo exemplar de um paciente CLL realizada após coloração com anticorpos CD19-FITC e CD5-PE. Figura 1a mostra a retenção dos linfócitos, que representa a maioria das células no sangue de pacientes CLL. A Figura 1b mostra a proporção de CD19+/CD5+ CLL células, que representam 89.03% dos linfócitos, neste exemplo. A proporção de CD19...

Leucemia linfocítica crônica (CLL) é a leucemia mais comum no mundo ocidental. Fatores de transcrição NFAT são importantes reguladores do desenvolvimento e ativação em numerosos tipos de células. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) em células humanas de CLL identificar genes alvo romance de NFAT2.

Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar Genes-alvo NFAT2 novela em leucemia linfocítica crônica

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Esse método pode ajudar a fornecer informações-chave no campo da oncologia, como a identificação de genes-alvo putativos e mecanismos patogênicos para desenvolver possíveis intervenções terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que se pode detectar a interação de NFAT2 e outros fatores de transcrição com genes de destino conhecidos e novos. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão porque as condições ideais de fixação e desarquivamento são difíceis de estabelecer.Para começar a encher um tubo de 1,5 mililitro com um mililitro de 37% de formaldeído. Em seguida, encha outro tubo de 1,5 mililitro com um mililitro de 1,25 molar glycine em um tubo de cinco mililitros com quatro mililitros de PBS. Em seguida, após a estimulação das células giram as células de acordo com o protocolo de texto, e re-suspendem as células em 500 microliters de PBS e colocam o tubo em uma caixa cheia de gelo.Adicione 13,5 microliters de 37% de formaldeído às células e misture por pipetação para cima e para baixo. Em seguida, incubar a suspensão em temperatura ambiente. Depois disso, adicione 57 microliters de 1,25 glicina molar para parar a fixação.E deixe a suspensão incubar à temperatura am

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este protocolo descreve como imunoprecipitação da cromatina (chip) é usado para estudar as alterações dinâmicas ao modelo de cromatina que regulam a transcrição induzida por uma via de transdução de sinal.

Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

Este vídeo descreve o protocolo para cisalhamento da cromatina usando digestão enzimática de nuclease microcócica. O cisalhamento da cromatina é uma etapa essencial na imunoprecipitação da cromatina ou fluxo de trabalho ChIp, que ajuda a investigar a interação proteína-DNA em células de leucemia mielóide crônica humana. No protocolo de recurso, o cisalhamento da cromatina é realizado usando sonicação.

Cisalhamento da cromatina: um método para gerar fragmentos de cromatina usando digestão enzimática

Este vídeo descreve o protocolo para ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP), que é uma técnica clássica para demonstrar interações proteína-DNA. Esta técnica é usada para identificar genes-alvo em células de leucemia linfocítica crônica humana.

Ensaio de imunoprecipitação de cromatina: uma técnica para estudar interações proteína-DNA em células

Neste vídeo, demonstramos a técnica de imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação a proteínas em regiões específicas do DNA genômico de células precursoras de oligodendrócitos por meio da imunoprecipitação seletiva de fragmentos de cromatina ligados a proteínas. Este método ajuda a estudar a interação de várias proteínas reguladoras, incluindo fatores de transcrição envolvidos na regulação gênica.

Imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação de proteínas-alvo no DNA genômico

Nós descrevemos um método robusto para cromatina imunoprecipitação utilizando células T primárias. O método baseia-se em métodos normais, mas utiliza um conjunto específico de condições e reagentes que melhoram a eficiência de uma quantidade limitada de células. Importante, é apresentada uma descrição detalhada da fase de análise de dados.

Imunoprecipitação da Cromatina eficiente usando Limitando quantidades de biomassa

Aqui nós descrevemos um protocolo que os casais duas técnicas proteômicas, ou seja, 2-dimensional Eletroforese (2DE) e Espectrometria de Massa (MS), para identificar diferencialmente expressos / proteínas pós-traducionais modificados entre dois ou mais grupos de amostras primárias. Esta abordagem, em conjunto com ensaios funcionais, permite a identificação e caracterização de marcadores / alvos terapêuticos prognósticos.

A partir de um ponto 2DE-Gel para a função da proteína: lição aprendida com HS1 em leucemia linfocítica crônica

O protocolo descrito aqui representa um método fácil e reprodutível que emprega cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) para medir o metabolismo de purinas em células de leucemia linfocítica crônica (LLC) cultivadas em diferentes condições.

-HPLC baseado Ensaio para monitorar Extracelular Nucleotide / nucleosídeos Metabolismo em crônicas células de leucemia linfocítica Humanos

Este trabalho descreve um protocolo optimizado de sequenciação de domínio de ligação de metil-CpG (MBD) e uma tubagem computacional para identificar regiões ricas em CpG diferencialmente metiladas em pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL).

Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica

Aqui nós apresentamos um protocolo que visa analisar todo o genoma ligação do factor de transcrição do oligodendrocyte 2 (Olig2) em agudamente purificada oligodendrocyte precursor as células do cérebro (OPCs) através da realização de imunoprecipitação da cromatina de baixo-celular (ChIP) , preparação de biblioteca, elevado-throughput sequenciamento e análise de dados de bioinformatic.

Identificar Sites de Factor de transcrição Olig2 vinculação genômica em agudamente purificado PDGFRα + células por imunoprecipitação da cromatina Low-célula sequenciamento análise

Este protocolo permite a otimização e a geração eficiente subseqüente de frações nucleares e cytoplasmic das pilhas crônicas primárias da leucemia lymphocytic. Estas amostras são usadas para determinar a localização da proteína assim como mudanças no tráfico da proteína que acontecem entre os compartimentos nucleares e cytoplasmic em cima da estimulação da pilha e do tratamento da droga.

Fraccionamento subcelular de células crônicas primárias de leucemia linfocítica para monitorar o tráfico de proteínas nucleares/citoplasmáticas

Este manuscrito descreve um protocolo para preparar uma biblioteca ATAC-seq de neutrófilos da medula óssea murina, com o objetivo de garantir a viabilidade ideal dos neutrófilos e a alta qualidade da biblioteca. Ele oferece instruções passo a passo sobre a preparação do BMC, classificação imunomagnética e construção de bibliotecas, servindo como um guia valioso, especialmente para iniciantes no estudo de neutrófilos.

Biblioteca ATAC-Seq Preparação de neutrófilos derivados da medula óssea murina

Aprenda o ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar genes-alvo NFAT2 em leucemia linfocítica crônica. Este método permite detectar interações proteína-DNA e revelar mecanismos patogênicos para intervenções terapêuticas.

Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar Genes-alvo NFAT2 novela em leucemia linfocítica crônica

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