Imunoprecipitação da Cromatina eficiente usando Limitando quantidades de biomassa

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar a ligação de proteínas de ligação ao DNA, como fatores de transcrição, ou suas modificações de cálculo. Isso é conseguido preparando primeiro a cromatina como uma segunda etapa. Uma reação de imunoprecipitação de cromatina é configurada para puxar para baixo fragmentos de DNA ligados à proteína de interesse.

Em seguida, o fragmento de DNA ligado à proteína de interesse é amplificado por PCR. São obtidos resultados que mostram o enriquecimento dobrado do fragmento de DNA ligado à proteína de interesse em comparação com uma região não ligada com base na análise de QPCR. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da transcrição, cromatina e epigenética, como quando e onde diferentes proteínas modificadas ou não modificadas estão presentes.

No DNA Embora este método possa fornecer informações sobre a regulação do gene das células T. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como linfócitos B, amostras de leucemia e linhas de células imortalizadas. A cromatina para este experimento será preparada a partir de quatro células T CD ingênuas virgens de camundongo.

Para iniciar este procedimento, adicione 37% de formaldeído a uma concentração final de 1% à suspensão de células T CD quatro em DMEM e agite suavemente à temperatura ambiente por 15 minutos. Isso fará a reticulação dos complexos de proteínas do DNA. Pare a reticulação adicionando uma glicina molar a uma concentração final de 125 milimolar.

Continue a balançar por cinco minutos em temperatura ambiente. Coletar as células por centrifugação a 200 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em cinco mililitros de PBS gelado contendo inibidores de protease centrifugue novamente, lave as células desta forma por um total de três vezes após a lavagem final, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de tampão de lise celular gelado contendo inibidores de protease.

Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro e incube no gelo por 15 minutos. Coletar os núcleos por centrifugação a 200 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte cuidadosamente o sobrenadante ressuspendendo os núcleos em 500 microlitros de lise nuclear.

Tampão contendo inibidores de protease incubar no gelo por 15 minutos. Em seguida, sonicar as células usando uma sonda de 1,6 milímetro e um nível de saída de quatro sonicados por 15 segundos. Resfrie a amostra no gelo por um a dois minutos para evitar superaquecimento e sonice novamente por 15 segundos.

Repita a sonicação e o resfriamento por um total de quatro vezes a centrífuga, a cromatina sônica a 16.000 G por cinco minutos. Às quatro quatro graus Celsius. Recolha o sobrenadante límpido num novo tubo de microcentrífuga.

Remova uma alíquota de 20 microlitros de sobrenadante transparente. Adicione o corante de carga de DNA e verifique o DNA sonicado por eletroforese através de um gel 2% agro. O tamanho ideal do DNA sonicado para a maioria das aplicações é de 200 a 500 pares de bases.

Finalmente, determine a concentração de DNA usando um espectrofotômetro UV. A cromatina cisalhada pode ser usada imediatamente para estabelecer uma reação de imunoprecipitação da cromatina ou armazenada a 80 graus Celsius negativos para imunoprecipitação da cromatina ou cromatina sonicada diluída em chip para uma concentração de DNA de cinco a 10 microgramas por mililitro em um volume total de dois mililitros em tampão de diluição de chip com inibidores de protease. Todas as etapas deste procedimento devem ser realizadas de zero a quatro graus Celsius.

Economize 10%, que é 200 microlitros neste exemplo da cromatina sonicada diluída como armazenamento de entrada no gelo da alíquota de amostra restante de 450 microlitros em cada um dos quatro tubos de microview de 1,7 mililitro rotulados como controle de isotipo e anticorpo de interesse. Se forem utilizados vários anticorpos do mesmo isotipo, será suficiente um único controlo isotipo. Para realizar esta análise, adicione dois a cinco microgramas de anticorpo específico, dependendo da especificidade do anticorpo utilizado ou do controlo de isotipo, aos respetivos tubos. Balance os tubos durante a noite a quatro graus Celsius para permitir a formação de complexos de anticorpos de cromatina na manhã seguinte.

Adicione 25 microlitros de esferas magnéticas de proteína G a cada mistura e agite por pelo menos duas horas a quatro graus Celsius. Em seguida, coloque os tubos de fuga em um suporte magnético por 15 a 20 segundos para permitir que as contas se acumulem no lado magnetizado. Remova cuidadosamente a solução por aspiração sem perturbar as contas.

Adicione um mililitro de solução de lavagem com baixo teor de sal e agite suavemente por cinco minutos no mutador. Recolha as contas usando o suporte magnético e remova a solução de lavagem. Adicione um mililitro de solução de lavagem com baixo teor de sal novamente e agite suavemente por cinco minutos.

Depois de remover a solução de lavagem com baixo teor de sal, adicione um mililitro de solução de lavagem com alto teor de sal e agite por cinco minutos. Recolha as contas usando o suporte magnético e remova a solução de lavagem. Repita a lavagem com a solução de lavagem com alto teor de sal.

Depois de remover a solução de lavagem com alto teor de sal, adicione um mililitro de solução de lavagem de cloreto de lítio e agite por cinco minutos. Recolha as contas usando o suporte magnético e remova a solução de lavagem. Repita a lavagem com cloreto de lítio uma vez.

Adicione um mililitro de solução de TE e agite por cinco minutos. Recolha as contas usando o suporte magnético e remova a solução de lavagem. Eluir o DNA das contas adicionando 250 microlitros de rocha tampão eluciana por 15 minutos em temperatura ambiente.

Pipete o EIT e salve este material em um novo tubo de fuga de 1,7 milímetros. Repita mais uma vez e combine os dois elu, descarte as contas para inverter os elos transversais. Adicione ao DNA iludido cinco molares de cloreto de sódio a uma concentração final de 0,3 molar e um microlitro de RNAs.

A adicionar 400 microlitros de tampão de eluição às entradas salvas anteriormente. Para fazer o volume de 500 microlitros para cada entrada, adicione cloreto de sódio a 0,3 molar um microlitro de RNAs, um 10 microlitros de 0,5 molar EDTA 20 microlitros de um molar tris, HCL pH 6,5 e um microlitro de proteinase K.Sele os tubos e incube-os durante a noite a 65 graus Celsius em um bloco de aquecimento seco na manhã seguinte, Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente. Em seguida, adicione um mililitro de etanol 100% e incube por duas horas durante a noite a 80 graus Celsius negativos.

Para precipitar a centrífuga de DNA, os tubos a 16.000 G por 15 minutos. Para pellet a lavagem de DNA, o pellet de DNA uma vez com 70% de etanol e secar ao ar, o pellet ressuspende, o pellet de DNA em 100 microlitros de água destilada em autoclave, purificar o DNA usando caiaque, colunas de rotação rápida e eluir em um volume total de 50 microlitros tampão de eluição. Este DNA agora está pronto para uso para amplificação de PCR.

A análise das reservas de QPCR para obter enriquecimento total sobre uma região controle não ligada é o aspecto mais importante deste protocolo. Usando o software QPCR, vá para o editor e marque os poços contendo amostras de entrada de várias diluições com seus valores de curva padrão. Rotule também os poços com amostras de chips desconhecidas exatamente como a placa de PCR é disposta.

O uso de uma curva padrão para interpolar as quantidades de DNA nas amostras específicas e isotípicas desconhecidas permite a avaliação e correspondência da qualidade e eficiência de todos os conjuntos de primers na faixa de concentrações encontradas nas amostras. Vá para o editor de subconjuntos e marque os subconjuntos, incluindo os poços com amostras de entrada, bem como as amostras de chip desconhecidas. As amostras desconhecidas serão quantificadas usando a curva padrão gerada a partir das concentrações conhecidas de amostras de entrada para a análise.

Após a conclusão da amplificação por PCR, execute a análise com ABS quant. Segunda derivada máx. Selecione o subconjunto para análise e pressione. Okey.

Pressione calcular, que gerará a curva padrão usando as concentrações conhecidas de amostras de entrada e exibirá a quantidade absoluta de DNA presente nas amostras desconhecidas se a qualidade do DNA for boa e se os primers se ligarem especificamente à região alvo, a eficiência da PCR deve ser próxima de dois. Realize uma análise da curva de fusão com TM chamando o mesmo subconjunto, se disponível. Um único pico indica que apenas um produto específico foi amplificado.

A amplificação de DNA específico também pode ser testada por eletro o produto de PCR, juntamente com a escada de DNA através de um gel AROS. Os dados obtidos são então exportados como um arquivo de texto delimitado por tabulação, que pode ser aberto no Microsoft Excel para análise posterior. Divida a quantidade de DNA para o anticorpo específico com o controle de isotipo para primers direcionados.

Repita esta etapa para a região de controle Primers. Se vários anticorpos do mesmo isotipo forem usados para diferentes imunoprecipitações, normalize cada um deles com os valores do mesmo controle de isotipo. Além disso, se vários pares de primers direcionados forem usados, as quantidades de DNA de um único conjunto de reparo de primer de controle devem ser usadas para normalização de cada alvo.

Os valores de saída representam o enriquecimento de dobra de imunoprecipitação de anticorpos específicos em cada local em relação ao anticorpo inespecífico A imunoprecipitação de fundo divide o enriquecimento de dobras para primers direcionados com o enriquecimento de dobras para primers da região de controle para obter enriquecimento em relação a uma região de controle não ligada. É importante ressaltar que, devido à geração de curvas padrão com DNA de entrada total para cada amostra, cada um dos valores de imunoprecipitação interpolados do padrão já está normalizado e expresso como a fração da entrada total pelo software da máquina. O protocolo de imunoprecipitação da cromatina demonstrado aqui controla as diferenças, se houver, na quantidade de DNA usada na PCR por meio do uso de um par de primers que amplifica uma região não ligada do genoma, servindo assim como um controle de carga.

Neste exemplo, a região codificadora do gene beta actina de camundongo foi usada como uma região não ligada à proteína de interesse e o fator de transcrição e o local de ligação à gordura no camundongo, o promotor IL dois foi usado como região alvo. Este instantâneo de uma planilha do Excel mostra o uso do protocolo de cálculo descrito nos dados de análise de três repetições experimentais nas caixas coloridas de amarelo, verde e roxo com três réplicas técnicas. Cada um foi usado para calcular o enriquecimento de dobras.

O enriquecimento relativo de uma proteína ligada a diferentes regiões do genoma pode ser comparado se o mesmo conjunto de controle de isotipo e anticorpos específicos forem escolhidos. Se a especificidade do anticorpo for boa, normalmente observa-se um enriquecimento de duas a dez vezes na região de controle não ligada. Esta figura mostra os resultados de um experimento de chip com células T CD quatro convencionais e células T CD quatro reguladoras isoladas de camundongos.

Uma pequena fração de células T convencionais foi estimulada com PMA e micina iônica por 30 minutos. O enriquecimento relativo dos fatores de transcrição NFA, N fat C um e NFA C dois no promotor IL dois foi observado e é descrito aqui como enriquecimento de dobras sobre uma região não ligada Seguindo este procedimento. Outros métodos, como ChIP-seq, podem ser usados para abordar a ocupação global de fatores de transcrição ou mudanças globais em marcas epigenéticas em resposta a um estímulo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a imunoprecipitação da cromatina usando um número limitado de células e analisar os dados do QPCI para determinar a banda do fator de transcrição em comparação com uma região de controle não ligada.