Diferenciação de células-tronco nervosas por um One-Step Plasma atmosférico frio tratamento In Vitro

Este protocolo visa proporcionar detalhadas etapas experimentais de um tratamento de plasma frio atmosférico sobre células-tronco neurais e detecção de imunofluorescência para aprimoramento de diferenciação.

Este método tem o potencial de aumentar a diferenciação de células-tronco neurais in vitro e contribuir para o tratamento de doenças neurológicas como a doença de Parkinson. As principais vantagens desta técnica é que os plasmas atmosféricos frios podem ser aplicados em uma etapa para a diferenciação direcionada segura das células-tronco neurais para transplante de tecido. O plasma atmosférico frio pode aumentar a diferenciação de células-tronco neurais em um curto período de tratamento.

E com necessidade de mais danos às células, fornecendo as células desejadas para transplante. Comece semeando cerca de cinco vezes dez para o quinto tronco neural murino em um frasco quadrado de 25 centímetros. Contendo cinco mililitros de DMEM completos por dois a três dias a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono.

Quando as células atingirem 85% de confluência, lave a cultura com um mililitro de PBS. Antes do tratamento, com um mililitro de 25% de trippsina por um minuto. Quando as células se separaram, pare a reação com um mililitro de meio de cultura.

E pipeta várias vezes para gerar uma única suspensão celular. Após a contagem, dilui as células para duas vezes dez a quatro células por concentração mililitro. Semente um mililitro de células-tronco em um deslizamento de cobertura revestido de poli-D-lysina por poço em nove poços de uma placa de cultura de 12 células.

Verifique a densidade celular sob um microscópio. E devolva as células à incubadora por 12 horas. Quando as células tiverem sido anexadas, lave a tampa duas vezes com um mililitro de PBS por lavagem e trate as células com meio de diferenciação por 48 horas.

Para aquisição de jatos, primeiro conecte o fio de saída da fonte de alimentação ao dispositivo a jato de plasma. E a ponta da sonda de alta tensão com o fio de saída para detectar a tensão. Em seguida, conecte a outra extremidade da sonda de alta tensão ao osciloscópio para registrar as informações da tensão de saída.

Verifique todo o circuito para ter certeza de que a fonte de alimentação, o osciloscópio e a sonda de alta tensão estão todos aterrados. E verifique a linha de gás para ter certeza de que o tubo de gás está conectado ao dispositivo de jato de plasma. Em seguida, abra as válvulas de gás hélio e oxigênio e ajuste o fluxo de gás para uma proporção de um litro a 01 litros por minuto de hélio para oxigênio.

Verifique novamente o circuito e pressione o botão de saída para criar um jato de plasma. Para tratar plasma das células-tronco neurais, defina a distância entre o bocal da seringa e o primeiro poço de células para 15 milímetros. Substitua os supernacantes nas culturas de células-tronco neurais por 800 microliters de meio de diferenciação fresco.

E coloque a placa sob os jatos de plasma. Certificando-se de que o bocal da seringa está fixado sobre o centro de cada poço. Crie três poços com plasma por 60 segundos por tratamento, e três poços com um por cento de hélio e gás oxigênio por 60 segundos por tratamento.

Deixando três poços sem tratamento, como controles. Em seguida, substitua os supernacantes por um mililitro de meio de diferenciação fresco. E devolva as células à incubadora por seis dias.

Verifique o status de diferenciação dos diferentes grupos diariamente, sob um microscópio de luz de contraste de fase invertida. Após o tratamento, permitam que as células se equilibrem totalmente no meio da condição por cerca de uma hora antes de substituir o supernascedor por um meio de diferenciação fresco. Para análise de imunofluorescência, fixar as culturas com 500 microlitres de 4% de paraformaldeído por poço por 20 minutos à temperatura ambiente.

Seguido por três suaves cinco minutos de enxagua, com um mililitro de PBS por lavagem. Em seguida, permeabilize as amostras fixas com 2% triton X-100 em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente. Seguido por lavagem suave como demonstrado.

Após a última lavagem, bloqueie qualquer ligação não específica com um mililitro de 10% de soro de cabra em PBS por amostra durante uma hora em temperatura ambiente. No final da incubação, rotule as células em cada poço com 300 microliters do anticorpo primário de interesse durante a noite a quatro graus celsius. Seguido por três lavagens na PBS como demonstrado.

Após a última lavagem, rotule as células com 300 microliters dos anticorpos secundários apropriados. Incubar por duas horas em temperatura ambiente, protegido da luz. Em seguida, enxágüe as células suavemente com um mililitro de PBS por poço por dez minutos em temperatura ambiente.

Imagem das células em um microscópio de fluorescência equipado com os filtros apropriados. As células-tronco neurais tratadas com plasma apresentam uma taxa de diferenciação acelerada, e uma maior taxa de diferenciação em comparação com o controle não tratado, e células-tronco tratadas com fluxo de gás. Após o tratamento plasmápico, Nestin diminui.

Beta-Tubulin III aumenta significativamente. E o O4 aumenta ligeiramente, comparado ao controle tratado e ao fluxo de gás das células-tronco tratadas. Além disso, após 60 segundos de tratamento plasmápico, observa-se uma expressão robusta de neurônio maduro, neurônio colinérgico e marcadores de neurônios motores.

Com pouquíssimos neurônios gabaérgicos e serotonérgicos, e nenhum neurônio dopaminérgico detectado. Ao tentar esses procedimentos, é importante lembrar, tratar as células com dosagem plasmática adequada, pois um longo e intenso período de tratamento plasmológico induzirá apoptose celular ou necrose. Lembre-se também de testar também a viabilidade celular antes da aplicação a jusante.