Name: Diferenciação de células-tronco nervosas por um One-Step Plasma atmosférico frio tratamento In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco neurais murinas usando plasma atmosférico frio em um único passo. Este método seguro acelera a diferenciação celular para aplicações em medicina regenerativa e tratamento de doenças neurológicas como o Parkinson.

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Este trabalho foi financiado pelo programa de estudioso de Huazhong, o fundo de inovação independente de Huazhong Universidade de ciência e tecnologia (n º 2018KFYYXJJ071) e a Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. 31501099 e 51707012).

1. culturas e Predifferentiation de pilha
<ol><li>
Predifferentiation e cultura de células-tronco neurais
	<ol>
<li>Prepare as lamelas de poli-D-lisina-revestido. Colocar uma lamínula estéril (20 mm de diâmetro) em uma placa de 12. Cubra o tampa de vidro com poli-D-lisina, 0,1% w/v, em água (Tabela de materiais) para uma melhor aderência da célula sobre as lamelas, seguindo os próximos passos. Nota: Condições ideais devem ser determinadas para cada linhagem celular e aplicativo.<ol>
<li>Assepticamente revesti a superfície da lamela com poli-D-lisina, 0,1% w/v, na água. Rocha suavemente para garantir um mesmo revestimento da superfície da lamela.</li>
			<li>Depois de cultivo durante a noite (~ 12 h) a 37 ° C, retirar a solução D-poli-lisina e enxaguar a superfície 3 x com 1 mL de água estéril.</li>
			<li>Seque a células pelo menos 30 min antes da semeadura-los.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Predifferentiation e cultura de células-tronco neurais murino C17.2 (C17.2-NSC)
	<ol>
<li>Incube C17.2-NSCs num balão de2 25 cm no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 5% de soro de cavalo (HS) e 1% penicilina/estreptomicina em 37 ° C e 5% CO2 para d ~ 2-3.</li>
		<li>Quando as células chegam a confluência de 85%, remover o meio, lavar as células com 1 mL de PBS e adicione 1 mL de tripsina fresca (0,25%) para o balão. Deixe-o por 1 min; em seguida, adicione 1 mL de meio de cultura para o balão e a pipeta subindo e descendo várias vezes para assegurar uma suspensão de célula única.</li>
		<li>Conte a densidade das células em suspensão usando um hemocytometer. Calcule o volume necessário de suspensão de células para dar uma concentração celular final de 2 x 104 células/mL.</li>
		<li>Semente do C17.2-NSCs sobre as lamelas revestidas na placa de 12 com a densidade de ~ 2 x 104 células por poço. Verifique a densidade celular sob um microscópio. Nota: Para um melhor resultado, a densidade celular ideal deve ser determinada antes do experimento de imunofluorescência.</li>
		<li>Incube as células a 37 ° C numa incubadora de célula para 12 h permitir a fixação.</li>
		<li>Após a fixação, lavar as células 2 x com 1 mL de PBS e cultivar as células com o meio de diferenciação, composto por DMEM/F12 com suplemento 1% N2 para 48 h antes do tratamento de plasma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Predifferentiation e cultura de células-tronco neurais de rato primário
	<ol>
<li>Cultura da suspensão primária rato NSC em meio de crescimento rato NSC em frascos de T25 não revestidos em uma densidade de 5 x 105 células. Nota: O rato primário NSCs foram isoladas seguindo o protocolo de Xie et al . 9.</li>
		<li>Verifica a formação de neurospheres sob um microscópio invertido. Certifique-se que a morfologia do neurospheres exibe complexos multicelulares esféricos e transparentes.</li>
		<li>Quando os neurospheres atingir um diâmetro de 3 mm ou maiores, transferir a suspensão de neurosphere para um tubo de centrífuga estéril 15 mL e deixe os neurospheres resolver pela gravidade.</li>
		<li>Remova o sobrenadante cuidadosamente para deixar o neurospheres em um volume mínimo de meio.</li>
		<li>Enxágue o neurospheres 1 x 5 ml de PBS e deixar os neurospheres resolver pela gravidade. Remova o sobrenadante para deixar um volume mínimo de PBS.</li>
		<li>Adicione um volume adequado de meio de diferenciação para ajustar a densidade celular para ~ 12-15 neurospheres por mililitro. O meio de diferenciação primária rato NSCs é composto por DMEM/F12, 2% B27 e 1% FBS.</li>
		<li>Semente de 1 mL de suspensão de neurosphere em cada lamela revestida na placa de 12. Nota: Agite a placa com cuidado para assegurar que os neurospheres são distribuídos uniformemente. Esta etapa é fundamental para um melhor resultado de imunofluorescência.</li>
		<li>Coloque a placa na incubadora e permitir que predifferentiate por 24 h antes do tratamento de plasma.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação do Plasma jatos
<ol><li>Escolha um tubo de quartzo semi-aberto com diâmetro interno de 2 mm e diâmetro externo de 4 mm... colocar um fio de alta tensão com um diâmetro de 2 mm no tubo.</li>
	<li>Inserir o tubo de quartzo com o fio de alta tensão em uma seringa de 5 mL e usar um suporte para montá-la dentro do centro da seringa. Defina a distância entre a extremidade selada do tubo de quartzo e a ponta da seringa a 1 cm.</li>
	<li>Conectar um tubo de borracha de silicone de 1 m (com um diâmetro interno de 12 mm) para a extremidade aberta da seringa e, em seguida, conectá-lo à válvula do medidor de vazão e gás em sequência.</li>
</ol>3. aquisição dos jatos
<ol><li>Ligue o circuito conforme mostrado na Figura 1. Ligue o fio de saída da fonte de alimentação para o dispositivo de jato de plasma e, em seguida, conecte a ponta da sonda alta tensão com o fio de saída para detectar a tensão. Conecte a outra extremidade da sonda alta tensão para o osciloscópio para gravar as informações da tensão de saída. Verifique o circuito inteiro e certifique-se de que fonte de alimentação, osciloscópio e a sonda de alta tensão são todos de castigo.</li>
	<li>Verifique a linha de gás. Certifique-se de que o tubo de gás foi conectado ao dispositivo de jato de plasma; em seguida, abra a válvula de gás do hélio (fração de volume, 99.999%) e oxigênio (fração de volume, 99.999%) e definir o fluxo de gás para 1 L:0.01 L/min (: O2). Nota: Deixe o fluxo de gás por vários minutos antes de ligar a fonte de alimentação, pela primeira vez.</li>
	<li>Definir a largura de pulso, frequência e amplitude de pulso como 8 kV, 8kHz e ns 1600, respectivamente. Verifique o circuito novamente e, em seguida, ligue o botão de saída para criar um jato de plasma. Cuidado: Não toque no fio de alta tensão a qualquer momento.</li>
</ol>4. plasma tratamento de células-tronco neurais
<ol><li>Defina a distância entre o bico da seringa e o buraco bem célula a 15 mm. Nota: A distância é medida do fundo da plataforma onde a placa de 12 é colocada.</li>
	<li>Pegar a placa de 12 fora da incubadora e alterar o meio das células predifferentiated para 800 µ l de meio fresco de diferenciação.</li>
	<li>Dividir as células em três grupos: um grupo controle não tratado, um 60 s-e-O2 (% 1) gás fluxo tratamento do grupo e um grupo de tratamento de plasma s 60. Nota: Não há nenhuma perda líquida óbvia sob a condição de tratamento.</li>
	<li>Colocar a placa de 12 poços sob os jatos de plasma, certifique-se de que o bico da seringa é fixo no centro de cada furo e dar o tratamento para os diferentes grupos mencionados no passo 4.3. Nota: Os controles não tratados foram mantidos em meio de diferenciação à temperatura ambiente durante o procedimento experimental para garantir condições de tratamento uniforme. Grupo de tratamento do fluxo de gás de2 (1%)-e-O foi tratado com apenas um ele e O fluxo de gás2 (1%), sem geração de plasma. Todos os tratamentos devem ser executados em triplicado.</li>
</ol>5. diferenciação de células-tronco neural
<ol><li>Após o tratamento, remover a cultura original e adicionar 1 mL de meio de diferenciação de novo a cada poço.</li>
	<li>Incube as celulas na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 para 6 m. mudar o meio de todos os outros dias.</li>
	<li>Verificar o status de diferenciação dos diferentes grupos diariamente sob um microscópio de contraste de fase invertida. Aleatoriamente, selecione pelo menos 12 campos e tirar fotos para gravar as alterações morfológicas.</li>
</ol>6. mancha da imunofluorescência
<ol><li>
Enxaguar
	<ol>
<li>Leve as amostras fora da incubadora da célula e remova o meio por aspiração. Enxagúe as células 1 x com 1 mL de PBS. Nota: Após a diferenciação, as células são facilmente destacadas. É necessário adicionar a PBS do lado dos poços de cultura para evitar lavar as células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fixação
	<ol>
<li>Fixe as células com 500 µ l de paraformaldeído 4% por 20 min em temperatura ambiente. Após a fixação, lave suavemente as células 3 x com 1 mL de PBS, 5 min cada, para remover o paraformaldeído 4% residual. Nota: O ponto de tempo ideal para fixação da pilha deve ser determinado de acordo com os tipos de célula. Após a fixação, adicionar 1 mL de PBS do lado dos poços de cultura e deixar a amostra na mesa por 5 min. Não utilize um agitador de laboratório, para garantir uma mínima perda de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Permeabilização
	<ol>
<li>Permeabilize as amostras com 0,2% TritonX-100 em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a permeabilização, enxague as células delicadamente com 1 mL de PBS por três vezes, 5 min cada. Nota: O ponto de tempo ideal para permeabilização celular deve ser determinado de acordo com os tipos de células. Após a permeabilização, adicionar 1 mL PBS do lado dos poços de cultura, deixa a amostra na mesa por 5 min. Não utilize um agitador de laboratório para garantir a mínima perda de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bloqueio
	<ol>
<li>Adicionar 1 mL de soro de cabra de 10% em PBS para cada amostra e deixar a amostra na mesa por 1h bloquear quaisquer interacções inespecíficas. Nota: Não utilize um agitador de laboratório, para impedir que as células desanexação de slide. Um enxágue não é necessário nesta etapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubação com o anticorpo primário
	<ol>
<li>Dilua o anticorpo primário usando tampão de diluição do anticorpo primário. Nota: Para obter melhores resultados, a razão de diluição final do anticorpo primário deve ser determinada pelo pré-teste. As proporções de diluição de anti-Nestin (para células-tronco indiferenciadas), anti-β-tubulina III (para o neurônio), anti-ChAT (para os neurônios colinérgicos), anti-LHX3 (para os neurônios motores), anti-GABA (para anti-O4 (para oligodendrocyte), anti-NF200 (para neurônios maduros) Os neurônios gabaérgica), antiserotonina (para neurônios serotoninérgicos) e anti-TH (para os neurônios dopaminérgicos) são 1:80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 e 1: 100, respectivamente.</li>
		<li>Aplica 300 µ l de anticorpos primários diluídos amostras diferentes.</li>
		<li>Incubar as amostras de células durante a noite a 4 ° C. Nota: Recomenda-se incubar os anticorpos primários a 4 ° C para reduzir o fundo e a coloração não específica.</li>
		<li>Remover os anticorpos primários e lave delicadamente as células 3 x com 1 mL de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubação com anticorpo secundário
	<ol>
<li>Dilua os anticorpos secundários conjugados Cy3 ou Alexa Fluor 488-conjugados usando 3% de soro de cabra em PBS. Nota: Para obter melhores resultados, a razão de diluição final do anticorpo secundário deve ser determinada pelo pré-teste.</li>
		<li>Aplica 300 µ l de anticorpos secundários relevantes para detectar cada anticorpo primário. Nota: Todas as etapas subsequentes precisam ser executada no escuro para evitar a têmpera de fluorescência.</li>
		<li>Incube a amostra de célula no escuro por 2 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Remova os anticorpos secundários e enxágue as células delicadamente com 1 mL de PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloração nuclear
	<ol>
<li>Aplica 500 µ l de solução de trabalho de Hoechst 33258 imergir a amostra de células.</li>
		<li>Incube a amostra de célula no escuro durante 8 min à temperatura ambiente para rotular os núcleos.</li>
		<li>Lave delicadamente as células 3 x com 1 mL de PBS, 10 min cada, protegido da luz. Nota: Para uma mínima perda de células, a condição ideal de lavagem deve ser determinada empiricamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montagem
	<ol>
<li>Coloque uma gota de meio de montagem no centro do microslide.</li>
		<li>Tire as lamelas (com exemplos), usando uma pinça e coloque cuidadosamente a amostra em cima do meio de montagem. Evite bolhas de ar.</li>
		<li>Remova qualquer meio de montagem em excesso com papel absorvente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observação de microscopia de fluorescência
	<ol>
<li>Observe as amostras sob a microscopia de fluorescência, equipado com filtros para Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 e Cy3. Para cada amostra, selecione aleatoriamente pelo menos 8-12 campos e gravar imagens com uma câmera.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).</li>
<li>Rossi, F., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+therapy+for+neurological+diseases%3A+dreams+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).</li>
<li>Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+redox+biology+and+some+implications+for+plasma+applications+to+medicine+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001(2012).</li>
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<li>Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Treatment+of+Onychomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Plasma Treatment of Onychomycosis.</a> Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).</li>
<li>Xiong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+neuronal+differentiation+of+neural+stem+cells+induced+by+nanosecond+microplasma+agitation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).</li>
<li>Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Identification+of+Neural+Stem+Cells+in+New-born+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huazhong+University+of+Science+and+Technology.+%5BMed+Sci%5D%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats.</a> Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).</li>
<li>Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+multipotent+neural+cell+lines+using+retrovirus+vector-mediated+oncogene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer.</a> Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).</li>
<li>Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+engraftment+corrects+lysosomal+storage+throughout+the+MRS+VII+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain.</a> Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).</li>
<li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Fixatives+for+Immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Fixatives for Immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Cell Membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

C17.2-NSCs é um tipo de células-tronco neurais imortalizado linha de células de rato neonatal cerebelar camada granulosa, desenvolvida por Snyder e outros10,11. C17.2-NSCs podem se diferenciar em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos e são amplamente utilizados em neurociência12. Em nosso estudo anterior, CAPs poderiam reforçar a diferenciação de C17.2-NSCs em neurônios. Um prova de princípio também realizou estudo usando NSCs rato prim...

A diferenciação dirigida de NSCs em uma certa linhagem para o transporte de tecido é considerada uma das mais promissoras terapias de doenças neurodegenerativas e neurotraumatic1. Por exemplo, os neurônios dopaminérgicos de catecolaminérgica são especialmente desejados no tratamento da doença de Parkinson (PD). No entanto, os métodos tradicionais para preparar as células desejadas para transporte tem muitos inconvenientes, tais como toxicidade química, formação de cicatriz ou outros, o que dificulta em grande parte as aplicações de NSCs em medicina regenerativa2. Portanto, é muito necessário encontrar uma maneira segura e romance para diferenciação de NSC.
Plasma é o quarto estado da matéria, seguir sólido, líquido e gás, e constitui mais de 95% das matérias em todo o universo. Plasma é eletricamente neutro com positivo/negativo não acoplado e partículas neutras e geralmente é gerado por uma descarga de alta voltagem no laboratório. Nas últimas duas décadas, a aplicação do plasma em biomedicina tem atraído grande atenção no mundo, como o desenvolvimento da tecnologia de plasma frio pressão atmosférica. Graças a esta técnica, plasma de baixa temperatura estável pode ser gerado no ar circundante na atmosfera sem formação de arco e consiste de várias espécies reativas, como espécies reativas de nitrogênio (RNS), espécies reativas de oxigênio (ROS), ultravioleta (UV) radiação, elétrons, íons e campo elétrico3. CAPs têm vantagens exclusivas para inativação de microrganismos, terapia do câncer, tratamento de doenças de pele, proliferação celular e diferenciação de célula4,5,6,7, cicatrização de feridas. Em trabalho anterior, demonstrámos que jato de plasma atmosférico frio pode realçar a diferenciação de NSCs em células-tronco neurais murino C17.2 (C17.2-NSCs) e células-tronco neurais rato primário, exibindo um grande potencial para se tornar uma ferramenta poderosa para a direção diferenciação de NSCs8. Embora o mecanismo de aprimoramento da CAP de diferenciação NSC não é totalmente compreendido ainda, não gerado pelo CAPs tem sido provado ser um fator chave no processo. Neste trabalho, nosso objetivo é fornecer um protocolo experimental pormenorizado do uso de um plasma de hélio/oxigênio pressão atmosférica jato para o tratamento da NSCs in vitro, preparação da pilha e pré-tratamento, observação de morfologia pelo microscópio invertido, e Observação de microscopia de fluorescência da mancha da imunofluorescência.

<table><tbody><tr><td>Lamínula</td><td>NEST</td><td>801008</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td></td></tr><tr><td>DMEM meio</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01B</td><td>armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Meio DMEM/F12</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>armazenado a 4 &graus; O</td></tr><tr><td>suplemento C N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>armazenado a -20 &deg; C e proteger da luz</td></tr><tr><td>suplemento B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>armazenado a -20 > C e proteger da luz</td></tr><tr><td>Soro fetal</td><td>bovino HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>armazenado a -20 &deg; C, evite o congelamento e descongelamento repetidos</td></tr><tr><td>do soro do cavalo doador</td><td>HyClone</td><td>SH30074.03</td><td>tored em -20 &deg; C, evite o congelamento e descongelamento repetidos</td></tr> de <tr><td>penicilina / estreptomicina</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>armazenados a 4 graus; C</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>HyClone</td><td>25300054</td><td>armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Solução PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>armazenado a 4 > C</td></tr><tr><td>4% paraformaldeído</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Bloqueio de Soro de Cabra Normal</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td>armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>anti-Nestin</td><td>Beyotime</td><td>AF2215</td><td>armazenado a -20 &deg; C, evite congelamento e descongelamento repetidos</td></tr><tr><td>anti-&beta;-Tubulina III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>armazenado a -20 &graus; C, evite o congelamento repetido e o descongelamento</td></tr><tr><td>anti-O4</td><td>R& D Os sistemas</td><td>MAB1326</td><td>armazenados a -20 > C, evite congelamento e descongelamento repetidos</td></tr><tr><td>anti-NF200</td><td>Sigma</td><td></td><td>armazenados a -20 & C, evite congelamento e descongelamento repetidos</td></tr><tr><td>anti-ChAT</td><td>Sigma</td><td></td><td>armazenados a -20 &deg; C, evite congelamento e descongelamento repetidos</td></tr><tr><td>anti-LHX3</td><td>Sigma</td><td></td><td>armazenados a -20 &deg; C, evite o congelamento repetido e o descongelamento</td></tr><tr><td>anti-GABA</td><td>Sigma</td><td></td><td>armazenado a -20 &deg; C, evite congelamento e descongelamento repetidos</td></tr><tr><td>anti-serotonina</td><td>Abcam, Cambridge, MA</td><td></td><td>armazenados a -20 &deg; C, evite congelamento e descongelamento repetidos</td></tr><tr><td>anti-TH</td><td>Abcam, Cambridge, MA</td><td></td><td>armazenados a -20 &deg; C, evite o congelamento e o descongelamento repetidos</td></tr><tr>Tampão preliminar <td>Beyotime</td><td>P0103</td> da<td>diluição do anticorpo da coloração de Immunol</td><td>armazenado em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Cy3 Rotulado Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>armazenado a -20 &deg; C e proteger da luz</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488- Rotulado Goat</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>armazenado a -20 &deg; C e proteger da luz</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 frasco</td><td>corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Beyotime</td><td>C1018</td><td>armazenado a -20 &deg; C e proteger da luz</td></tr><tr><td>Meio de montagem</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td>armazenado a -20 &deg; C e proteger da luz</td></tr><tr><td>Microscópio de luz</td><td>Nanjing Jiangnan Novel Optics Company</td><td>XD-202</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia de fluorescência</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de potência de alta tensão</td><td></td><td>PVX-4110</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação DC</td><td>Spellman</td><td>SL1200</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de função</td><td>Aligent&nbsp;</td><td>33521A</td><td></td></tr><tr><td>Osciloscópio</td><td>Tektronix</td><td>DPO3034</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de alta tensão</td><td>Tektronix</td><td>P6015A</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciação de células-tronco nervosas por um one-step plasma atmosférico frio tratamento in vitro

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

Como o desenvolvimento da tecnologia da física de plasma, TVs de plasma atmosféricos frios (CAPs) têm sido amplamente investigados na descontaminação, tratamento de câncer, cicatrização de feridas, tratamento de canal, etc., formar um novo campo de pesquisa chamado medicina de plasma. Sendo uma mistura de espécies reactivas elétricas, químicas e biológicas, CAPs mostraram suas habilidades para aumentar a diferenciação de células-tronco nervosas ambos em vitro e in vivo e está se tornando um caminho promissor para o tratamento de doença neurológica no futuro. A notícia mais emocionante é que usando tampões pode realizar uma etapa e com segurança dirigido, diferenciação de células-tronco neurais (NSCs) para transporte de tecido. Demonstramos aqui o protocolo experimental pormenorizado de usando um dispositivo de jato CAP self-made para reforçar a diferenciação de NSC em C17.2-NSCs e células-tronco neurais rato primário, bem como observar o destino da célula por invertido e microscopia de fluorescência. Com a ajuda de mancha tecnologia, encontramos ambas as NSCs mostrou um ritmo acelerado de diferenciais que o grupo não tratado, e ~ 75% das NSCs seletivamente diferenciadas em neurônios, que são principalmente maduro, colinérgicos e motor neurônios.

Morfologia celular foi observada ao microscópio invertido todos os dias após o tratamento do CAP. A Figura 2 mostra as imagens do microscópio óptico comum de contraste de fase invertida da diferenciação celular em ambas as linhas de célula. O grupo tratados com plasma apresenta uma taxa acelerada diferenciação e uma relação de elevada diferenciação em relação ao grupo de fluxo de controle e gás.
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Este protocolo visa proporcionar detalhadas etapas experimentais de um tratamento de plasma frio atmosférico sobre células-tronco neurais e detecção de imunofluorescência para aprimoramento de diferenciação.

Diferenciação de células-tronco nervosas por um One-Step Plasma atmosférico frio tratamento In Vitro

As the development of physical plasma technology, cold atmospheric plasmas (CAPs) have been widely investigated in decontamination, cancer treatment, ...

Este método tem o potencial de aumentar a diferenciação de células-tronco neurais in vitro e contribuir para o tratamento de doenças neurológicas como a doença de Parkinson. As principais vantagens desta técnica é que os plasmas atmosféricos frios podem ser aplicados em uma etapa para a diferenciação direcionada segura das células-tronco neurais para transplante de tecido. O plasma atmosférico frio pode aumentar a diferenciação de células-tronco neurais em um curto período de tratamento.E com necessidade de mais danos às células, fornecendo as células desejadas para transplante. Comece semeando cerca de cinco vezes dez para o quinto tronco neural murino em um frasco quadrado de 25 centímetros. Contendo cinco mililitros de DMEM completos por dois a três dias a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono.Quando as células atingirem 85% de confluência, lave a cultura com um mililitro de PBS. Antes do tratamento, com um mililitro de 25% de trippsina por um minuto. Quando as células se separaram, pare a reação com um mililitro de meio de cultura.E pipeta várias vezes para gerar uma única suspensão celular. Após a contagem, dilui as células para duas vezes dez a quatro células por concentração mililitro. Semente um mililitro de células-tronco em um deslizamento de cobertura revestido de poli-D-lysina por poço em nove poços de uma placa de cultura de 12 células.Verifique a densidade celular sob um microscópio. E devolva as células à incubadora por 12 horas. Quando as células tiverem sido anexadas, lave a tampa duas vezes com um mililitro de PBS por lavagem e trate as células com meio de diferenciação por 48 horas.Para aquisição de jatos, primeiro conecte o fio de saída da fonte de alimentação ao dispositivo a jato de plasma. E a ponta da sonda de alta tensão com o fio de saída para detectar a tensão. Em seguida, conecte a outra extremidade da sonda de alta tensão ao osciloscópio para registrar as informações da tensão de saída.Verifique todo o circuito para ter certeza de que a fonte de alimentação, o osciloscópio e a sonda de alta tensão estão todos aterrados. E verifique a linha de gás para ter certeza de que o tubo de gás está conectado ao dispositivo de jato de plasma. Em seguida, abra as válvulas de gás hélio e oxigênio e ajuste o fluxo de gás para uma proporção de um litro a 01 litros por minuto de hélio para oxigênio.Verifique novamente o circuito e pressione o botão de saída para criar um jato de plasma. Para tratar plasma das células-tronco neurais, defina a distância entre o bocal da seringa e o primeiro poço de células para 15 milímetros. Substitua os supernacantes nas culturas de células-tronco neurais por 800 microliters de meio de diferenciação fresco.E coloque a placa sob os jatos de plasma. Certificando-se de que o bocal da seringa está fixado sobre o centro de cada poço. Crie três poços com plasma por 60 segundos por tratamento, e três poços com um por cento de hélio e gás oxigênio por 60 segundos por tratamento.Deixando três poços sem tratamento, como controles. Em seguida, substitua os supernacantes por um mililitro de meio de diferenciação fresco. E devolva as células à incubadora por seis dias.Verifique o status de diferenciação dos diferentes grupos diariamente, sob um microscópio de luz de contraste de fase invertida. Após o tratamento, permitam que as células se equilibrem totalmente no meio da condição por cerca de uma hora antes de substituir o supernascedor por um meio de diferenciação fresco. Para análise de imunofluorescência, fixar as culturas com 500 microlitres de 4% de paraformaldeído por poço por 20 minutos à temperatura ambiente.Seguido por três suaves cinco minutos de enxagua, com um mililitro de PBS por lavagem. Em seguida, permeabilize as amostras fixas com 2% triton X-100 em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente. Seguido por lavagem suave como demonstrado.Após a última lavagem, bloqueie qualquer ligação não específica com um mililitro de 10% de soro de cabra em PBS por amostra durante uma hora em temperatura ambiente. No final da incubação, rotule as células em cada poço com 300 microliters do anticorpo primário de interesse durante a noite a quatro graus celsius. Seguido por três lavagens na PBS como demonstrado.Após a última lavagem, rotule as células com 300 microliters dos anticorpos secundários apropriados. Incubar por duas horas em temperatura ambiente, protegido da luz. Em seguida, enxágüe as células suavemente com um mililitro de PBS por poço por dez minutos em temperatura ambiente.Imagem das células em um microscópio de fluorescência equipado com os filtros apropriados. As células-tronco neurais tratadas com plasma apresentam uma taxa de diferenciação acelerada, e uma maior taxa de diferenciação em comparação com o controle não tratado, e células-tronco tratadas com fluxo de gás. Após o tratamento plasmápico, Nestin diminui.Beta-Tubulin III aumenta significativamente. E o O4 aumenta ligeiramente, comparado ao controle tratado e ao fluxo de gás das células-tronco tratadas. Além disso, após 60 segundos de tratamento plasmápico, observa-se uma expressão robusta de neurônio maduro, neurônio colinérgico e marcadores de neurônios motores.Com pouquíssimos neurônios gabaérgicos e serotonérgicos, e nenhum neurônio dopaminérgico detectado. Ao tentar esses procedimentos, é importante lembrar, tratar as células com dosagem plasmática adequada, pois um longo e intenso período de tratamento plasmológico induzirá apoptose celular ou necrose. Lembre-se também de testar também a viabilidade celular antes da aplicação a jusante.

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Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

Este vídeo demonstra a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas, ou hESCs, diretamente em células progenitoras neurais sem o uso de células alimentadoras ou quaisquer etapas intermediárias. A inibição seletiva das vias de sinalização da proteína morfogenética óssea ou BMP e do fator de crescimento transformador beta, ou TGF-β, leva à diferenciação de hESCs em células progenitoras neurais, ou NPCs.

Diferenciando células-tronco embrionárias humanas em progenitores neurais

Este vídeo apresenta um método para desencadear a diferenciação em células-tronco neurais utilizando plasma atmosférico frio. Isso gera radiação UV e moléculas reativas para estimular as células nervosas a produzir projeções, indicando diferenciação celular neuronal.

Estimulando a diferenciação de células-tronco nervosas usando tratamento com plasma atmosférico frio

Este vídeo demonstra o processo de geração de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) a partir de células-tronco embrionárias humanas, seguido pela maturação de OPCs em oligodendrócitos. Esse processo de geração de oligodendrócitos abre vários caminhos para melhorar a pesquisa e o tratamento de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer.

Diferenciando células-tronco embrionárias humanas em oligodendrócitos

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Com a intenção de caracterizar mudanças em miRNAs em células-tronco neurais humanas diferenciadas (hNSCs), descrevemos a diferenciação de hNSC em um sistema tridimensional, a avaliação de mudanças na expressão de microRNAs por matriz de PCR de miRNA e análise computacional para predição de alvos de miRNAs e sua validação por ensaio de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

Este protocolo descreve a reprogramação de primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco em células-tronco pluripotentes induzidas usando uma abordagem epissomal não-integrando em condições totalmente quimicamente definidas. Procedimentos de extração, cultura, reprogramação e caracterização das células-tronco pluripotentes induzidas resultante por métodos rigorosos são detalhados.

Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

A geração de tipos de células diferenciadas a partir da célula-tronco pluripotente humana (hPSCs) possui grande promessa terapêutica, mas permanece desafiadora. PSCs muitas vezes exibem uma incapacidade inerente para diferenciar mesmo quando estimulado com um conjunto adequado de sinais. Descrito aqui é uma ferramenta simples para melhorar a diferenciação multilinhagem através de uma variedade de linhas PSC.

Tratamento transitório de células-tronco pluripotentes humanas com DMSO para promover a diferenciação

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

Descrevemos um método para diferenciar astrócitos e neurônios derivados pluripotentes induzidos por humanos da medula espinhal e sua co-cultura para registro eletrofisiológico.

Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas

Aprenda a diferenciar células-tronco neurais murinas usando plasma atmosférico frio em um único passo. Este método seguro acelera a diferenciação celular para aplicações em medicina regenerativa e tratamento de doenças neurológicas como o Parkinson.

Diferenciação de células-tronco nervosas por um One-Step Plasma atmosférico frio tratamento In Vitro

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