Name: Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco neurais humanas em cultura 3D e analisar perfis de microRNA. Este método computacional valida alvos de mRNA usando ensaios de luciferase dupla.

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Reconhecemos Julie Heward para ajudar na preparação de hNSCs e Lavaniya Thanabalasundaram pelo apoio técnico com HeLa cultura e transfecção.

1. diferenciação HNSC em Tridimensional Cultura (3D) NOTA: Isolar e derivar hNSCs, a partir de um tecido aprovado ética, descrito na publicação anterior 2. Por favor, siga as diretrizes éticas e institucionais, enquanto seguem este procedimento. 1.1) Cultura 3D Usando de 12 poços <ol><li> Utilizar técnicas assépticas durante todo o procedimento. Em uma cabine de segurança biológica, andaimes re-hidratar por adição de 2 ml / poço de etanol a 70% preparada com água para irrigação (WFIr). Evite tocar nos andaimes dispensando o etanol a 70% para baixo na parede de cada poço. </li><li> Aspirar cuidadosamente o etanol a 70% e lava-se imediatamente os andaimes com 2 ml / poço de DMEM: F12, durante 1 minuto. Repita o procedimento de lavagem duas vezes. Aspirar cuidadosamente o DMEM: F12 após a última lavagem. </li><li> Andaimes do revestimento por adição de 2 ml / poço de laminina (10 ug / ml) em meio DMEM: F12. Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 humidified incubadora durante um mínimo de 2 horas. Lavar a placa com DMEM quente: F12. </li><li> Semente cada andaime com aproximadamente 500.000 hNSCs em um volume de 150 mL de RMM + FG. </li><li> Incubar a placa durante 3 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora humedecida para permitir que as células em resolver os andaimes. </li><li> Adicionar 3,5 ml de RMM para cada cuidado bem tomar para não desalojar as células dos andaimes. </li><li> Incubar a placa durante 7 dias; substituir médio RMM (3,5 ml / poço) após um dia (primeira alimentação) e novamente depois de 2-3 dias a partir da primeira alimentação. </li><li> Após 7 dias, remova o meio e corrigir as células com 4% de paraformaldeído (PFA) para imunocitoquímica (ICC) ou adicionar 500 mL / poço de reagente de lise para extração de RNA total (loja de placas a ≤ -80 ° C ou proceder à extração de RNA total) . </li></ol> 1.2) A medição da Axon Processo Conseqüência <ol><li> Mancha 4% PFA fixa hNSCs diferenciadas de acordo com um protocolo padrão ICC 20 utilizando β3-tubulina (TUBB3) anticorpo primário, detectado com um anticorpo secundário conjugado com fluorocromo. Núcleos celulares contracorante com Hoechst (1 m). </li><li> Capturar imagens representativas de células coradas β3-tubulina usando um microscópio de fluorescência; salvar imagens como tiff ou jpeg. Medida do processo axônio excrescência usando uma ferramenta de medição de software (por exemplo, Pro-Imagem Plus). </li><li> Abra a imagem, selecione a opção medições na barra de ferramentas e selecione recurso de rastreamento. </li><li> Para iniciar o rastreamento, selecione o ponto de partida no crescimento axonal, clicando no botão do mouse. Seguir ao longo de todo o comprimento do crescimento axonal; clique direito para terminar cada traço. Repetir para medir todos outgrowthswith axónio no campo de visão. </li><li> Expresse medições como pixels ou um (pendente de calibração configurada). Medidas de comprimento exportar para um programa de planilha eletrônica para análise comparativa e estatística da amostra. </li></ol> 2. Mirna Expression Usando um Células-Tronco eCaminhos do desenvolvimento focada Matriz miRNA PCR 2.1) a extração de RNA total miRNA <ol><li> Realizar a extração miRNA em andaimes e amostras crescidas 2D (diferenciado e indiferenciado controle, HNSC). </li><li> Descongelar andaimes, inserido numa placa de 12 poços, se necessário. Juntar o conteúdo de reagente de lise (500 mL) de 2 poços na mesma 1,5 ml tubo Eppendorf, volume final de 1 ml de reagente de lise. Tome o cuidado de deixar o andaime no poço. </li><li> Para celulares peletizada amostras coletadas anteriormente como secas 2D crescido (diferenciadas culturas HNSC 2D e controle indiferenciada) 1 ml de reagente de lise e transferir o conteúdo em 1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Homogeneizar cada amostra de teste utilizando uma seringa de 1 ml e um curta de 20 a 25 agulha de calibre. Passar o lisado através da agulha utilizando seringa de 1 mL até 5 vezes até um lisado homogénea é conseguido. </li><li> Adicionar 200 ul de clorofórmio a cada tubo Eppendorf e a tampa firmemente. Tubos invertido e vortex paramisturar o conteúdo. </li><li> Centrifugar cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo homogenato durante 15 min a ≥12,000 x g. </li><li> Transferir a fase aquosa superior de cada amostra (para evitar a transferência de qualquer interfase, líquido de cor-de-rosa) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresco contendo 750 ul de etanol a 100%. Misture bem por inversão. </li><li> Pipeta-se 700 ul de cada amostra de teste, incluindo qualquer precipitado, para um mini-coluna em um tubo de recolha de 2 ml. Fechar a tampa e centrifugar a ≥8,000 xg durante cerca de 30 segundos a temperatura ambiente. Descartar o fluxo de passagem. Repetir esta etapa utilizando a parte restante da amostra. </li><li> Realizar um resumo DNA para 15 min. </li><li> Adicionar 700 ul ERP buffer para o mini coluna e centrifugar por cerca de 30 segundos a ≥8,000 x g. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Lavar mini-coluna por adição de 500 ul de tampão EPR e centrifugando durante aproximadamente 30 segundos a ≥8,000 x g. Descartar o fluxo de passagem. Repita wash.Centrifuge em ≥12,000 xg durante 1 min para secar a membrana ainda mais. </li><li> Elui-se o ARN total em um tubo Eppendorf de 1,5 ml por adição de 40 ul de água isenta de RNase para o mini-coluna e centrifugando durante 1 min a ≥8,000 x g. Medir a concentração de ARN total com a ajuda de um espectrofotómetro adequado. </li></ol> 2.2) Preparação de cDNA miARN <ol><li> Prepare a mistura principal transcrição reversa. Cada amostra requer 4 mL de tampão 5x miScript Hispec, 2 l de 10x nucleics mix, 2 ul miScript reverter mix transcriptase. </li><li> Aliquota 8 ul de mistura principal em um tubo de PCR, adicionar o volume necessário de ARN total (250 ng), e adicionar água isenta de RNase para um volume final de 20 ul. </li><li> Incubar durante 60 minutos a 37 ° C.Incubate durante 5 min a 95 ° C para inactivar miScript Transcriptase Reversa mistura. </li><li> Adicionar 200 mL de água livre de RNase para cada reação de 20 ul transcrição reversa, armazenar a -20 ° C, ou prosseguir com o Real-tiPCR me imediatamente. </li></ol> 2.3) Células Estaminais e Desenvolvimento Pathways Focada miRNA PCR Matriz <ol><li> Prepare a mistura de componentes PCR em um tubo de 15 ml, adicionando 1375 mL de 2x SYBR master mix verde, 100 l preparação miRNA cDNA, 275 mL de 10x miScript Universal Primer, e 1000 mL de água RNase-free (volume total de 2.750 l). </li><li> Transferir PCR em uma mistura de componentes de carga do reservatório de PCR. Remova cuidadosamente a placa de 96 poços PCR matriz da embalagem selada. </li><li> Adicionar 25 uL de mistura de PCR componentes para cada uma das cavidades da matriz de PCR, utilizando uma pipeta de 8 canais, ou um pipetador de 12 canais usando apenas 8 dicas. Mudar pontas de pipeta depois de cada passo do ensaio, a fim de evitar a contaminação cruzada entre os poços. </li><li> Selar placa com película adesiva óptica, e centrifuga-se durante 1 min a 1000 xg à temperatura ambiente (15-25 ° C) para remover as bolhas. Inspecione visualmente a placa de baixo para garantir que não haja bolhas de ar nos poços. </li><li> Coloque a placa de 96 poços de PCR de matriz no reciclador em tempo real. </li><li> Programa o reciclador em tempo real de acordo com: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 min, e 45 ciclos de 15 seg a 95 ° C, e 1 minuto a 60 ° C definir um único (recolha de dados de fluorescência). </li><li> Exportar os valores Ct para todos os poços para uma planilha do Excel em branco para uso com PCR Matriz de Análise de Dados Template Excel e software baseado na web. NOTA: O software está disponível em <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. Análise computacional para miRNA alvo de Previsão e Validação de mRNAs alvo por Reporter plasmídeo Transfection e Ddual ensaio de luciferase. 3.1) Análise computacional para miRNA alvo Prediction <ol><li> Navegar PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21, algoritmo disponível on-line para a identificação de miRNA alvo ARNm de predição. </li><li> Clique em &quot;clique aqui para previsão PicTar em vertebrados&quot;. Uma nova página será aberta. </li><li> Na nova página, interface web PicTar, escolha espécies no menu drop-down e inserir miRNA de interesse na caixa de miRNA ID. Clique busca de alvos de um miRNA. </li><li> Observe a lista de mRNAs alvo classificados por pontuação aPicTar. NOTA: PicTar calcula uma pontuação que reflete a probabilidade de que um determinado UTR será orientado pelo miRNA selecionado, e com base na complementaridade das sementes, termodinâmica e uma previsão combinatória para objectivos comuns em conjuntos de co-expressa miRNAs 22. </li><li> Lista de mRNAs alvo Da mesma forma recuperar usando DIANA-LAB ( <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) 23, e TargetScan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> ) 24, alternativa on line disponível algoritmos. </li><li> Compilar um quadro comparativo dos miRNAs baseado em classificação obtida utilizando diferentes ferramentas de software. PicTar classifica por pontuação, DianaLab por Precisão (com base na relação sinal-ruído e uma pontuação de precisão para a avaliação da significância dos resultados previstos), e por TargetScan PCT agregado (com base na complementaridade das sementes, energia livre termodinâmica de ligação, conservação ao longo diferentes espécies), ver Tabela 1. </li></ol> 3.2) A validação de Alvo mRNAs por Reporter plasmídeo Transfection e Dual ensaio de luciferase. NOTA: 3 &#39;UTR repórteres luciferase para a validação de mRNA alvo tem sido descrito anteriormente 25. <ol><li> Transfection <ol><li> Semente células HeLa, a uma densidade de 10 5 células / poço em placa de 24 poços. </li><li> Após 24 h, co-transfectar células HeLa com 1,5 mL de reagente de transfecção e quer 100 ng de plasmídeo NR4A3 UTR 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39;, bem como 20 nM imita miARN (HSA-miR-96-5p para SOX5 3217; UTR, e HSA-miR-7-5p, e HSA-miR-17-5p para NR4A3 UTR 3 &#39;, respectivamente) por poço. </li><li> Poços de controlo Co-transfectar com NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRplasmid e fluorochrome marcado siRNAs controlo negativo. A transfecção de poços de controlo com fluorocromo marcado siRNAs de controlo negativo permite a avaliação da eficiência de transfecção e responde por mímica miRNA 3&#39;UTR ligam especificidade. </li></ol></li><li> Medição da dupla luciferase Atividades <ol><li> Meça Firefly e Renilla atividades luciferase 24 horas após a transfecção. Remover o meio de crescimento celular. </li><li> Preparar uma solução de trabalho I por adição de 50 ul de substrato I em 10 ml de Solução I; homogeneizar. Adicionar 300 uL de solução de trabalho de 24 I em cada poço. </li><li> Transfere-se o conteúdo de cada poço 24 em três poços de uma placa branca de 96, 100 ul cada. Espere 10 minutos e medir Firefly luciferase em conjunto luminometer para aquisição de luminescência. </li><li> Prepare solut trabalhandoião II pela adição de 50 ul de substrato II em 10 ml de solução II; homogeneizar. Adicionar 100 uL de solução de trabalho de 96 I em cada poço já contendo 100 uL de solução de trabalho I. </li><li> Espere 10 minutos e medir Renilla luciferase em conjunto luminometer para aquisição de luminescência. Calcula-se a relação da luminescência da luciferase do vaga-lume para a luciferase de Renilla. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Todos os autores são funcionários, estoque e / ou detentores de opções de ações em ReNeuron Ltd ou sua empresa-mãe. Este estudo foi apoiado por ReNeuron (RENE.L).

O desenvolvimento de novos ensaios in vitro para avaliar e melhorar a diferenciação de células-tronco sempre apresentou um desafio para a investigação de suas funcionalidades e capacidades terapêuticas. A longo prazo e de fixação estável de hNSCs, necessária para o desenvolvimento de um ensaio em 3D robusto diferenciação in vitro, foi tratada por meio de testes de vários substratos em 3D com características diferentes em termos de materiais e estruturas. Como parte do desenvolvimento do ensaio, também avaliamos concentração semeadura de células ideal e identificou a necessidade de os andaimes para ser laminina revestido. Embora nossos hNSCs pode diferenciar espontaneamente ao 4-OHT e fator de crescimento de remoção, a implementação de um sistema de cultura 3D mostrou uma melhora significativa em sua capacidade de diferenciação medida pelo axônio processo de crescimento quando comparado com hNSCs 2D diferenciado padrão. Para investigar o efeito da difere induzida 3Dntiation na expressão HNSC miRNA foi utilizada uma matriz de PCR. Comparado com o chip de microarray padrão matriz PCR oferece as vantagens de uma quantificação direta e validação de miRNA de interesse. Embora a matriz de PCR é limitado em termos de número total de miARN por matriz, por exemplo, em menos do que 96 aqui, ele pode ser adaptado para incluir especificamente miARNs de interesse, no nosso caso anteriormente reportado no desenvolvimento de células estaminais. A expressão da via focada miRNAs foi perfilado em 3D e 2D hNSCs diferenciados em comparação com hNSCs indiferenciadas. Os miRNAs mais significativamente regulada foram selecionadas e analisadas para avaliar seus mRNAs alvo putativos com o intuito de determinar a sua funcionalidade e interpretação biológica usando algoritmos disponíveis on-line (DIANA Lab, PicTar e TargetScans). Um único miRNA pode reconhecer centenas de alvos e por esta razão nós validado interações miRNA com 3 &#39;UTR mRNAsthat podem ser candidatos apropriados, em umaregulação xonal. NR4A3, um alvo do hsa-miR-7 e miR-17 da família, é um membro da família de receptores nucleares NR4A que, dependendo do seu nível de expressão, estão envolvidos na diferenciação, sobrevivência, apoptose e regulação do axônio do hipocampo orientação 26. Da mesma forma SOX5, uma meta de hsa-miR-96, é relatado para controlar a progressão do ciclo celular em células progenitoras neurais 27 de comprimento axônio 28, migração, diferenciação pós-migratório, e projeções de neurônios 29. Ambos SOX5 e NR4A3 foram identificados como um ARNm alvo directo de HSA-miR-96, e HSA-miR-7 e 17, respectivamente, por ensaios de luciferase repórter duplo. Duplo de luciferase (Firefly e da Renilla) baseia-se em dois genes repórter diferentes no mesmo plasmídeo e oferece um sistema melhorado que permite a normalização para efeitos causados ​​por transfecção subóptima e efeitos citotóxicos em comparação com um único sistema de plasmídeo da luciferase. Como parte do nosso desenvolvimento do ensaio também otimizado nosso conditi transfecçãoons, a fim de obter alta eficiência. O protocolsdescribed aqui podem ser exploradas para otimizar ainda mais e caracterizar in vitro HNSC diferenciação que pode beimplemented protocolos intransplantation para estudos pré-clínicos e futuras aplicações clínicas.

Investigação sobre células estaminais desempenha um papel central na medicina regenerativa, que também abrange as disciplinas de engenharia de tecidos, biologia celular do desenvolvimento, terapias celulares, a terapia gênica e biomateriais (andaimes e matrizes). As células-tronco são importantes tanto no órgão reparação tecidual developmentand; a compreensão de como as células-tronco funcionam é fundamental para o desenvolvimento de tratamentos baseados em células estaminais uma nova. CTX0E03 é uma célula estaminal neural humana imortalizadas condicionalmente (HNSC) linha clonal, 2 isolado a partir de córtex primeiro trimestre do feto humano. CTX0E03 definiu características de qualidade que são essenciais para bancos de células clínica em boas práticas de fabricação (BPF) 3. HNSCs pode diferenciar-se espontaneamente em neurônios, glia, e oligodendrócitos e ter sido provada a melhorar déficits neurológicos quando transplantadas em um modelo de roedor de 2,4,5 isquemia focal. O CTX0E03 hNSCs estão actualmente em ensaios clínicos para o AVC disabildade (NCT01151124 6 e NCT02117635, Clinicaltrials.gov). MiRNAs tem uma média de 22 nucleótidos de comprimento e são comprovados moléculas reguladoras 7, que não codificam proteínas, mas a região não traduzida 3 ligam primordial (3&#39;UTR) de mRNAs, regulando a sua estabilidade e a tradução em proteínas. MiRNAs são relatados para participar na regulação de um número de processos celulares, incluindo o desenvolvimento, proliferação, diferenciação e 8. Vários miARNs têm sido implicados na regulação do destino e especificação de células estaminais neurais 9. Em bidimensional (2D) meio de cultura padrão a complexidade do ambiente in vivo não é coincidente, e, consequentemente, a indução e regulação da diferenciação HNSC não é óptima. In vivo, as células são rodeados por um microambiente três dimensões (3D), constituído por outros células e ligantes extracelulares, incluindo muitostipos de colagénios, laminina, e outras proteínas da matriz (matriz extracelular, ECM). Estudos anteriores relataram que a topografia arquitetônico dos materiais que imitam as Ações e seu fenótipo celular influência da geometria e destino 10-15. Um certo número de suportes 3D disponíveis comercialmente estão disponíveis; utilizou-se um andaime de poliestireno altamente poroso engenharia com uma arquitetura bem definida e uniforme em uma membrana de 200 um de espessura que proporciona um espaço 3D em células que podem invadir e diferenciar 16-18. Relata ensaios de diferenciação 2D e 3D são usados ​​para avaliar a excrescência axonprocess. Além disso, nós descrevemos um método para traçar o perfil do miRNA expressão de uma linha HNSC grau clínico para investigar mais profundamente os efeitos de miRNA em sua diferenciação. Os métodos ilustrados aqui são baseadas em que os anteriormente descritos na 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM:F12</td><td>Invitrogen</td><td>21331-020</td><td>Para preparação de meio RMM</td></tr><tr><td>Solução de Albumina Humana&nbsp;</td><td>Baxter Health Care Limited&nbsp;</td><td>1501052</td><td>Para meio RMM usado em uma concentração final de&nbsp; 0,03%</td></tr><tr><td>Transferrina, Sigma</td><td></td><td>T8158</td> humano recombinante <td>Para meio RMM usado em uma concentração final de&nbsp; 5 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>de Putrescine DiHCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Para meio RMM usado em uma concentração final de&nbsp; 16.2 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>de Insulina humana recombinante&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>Para meio RMM usado em uma concentração final de&nbsp; 5 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>de progesterona&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td>Para meio RMM usado em uma concentração final de&nbsp; 60 ng/ml</td></tr><tr><td>L-Glutamina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030-24</td><td>Para meio RMM usado em uma concentração final de&nbsp; 2 mM</td></tr><tr><td>de Selenita de Sódio&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>Para meio RMM usado em uma concentração final de 40 ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Para ser adicionado ao meio RMM, usado na concentração final de 10 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-188</td><td>Para ser adicionado ao meio RMM, usado a uma concentração final de 20 ng/ml</td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Para ser adicionado ao meio RMM, usado a uma concentração final de 100 nM</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>AMS Biotech</td><td>3400-010-10</td><td></td></tr><tr><td>TrypZean/EDTA</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>BE02-034E</td><td></td></tr><tr><td>Água para irrigação</td><td>Baxter Healthcare</td><td>UKF7114</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Tripsina Definido (DTI) (armazenar -20&deg; C)</td> Placa de 12 poços <td>Invitrogen</td><td>R007-100</td><td></td></tr><tr><td>Alvetex</td><td>Reinnervate Ltd</td><td>AVP002</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.00986.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta; III anticorpo tubulina</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td>217004</tr><tr><td>DNase livre de RNase&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>218160</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green PCR kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td>218073</tr><tr><td>Desenvolvimento Celular & Diferenciação miScript miRNA PCR Array</td><td>Qiagen/ SABiosciences</td><td>MIHS-103Z</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 placa branca 96</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729692001</tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp; folha de vedação</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729757001</tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Vector NR4A3 miRNA 3' UTR clones alvo&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT019538-MT0</td><td></td></tr><tr><td>Vector SOX5 miRNA 3' UTR alvo clones&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT017632-MT01</td><td></td></tr><tr><td>Allstars siRNA de controle negativo AF 488 (Qiagen).</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>1027284</td><td>Controle de transfecção de MiRNA</td></tr><tr><td>Luc-Pair miR Luciferase Assay</td><td>GeneCopeia</td><td>LPFR-M010</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp;</td><td>Luminômetro</td> de microplaca Roche <td></td><td></td></tr><tr><td>GloMax 96&nbsp;</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em três culturas dimensionais, os genes análise de microrna e putativo alvo

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Células-tronco neurais (NCCC) são capazes de auto-renovação e diferenciação em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos sob microambientes locais específicos. Aqui, apresentamos um conjunto de métodos utilizados para a diferenciação tridimensional (3D) e análise de miRNA de uma célula-tronco neurais (HNSC) linha clonal, atualmente em ensaios clínicos para o AVC deficiência (NCT01151124 e NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs foram derivadas de um córtex de ética aprovado primeiro trimestre humana fetal e condicionalmente imortalizada usando a integração retroviral de uma única cópia do c-mycER TAM construir. Nós descrevemos como medir processo axônio conseqüência de hNSCs diferenciadas em andaimes 3D e como quantificar mudanças associadas na expressão miRNA usando matriz de PCR. Além disso, somos exemplos de análise computacional com o objetivo de selecionar miRNA possíveis alvos. SOX5 e NR4A3 foram identificados como alvo putativo miRNA adequada de selecionado significativamente sub-regularmiRNAs d no HNSC diferenciado. Validação alvo Mirna foi realizada em SOX5 e NR4A3 3&#39;UTRs por dupla transfecção plasmídeo repórter e ensaio de luciferase dual.

Na Figura 1 é visualizada a investigação e quantificação de diferenciação HNSC em andaimes 3D em comparação com as culturas tradicionais de superfície plana (2D) e expressedas axônio medições processo de crescimento. Na Figura 2 é representedthe fluxo de trabalho e os resultados para a quantificação miRNA usando células-tronco e as vias de desenvolvimento focado matriz miRNA PCR para investigar expressão diferencial de miRNAs em hNSCs diferenciadas em 2D e 3D, em comparação com o controle indiferenciado. Após a análise comparativa entre miRNA hNSCs diferenciadas e indiferenciadas, e análise computacional para predição alvo, SOX5 e NR4A3 (NOR1) foram identificados como mRNAs alvo putativos. Para estudar a interacção directa entre os miARNs e seu local putativo na 3 &#39;UTR do mRNA foram utilizados dois plasmídeos comercialmente disponíveis que contenham quer SOX5 ou sequência 3&#39;UTR NR4A3 inserido a jusante do gene repórter da luciferase de pirilampo, uma<html> nd contendo no mesmo gene de luciferase Renilla plasmídeo de normalização. Os resultados representativos da UTR 3 &#39;de actividade de luciferase a sub-regulação é apresentada na Figura 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> Figura 1:. Diferenciação de hNSCs sobre andaimes 3D, e medição de processo axônio es excrescência (A) após coloração ICC padrão para β3-tubulina (verde) e núcleos contrastado com Hoechst (azul) microfotografias representativos foram adquiridos e medição dos processos axônio realizada com o auxílio de um software de análise de imagem. (B) Diagrams relatando a medição do processo axônio excrescência realizada em 2D e 3D hNSCs diferenciados para 1 (1W) ou 3 semanas (3W).com / files / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> Figura 2:. Fluxo de trabalho esquemático de miRNA profiling em hNSCs diferenciadas RNA total, incluindo os miRNAs, foi extraído a partir de qualquer hNSCs diferenciadas sobre andaimes 3D e culturas padrão 2D, ou controle indiferenciado. 250 ng de RNA total foram retro-transcrito com um método que facilita a conversão selectiva de miARNs maduros em cDNA adequados para quantificação miARN com diferenciação de células humanas e desenvolvimento matriz miScript miARN PCR. A geo-média de SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A e RNU6-2 foi utilizado para a análise de dados com base no método 2 -ΔΔct. Mudanças significativas foram definidas como +/- 1,5 dobrar e regulação para baixo a um stamedida estatisticamente significativa. Os dados foram analisados ​​por meio de software baseado na web disponível em resultados são expressos como uma clustergrama. Modificado a partir da Figura 3 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> Figura 3: Validação da miARN alvo previsto ARNm utilizando um ensaio da luciferase dupla relatório. (A) Esquema representativo de um plasmídeo repórter da luciferase dupla utilizada como uma ferramenta para validar a sequência 3&#39;UTR como um alvo directo de um miARN. (B) micrografia representativa mostrando a eficiência da transfecção. (C) &#160; Sinais, expressos como actividade relativa de luciferase, a partir de 3 humano &amp; #39; genes repórteres UTR ofSOX5 e NR4A3 foi eliminado significativamente para baixo, na presença de HSA-miR-96, e HSA-miR-7 e 17 imita miARN respectivamente. Modificado de Figura 5 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNA </td><td> Gene alvo </td><td> Sites de destino / genes encontrados </td><td> Precisão </td><td> Ponto </td><td> Aggregate P CT </td></tr><tr><td> HSA-miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6,74 </td> &lt;td&gt; 0,94 </td></tr><tr><td> HSA-miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0,72 </td><td> 4.75 </td><td> 0,85 </td></tr><tr><td> HSA-miR-302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0,84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0,94 </td><td> NF </td><td> 0,96 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0,17 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0,17 </td><td> NF </td><td> 0,88 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0,85 </td><td> 5,87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; hsa-miR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0,9 </td><td> 5,87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0,9 </td><td> 5,38 </td><td> 0,63 + 0,37 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0,97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0,94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0,94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Lista de miRNA mRNAs previsão alvo. Representante da tabela miRNAs, alvo genes preditivos, e análise de algoritmos (predizerion / pontuação / agregado fornecido usando Diana Lab, PicTar e TargetScan respectivamente). Modificada a partir da Tabela 3 19.

Com a intenção de caracterizar mudanças em miRNAs em células-tronco neurais humanas diferenciadas (hNSCs), descrevemos a diferenciação de hNSC em um sistema tridimensional, a avaliação de mudanças na expressão de microRNAs por matriz de PCR de miRNA e análise computacional para predição de alvos de miRNAs e sua validação por ensaio de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a diferenciação de microRNA, o perfilamento e a validação de alvos de mRNA de uma linhagem de células-tronco neurais humanas. Isso é realizado primeiramente cultivando células-tronco neurais humanas em um sistema de cultura tridimensional para induzir a diferenciação celular. O segundo passo consiste em quantificar a diferenciação medindo o crescimento dos prolongamentos axonais.Em seguida, as alterações na expressão de microRNAs são avaliadas por meio de matriz micro RNA PCR. Em seguida, realiza-se a análise computacional dos microRNAs diferencialmente expressos selecionados para identificar um conjunto de mRNAs-alvo putativos. Por fim, os mRNAs-alvo são validados por plasmídeo repórter, transfeção e ensaio de dupla luciferase.Assim, o método a ser apresentado aqui pode ajudar a responder questões fundamentais na área de células-tronco neurais, como a caracterização de microRNAs expressos e seus RNAs mensageiros-alvo em células-tronco neurais humanas durante a diferenciação. Embora este método possa fornecer informações sobre a biologia das células-tronco neurais, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de células-tronco, como células-tronco mesenquimais, células-tronco pluripotentes induzidas ou outros sistemas que exijam indução da diferenciação e caracterização molecular.A demonstração visual deste método descompõe as etapas críticas na diferenciação de uma linhagem de células-tronco neurais humanas e na investigação do perfil de microRNA e na validação do mRNA alvo, demonstrando parte do procedimento será Lavania, uma cientista do meu laboratório. Todo este procedimento deve ser realizado em uma cabine de segurança biológica utilizando técnicas assépticas. Reidrate os suportes adicionando a cada poço do AL VX 12.Adicione duas mililitros de etanol 70% preparado com água para irrigação em cada poço. Evite tocar os andamios dispensando o etanol 70% pela parede de cada poço. Aspire cuidadosamente o etanol 70% e lave imediatamente os andamios com dois mililitros por poço de D-M-E-M-F 12 durante um minuto.Repita o procedimento de lavagem duas vezes, aspirando cuidadosamente o D-M-E-M-F 12 após a lavagem final. Revesta os scaffolds adicionando dois mililitros de laminina em D-M-E-M-F 12 para cada poço. Incube a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora com dióxido de carbono a 5% e umidade controlada por no mínimo duas horas.Em seguida, lave a placa com D-M-E-M-F 12 morno, semeando cada scaffolding com aproximadamente 500.000 células-tronco neurais humanas ou H nscs em um volume de 150 microlitros de meio RMM com fatores de crescimento. Incube a placa por três horas para permitir que as células se acomodem nos scaffolds; após três horas, adicione 3,5 mililitros de RMM a cada poço, tomando cuidado para não desalojar as células dos scaffolds.Incube a placa por sete ou 21 dias. Substitua o meio RMM após um dia, que é a primeira alimentação, e troque o meio novamente dois a três dias após a primeira alimentation. Sete e 21 dias após a cultura 3D de H nscs.Remova o meio RMM e fixe as células diferenciadas com paraformaldeído a 4%. As células fixadas são então coradas usando um anticorpo primário contra beta três tubulina, detectado com um anticorpo secundário conjugado a um fluorocromo. Os núcleos celulares são contracontrastados com Hoechst.Capture imagens representativas das células coradas para a tubulina beta três. Utilizando um microscópio fluorescente, salve as imagens no formato TIFF ou JPEG. A medição do crescimento dos processos axonais é realizada utilizando a ferramenta de medição do software Image PRO Plus 7.Para começar, abra a imagem, selecione a opção de medição na barra de ferramentas e escolha o recurso de rastreamento. Para iniciar o rastreamento, selecione o ponto inicial no crescimento do axônio clicando com o botão do mouse e siga ao longo de todo o comprimento do crescimento do axônio; clique com o botão direito para finalizar cada rastreamento. Dessa maneira, meça todos os crescimentos axonais no campo de visão e expresse as medições em pixels ou micrômetros.Exporte as medidas de comprimento para um programa de planilha eletrônica para análise comparativa e estatística das amostras, a fim de avaliar as alterações na expressão de micro RNA dos HSCs cultivados em três dimensões. Primeiro, realize a extração de micro RNA e o preparo do CD NA de micro RNA conforme descrito no protocolo complementar. Texto imediatamente após a obtenção do CD NA de micro RNA.Prepare a mistura dos componentes de PCR para a PCR em tempo real em um tubo de 15 mililitros. Adicione 1375 microlitros de uma mistura mestra verde dois X-S-Y-B-R. 100 microlitros de micro RNA CD NA 275 microlitros do iniciador universal e 1000 microlitros de água livre de RNA transfer.A mistura dos componentes da PCR é transferida para um reservatório de carregamento de PCR. Remova cuidadosamente a placa de PCR de 96 poços do saco lacrado. Usando uma pipeta multicanal, adicione 25 microlitros dos componentes da PCR.Adicione e misture em cada poço do arranjo de PCR. Troque as ponteiras da pipeta após cada etapa de pipetagem para evitar contaminação cruzada entre os poços. Selle o placa de 96 poços com filme adesivo óptico e centrifugue por um minuto a 1000 ×g em temperatura ambiente para remover bolhas. Inspeccione visualmente a placa para garantir que não haja bolhas presentes nos poços.A placa de PCR de 96 poços no programa do ciclador em tempo real. O ciclador em tempo real de acordo com isso. Posteriormente, exporte os valores de CT para todas as poções para uma planilha em branco do Excel para análise de dados do arranjo de PCR, sendo utilizado um algoritmo disponível online, o PIC ktar, para a identificação de alvos preditos de microRNA.Clique em, clique aqui para a previsão de pic ktar em vertebrados para abrir uma nova página na interface web do PIC KTAR. Escolha a espécie no menu suspenso e insira o microRNA de interesse na caixa de ID do microRNA. Clique em pesquisar alvos de um microRNA.Será apresentada uma lista de mRNAs-alvo classificados por pontuação PIC KTAR. Os rankings obtidos são então utilizados para compilar uma tabela comparativa de microRNAs. Um plasmídio repórter de dupla luciferase é usado como ferramenta para validar os mRNAs-alvo; as atividades de luciferase de fogo e renal são medidas 24 horas após a transfeção de células HeLa.Prepare a solução de trabalho um adicionando 50 microlitros de substrato um a 10 mililitros de solução um e misturando completamente. Remova o meio de crescimento celular de cada poço de uma placa de 24 poços e adicione 300 microlitros da solução de trabalho um a cada poço. Transfira 100 microlitros do conteúdo de cada poço da placa de 24 poços para três poços de uma placa de 96 poços. Aguarde 10 minutos e, em seguida, meça a atividade de luciferase de vagalume em um luminômetro configurado para aquisição de luminescência.Prepare a solução de trabalho dois adicionando 50 microlitros de substrato, dois a 10 mililitros da solução dois e misturando completamente. Adicione 100 microlitros da solução de trabalho dois em cada poço da placa de 96 poços já contendo 100 microlitros da solução de trabalho. Aguarde 10 minutos e, em seguida, meça a atividade de luciferase renal.Posteriormente, calcula-se a razão entre a luminiscência da luciferase de vaga-lume e a luciferase renal. Microfotografias representativas de H NSCS em scaffolds 3D foram obtidas após coloração imunoquímica para tubulina beta três, mostrada em verde, e contra-coloração de núcleos com hooks, mostrada em azul. A medição dos processos axonais foi realizada com auxílio de software de análise de imagem. Uma comparação do crescimento dos processos axonais entre H NSCs cultivadas com scaffolds 3D e com superfícies planas tradicionais ou culturas 2D mostra que, após uma semana ou três semanas, as HSCs diferenciadas em 3D exibiram maior crescimento dos processos axonais.A análise computacional para predição de alvos resultou nas informações apresentadas aqui, que incluem uma lista de genes-alvo preditos para microRNAs, além de pontuações de precisão e valores agregados. SOX5 e NR4A3 foram identificados como genes-alvo putativos. Um ensaio repórter de luciferase dual foi utilizado para validar os alvos dos microRNAs, conforme mostrado aqui.A atividade relativa de luciferase a partir de repórteres humanos de regiões UTR três primas dos genes SOX five e NR four A three foi significativamente reduzida na presença das microRNAs indicadas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como diferenciar células-tronco neurais him e investigar a expressão de microRNA e a validação de RNA mensageiro alvo.

differentiation-human-neural-stem-cell-line-on-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo mostra o desenvolvimento e a diferenciação de células-tronco neurais humanas dentro de um andaime tridimensional. Um revestimento de laminina no andaime promove a fixação celular, enquanto um meio neural livre de fator de crescimento induz a diferenciação celular em células progenitoras neurais, que estendem seus processos dentro de uma arquitetura porosa em várias direções, formando uma cultura...

Diferenciando células-tronco neuronais humanas em cultura 3D usando um andaime poroso

Este vídeo demonstra a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas, ou hESCs, diretamente em células progenitoras neurais sem o uso de células alimentadoras ou quaisquer etapas intermediárias. A inibição seletiva das vias de sinalização da proteína morfogenética óssea ou BMP e do fator de crescimento transformador beta, ou TGF-β, leva à diferenciação de hESCs em células progenitoras neurais, ou NPCs.

Diferenciando células-tronco embrionárias humanas em progenitores neurais

Este vídeo demonstra a geração de células progenitoras neurais a partir de células-tronco pluripotentes humanas não transgênicas e transgênicas (hPSCs). As hPSCs são diferenciadas em células progenitoras neurais usando um meio de diferenciação neuronal. Enquanto a diferenciação é induzida em células não transgênicas usando pequenas moléculas, as hPSCs transgênicas são diferenciadas pela adição de um antibiótico que induz o promotor de um fator de transcrição específico de diferenciação neuronal.

Diferenciando Células-Tronco Pluripotentes Humanas Não Transgênicas e Transgênicas em Células Progenitoras Neurais

Neste vídeo, é demonstrado um protocolo passo a passo para células-tronco embrionárias humanas em organoides neurais. O método envolve a indução da formação de rosetas neuronais, seguida de maturação controlada e cultura final em uma membrana hidrofóbica para obter organoides neurais totalmente desenvolvidos.

Diferenciação e Maturação de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Organoides Neurais

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Nós descrevemos uma técnica para usar células-tronco embrionárias murinas para gerar dois ou três corpos embrióides dimensionais. Em seguida, explicar como induzir a diferenciação neuronal das células do corpo embrióides por ácido retinóico, e como para analisar o seu estado de diferenciação por imunofluorescência marcador de células progenitoras e imunotransferência.

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) são consideradas uma ferramenta poderosa para a triagem de drogas e substâncias químicas e para o desenvolvimento de novos modelos in vitro para testes de toxicidade, incluindo neurotoxicidade. Aqui, um protocolo detalhado para a diferenciação de hiPSCs em neurônios e glia é descrito.

Protocolo para a Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Culturas Mistas de Neurônios e Glia para Teste de Neurotoxicidade

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.

Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

Aprenda a diferenciar células-tronco neurais humanas em cultura 3D e analisar perfis de microRNA. Este método computacional valida alvos de mRNA usando ensaios de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo (Vídeo) | JoVE Journal

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

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