Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a diferenciação de micro RNA, perfil e validação de Mr.NA alvo de uma linhagem de células-tronco neurais humanas. Isso é feito primeiro cultivando células-tronco neurais humanas em um sistema de cultura tridimensional para induzir a diferenciação celular. O segundo passo é quantificar a diferenciação medindo o crescimento do processo axônico.

Em seguida, as alterações na expressão de micro RNA são avaliadas pelo arranjo micro R-N-A-P-C-R. A análise computacional de microRNAs diferencialmente expressos selecionados é então realizada para identificar um conjunto de mRNAs alvo putativos. Em última análise, os mRNAs alvo são validados por plasmídeo repórter, transfecção e um ensaio duplo de luciferase.

Portanto, o método a ser apresentado aqui pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco neurais, como a caracterização de microRNAs expressos, e eles têm como alvo os RNAs mensageiros em células-tronco neurais humanas quando estão passando por diferenciação. Embora esse método possa fornecer informações sobre a biologia das células-tronco neurais. Também pode ser aplicado a outros sistemas de células-tronco, como células-tronco mesenquimais, células-tronco pluripotentes induzidas ou outros sistemas que requerem indução de diferenciação e caracterização molecular.

A demonstração visual deste método divide as etapas críticas na diferenciação de uma linha de células-tronco neuros humanas e a investigação do perfil de microRNA e a validação do mRNA alvo demonstrando parte do procedimento será lavania, um cientista do meu laboratório. Todo esse procedimento deve ser realizado em uma cabine de segurança biológica usando técnicas assépticas. Reidrate os andaimes adicionando a cada poço do AL VX 12.

Poço placa dois mililitros de 70% de etanol preparado com água para irrigação. Evite tocar nos andaimes dispensando o etanol 70% na parede de cada um. Bem, aspire cuidadosamente o etanol 70% e lave imediatamente os andaimes com dois mililitros por poço de D-M-E-M-F 12 por um minuto.

Repita o procedimento de lavagem duas vezes aspire cuidadosamente o DMF 12 após a lavagem final. Cubra os andaimes adicionando dois mililitros de laminina em D-M-E-M-F 12 a cada um. Bem, incube a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono por um mínimo de duas horas.

Em seguida, lave a placa com sementes DMEF 12 quentes em cada andaime com aproximadamente 500.000 células-tronco neurais humanas ou H nscs em um volume de 150 microlitros de meio RMM com fatores de crescimento. Incube a placa por três horas para permitir que as células se assentem nos andaimes após três horas. Adicione 3,5 mililitros de RMM a cada poço Tomando cuidado para não desalojar as células dos andaimes.

Incube a placa por sete ou 21 dias. Substitua o meio RMM após um dia, que é a primeira alimentação, e substitua o meio novamente dois a três dias após a primeira alimentação. Sete e 21 dias após a cultura 3D de H nscs.

Remova o meio RMM e fixe as células diferenciadas com aldeído paraforme 4%. As células fixadas são então coradas usando um anticorpo primário de tubulina beta três detectado com um fluorocromo conjugado. Os núcleos das células de anticorpos secundários são contra-corados com ganchos.

Capture imagens representativas das células coradas com tubulina beta três. Usando um microscópio fluorescente, salve as imagens no formato TIFF ou JPEG. A medição do crescimento do processo axonal é realizada usando a ferramenta de medição de software image PRO plus seven.

Para começar a abrir a imagem, selecione a opção de medição na barra de ferramentas e selecione o recurso de rastreamento. Para iniciar o rastreamento, selecione o ponto inicial no crescimento do axônio clicando com o botão do mouse traçar ao longo de todo o comprimento do crescimento do axônio clique com o botão direito do mouse para concluir cada traço. Desta forma, meça todas as conseqüências axônicas dentro do campo de visão expressar medições como pixels ou micrômetros.

Exportar medições de comprimento para um programa de planilha para análise comparativa e estatística de amostras para avaliar mudanças na expressão de micro RNA dos HSCs cultivados tridimensionalmente. Primeiro execute a extração de micro RNA e a preparação de micro RNA CD NA conforme descrito no protocolo anexo. Texto imediatamente após a obtenção do micro RNA CD NA.

Prepare a mistura de componentes de PCR para a PCR em tempo real em um tubo de 15 mililitros. Adicione 1375 microlitros de uma mistura master verde de dois X-S-Y-B-R. 100 microlitros de micro RNA CD NA, 275 microlitros do primer universal e 1000 microlitros de transferência de água livre de RNAs.

Os componentes de PCR se misturam a um reservatório de carga de PCR. Remova cuidadosamente a matriz de PCR de placa de 96 poços de sua bolsa lacrada. Usando um pipetador multicanal, adicione 25 microlitros dos componentes de PCR.

Misture em cada poço da matriz de PCR. Troque as pontas da pipeta após cada etapa de pipetagem para evitar contaminação cruzada entre a vedação dos poços. A placa de 96 poços com filme adesivo óptico e centrifugação por um minuto a 1000 GS à temperatura ambiente para remover bolhas inspeciona visualmente a placa para garantir que não haja bolhas no local dos poços.

A matriz de PCR de placa de 96 poços no programa de ciclagem em tempo real. O ciclador em tempo real de acordo. Posteriormente, exporte os valores de CT de todos os poços para uma planilha Excel em branco para análise de dados de matriz de PCR, um algoritmo que está disponível online PIC ktar é usado para a identificação de alvos de micro RNA previstos.

Clique em, clique aqui para previsão de pic ktar em vertebrados para abrir uma nova página na interface da web PIC KTAR. Escolha a espécie no menu suspenso e insira o micro RNA de interesse na caixa de identificação do micro RNA. Clique em pesquisar alvos de um micro RNA.

Uma lista de mRNAs alvo classificados por uma pontuação PIC KTAR será apresentada. As classificações obtidas são então usadas para compilar uma tabela comparativa de microRNAs. Um plasmídeo repórter duplo de luciferase é usado como uma ferramenta para validar os mRNAs alvo As atividades de vaga-lume e luciferase renal são medidas 24 horas após a transfecção das células hela.

Prepare a solução de trabalho um adicionando 50 microlitros de substrato, um em 10 mililitros de solução um e misturando completamente remova o meio de crescimento celular de cada poço da placa de 24 poços e adicione 300 microlitros de solução de trabalho um a cada um. Transfira 100 microlitros do conteúdo de cada poço. Da placa de 24 poços para três poços de uma placa de 96 poços, aguarde 10 minutos e, em seguida, meça a atividade da luciferase do vaga-lume em um conjunto de luminômetros para aquisição de luminescência.

Prepare a solução de trabalho dois adicionando 50 microlitros de substrato, dois a 10 mililitros da solução dois e misturando bem. Adicione 100 microlitros de solução de trabalho dois em cada poço da placa de 96 poços que já contém 100 microlitros de solução de trabalho. Espera-se por 10 minutos e, em seguida, mede-se a atividade renal da elluciferase.

Posteriormente, a proporção de luminescência da luciferase do vaga-lume para a luciferase renal é calculada. Microfotografias representativas de H NSCS em andaimes 3D foram adquiridas após coloração imunoquímica para beta três tubulina mostrada em verde e contra-coloração de núcleos com ganchos mostrados em azul, a medição dos processos axônicos foi realizada com o auxílio de um software de análise de imagem. Uma comparação do crescimento do processo axonal entre H nscs cultivados com scaffolds 3D e com culturas tradicionais de superfície plana ou 2D mostra que em uma semana ou três semanas os HSCs diferenciados 3D exibiram maior crescimento do processo axonal.

A análise computacional para predição de alvos resultou nas informações aqui apresentadas: uma lista de microRNAs, genes alvo previstos e pontuação de precisão e valores agregados. SOX cinco e NR quatro A três foram identificados como genes-alvo putativos. Um ensaio repórter de luciferase dupla foi usado para validar os alvos dos microRNAs, conforme mostrado aqui.

A atividade relativa da luciferase dos três principais repórteres UTR humanos dos genes SOX cinco e NR quatro A três foi significativamente reduzida na presença dos microRNAs indicados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como diferenciá-lo em células-tronco neurais e investigar a expressão de micro RNA e a validação do Messenger.RNA alvo.