Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

O objetivo geral deste procedimento é derivar de forma eficiente células-tronco pluripotentes induzidas por meio de reprogramação episomal a partir de dois tipos diferentes de células-tronco fetais. Este método pode ajudar a fornecer uma fonte de células-tronco pluripotentes para engenharia de tecidos, modelagem de doenças, pesquisa básica ou estudos longitudinais. A principal vantagem desta técnica é que a reprogramação e a maturação das iPSCs ocorrem em condições quimicamente definidas, estando disponíveis precocemente para potenciais terapias pediátricas baseadas em células.

Demonstrará este procedimento Steven McClellan, o pesquisador principal, e eu mesmo. Obtenha placentas o mais rápido possível após o nascimento. Corte um segmento de nove centímetros quadrados do âmnio e lave-o em um tubo cônico de 50 mililitros com 30 mililitros de PBS suplementado com solução antibiótica e antimicótica.

Remova coágulos sanguíneos das membranas e, em seguida, use um par de escalpelos finos para picar as membranas em pedaços pequenos em uma placa de cultura de tecidos estéril de 10 centímetros. Use as lâminas de escalpelo para transferir a massa de tecido membranoso picado para um tubo de dissociação tecidual contendo 4,7 mililitros de meio RPMI-1640. Incorpore as enzimas de dissociação.

Monte o tubo no dissociador de tecidos e execute o programa h_tumor_01. Em seguida, incube o tubo a 37 graus Celsius em uma plataforma oscilante por 30 minutos. Dilua ainda mais a suspensão com 35 mililitros de RPMI-1640 e aplique em uma peneira de 70 micrômetros colocada sobre um tubo cônico de 50 mililitros.

Centrifugue por cinco minutos a 200 vezes g em temperatura ambiente. Após descartar o sobrenatante, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de RPMI-1640 e conte as células utilizando um hemocitômetro. Semee as células em aglomerados a uma densidade de aproximadamente 10.000 células por centímetro quadrado em frascos de cultura celular contendo meio AFMC recém-preparado suplementado com solução antibiótica e antimicótica.

Colete células-tronco de líquido amniótico e membrana com baixo número de passagens para reprogramação a partir de um frasco T75 adicionando dois mililitros de enzima de destacamento celular à camada celular. Incube a 37 graus Celsius por cinco a oito minutos. Após a centrifugação a 200 × g por 45 minutos, ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS e misture bem para remover componentes do soro.

Conte as células utilizando um hemocitômetro. Em seguida, ajuste a densidade celular para 100.000 células por mililitro de PBS e distribua em quatro tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro. Coloque os tubos microcentrífugos em tubos de poliestireno de cinco mililitros para permitir a centrifugação em um rotor oscilante comum e centrifugue a 200 × g durante quatro minutos à temperatura ambiente.

Após a centrifugação, inverta os tubos e descarte o sobrenadante em um recipiente de resíduos; em seguida, realize uma etapa adicional de centrifugação a 200 vezes g durante três minutos. Após a centrifugação, use uma pipeta de 200 microlitros para aspirar cuidadosamente o líquido remanescente dos tubos. Coloque as ponteiras de transfeção, o tubo, o tampão de ressuspendimento e o tampão eletrolítico dentro do gabinete de cultura de tecidos.

Mova o dispositivo de transfeção para perto, de modo que sua estação de tubos possa ser colocada diretamente dentro do gabinete. Encha um tubo de transfeção com três mililitros de tampão eletrolítico e monte o tubo na estação empurrando-o completamente para dentro do encaixe. Retire alíquotas previamente preparadas da solução de plasmídeo de reprogramação do armazenamento a menos 80 graus Celsius e deixe-as descongelar à temperatura ambiente dentro do gabinete de cultura.

Defina os parâmetros de transfeção no aparelho para aplicar um pulso de 40 milissegundos a 950 volts. Re-suspenda o pellet contendo 100.000 células em 10 microlitros de tampão de re-suspensão. Trabalhando rapidamente, adicione 1/10 da solução de plasmídeo de reprogramação às células re-suspensas.

Acople a ponteira de transfeção à pipeta de transfeção. Em seguida, aspire cuidadosamente a suspensão celular para dentro da ponteira de transfeção, evitando a formação de bolhas de ar. Insira a pipeta de transfeção no tubo de transfeção.

E pressione o botão de início na tela do dispositivo de transfeção. Aguarde a mensagem na tela sobre o sucesso da transfeção. Em seguida, remova imediatamente a pipeta do tubo.

Expulse a suspensão em um poço das placas de seis poços-alvo. Misture com o meio de um poço vizinho e distribua a suspensão igualmente entre os dois poços. Repita a transfeção para cada tubo de microcentrífuga com células.

Inicie adicionando 30 microlitros de EDTA 0,5 milimolar e PBS a cinco tubos de PCR. Em seguida, coloque uma ponteira em uma pipeta de 10 microlitros ajustada para dois microlitros. Mantenha a ponteira da pipeta em um ângulo na borda da colônia e, com cuidado e gradualmente, raspe toda a colônia da superfície.

Aspire imediatamente toda a colônia para dentro da ponteira, e transfira-a para um dos tubos de PCR preparados com EDTA. Após repetir o processo com outras quatro colônias, incube em temperatura ambiente por quatro a seis minutos. Utilize uma ponteira maior para pipetar suavemente para cima e para baixo cada suspensão celular, a fim de fragmentar a colônia em agregados menores.

Evite criar uma suspensão de células isoladas. Em seguida, plaque a suspensão diretamente no poço-alvo de uma placa de 24 poços revestida com vitronectina recombinante. Após repetir o processo para as colônias restantes, incube por três a seis dias.

Após quatro a seis dias, quando as colônias tiverem crescido e se tornado compactas, lave as camadas celulares com 300 microlitros de EDTA 0,5 milimolar e aspire imediatamente. Em seguida, adicione outros 300 microlitros e incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Após aspirar o EDTA, ajuste uma pipeta de um mililitro à capacidade máxima, acople uma ponteira larga de um mililitro e aspire o meio E8 do poço-alvo de uma placa de seis poços revestida com vitronectina.

Jorre um filete do meio em um poço da placa de origem para remover a cultura de iPSCs. Em seguida, transfira a suspensão para o poço-alvo e pipete para cima e para baixo várias vezes para fragmentar as colônias em agregados de 20 a 40 células. Após o plaqueamento de todas as células, certifique-se de que os agregados estejam distribuídos uniformemente, movendo suavemente a placa para frente e para trás e agitando-a levemente.

Em seguida, retorne a placa ao incubador para adesão dos agregados e crescimento das colônias. As células-tronco do líquido amniótico e da membrana, que representam as células fonte para reprogramação, exibem uma morfologia mesenquimal típica, alongada e com brilho de fase. As células adquirem propriedades epiteliais após passarem pela transição mesenquimal para epitelial, o que leva à formação de colônias com células semelhantes a calçamento.

Essas colônias proliferam e criam massas celulares irregulares de células MET. Nos estágios posteriores do reprogramamento, surgem colônias de células totalmente reprogramadas, com células individualmente discerníveis e bordas bem definidas. Essas células totalmente reprogramadas estão presentes ao lado de colônias MET, que são mais numerosas.

Um clone maduro isolado totalmente reprogramado é mostrado aqui. Após a derivação e maturação de iPSCs, eles podem ser submetidos a uma caracterização detalhada e direcionados à diferenciação em uma variedade de tipos celulares. Não se esqueça de que trabalhar com tecidos humanos que não foram testados quanto à presença de patógenos pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de equipamento de proteção individual e o trabalho dentro de uma cabine de segurança biológica, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir pluripotência em células-tronco fetais, quais reagentes e equipamentos utilizar e como cultivar rotineiramente células-tronco pluripotentes.