Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

O objetivo geral deste procedimento é derivar eficientemente células-tronco pluripotentes induzidas por meio de reprogramação episómica de dois tipos diferentes de células-tronco fetais. Este método pode ajudar a fornecer uma fonte de células-tronco pluripotentes para engenharia de tecidos, modelagem de doenças, pesquisa básica ou estudos longitudinais. A principal vantagem dessa técnica é que a reprogramação e a maturação das iPSCs ocorrem em condições quimicamente definidas, ao mesmo tempo em que estão disponíveis precocemente para possíveis terapias pediátricas baseadas em células.

Demonstrando este procedimento estará Steven McClellan, o investigador principal, e eu. Obtenha placentas o mais rápido possível após o nascimento. Corte o segmento de nove centímetros quadrados do âmnio e lave-o em um tubo de centrífuga de 50 milímetros com 30 mililitros de PBS suplementado com solução antibiótica e antimicótica.

Remova os coágulos sanguíneos das membranas e, em seguida, use um par de bisturis finos para picar as membranas em pedaços finos em uma placa de cultura de tecidos estéril de 10 centímetros. Use as lâminas do bisturi para transferir a massa de tecido da membrana picada para um tubo de dissociação de tecido contendo 4.7 mililitros de meio RPMI-1640. Misture as enzimas de dissociação.

Monte o tubo no dissociador de tecido e execute o programa h_tumor_01. Em seguida, incube o tubo a 37 graus Celsius em uma plataforma de balanço por 30 minutos. Dilua ainda mais a suspensão com 35 mililitros de RPMI-1640 e aplique a um filtro de 70 mícrons colocado sobre um tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Centrifugue durante cinco minutos a 200 vezes g à temperatura ambiente. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de RPMI-1640 e conte as células usando um hemocitômetro. Semeie as células em aglomerados de células a uma densidade de aproximadamente 10.000 células por centímetro quadrado em frascos de cultura de tecidos com meio AFMC recém-preparado suplementado com solução antibiótica e antimicótica.

Colha células-tronco de membrana e líquido amniótico de baixo número de passagem para reprogramação de um frasco T75, adicionando dois mililitros de enzima de descolamento celular à folha de células. Incube a 37 graus Celsius por cinco a oito minutos. Após centrifugação a 200 vezes g por 45 minutos, ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS e misture bem para lavar os componentes do soro.

Conte as células usando um hemocitômetro. Em seguida, ajuste a densidade celular para 100.000 células por mililitro de PBS e agora quad em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Coloque os tubos de microcentrífuga em tubos de poliestireno de cinco mililitros para permitir a centrifugação em um leme de giro regular e centrifugue a 200 vezes g por quatro minutos em temperatura ambiente.

Após a centrifugação, inverter os tubos e rejeitar o sobrenadante para um recipiente de resíduos e, em seguida, efectuar uma centrifugação suplementar a 200 vezes g durante três minutos. Após a centrifugação, use uma pipeta de 200 microlitros para aspirar cuidadosamente o líquido restante dos tubos. Coloque pontas de transfecção, tubo, tampão de ressuspensão e tampão eletrolítico no armário de cultura de tecidos.

Aproxime o dispositivo de transfecção para que sua estação de tubo possa ser colocada diretamente no gabinete. Encha um tubo de transfecção com três mililitros de tampão eletrolítico e monte o tubo na estação empurrando-o totalmente para dentro do slot. Retire alíquotas previamente preparadas da solução de plasmídeo de reprogramação do armazenamento de 80 graus Celsius negativos e deixe-as descongelar à temperatura ambiente no gabinete de cultura.

Defina os parâmetros de transfecção no dispositivo para fornecer um pulso de 40 milissegundos a 950 volts. Ressuspenda o pellet contendo 100.000 células em 10 microlitros de tampão de ressuspensão. Trabalhando rapidamente, adicione 1/10 da solução de plasmídeo de reprogramação às células ressuspensas.

Monte a ponta de transfecção na pipeta de transfecção. Em seguida, aspire a suspensão celular na ponta de transfecção com cuidado, evitando a formação de bolhas de ar. Insira a pipeta de transfecção no tubo de transfecção.

E pressione o botão Iniciar na tela do dispositivo de transfecção. Aguarde a mensagem na tela sobre o sucesso da transfecção. Em seguida, remova a pipeta do tubo imediatamente.

Expulse a suspensão em um poço das placas de seis poços alvo. Misture o meio de um poço vizinho e distribua a suspensão igualmente em ambos os poços. Repita a transfecção para cada tubo de microcentrífuga com células.

Comece adicionando 30 microlitros de EDTA 0,5 milimolar e PBS a cinco tubos de PCR. Em seguida, coloque uma ponta em uma pipeta de 10 microlitros ajustada para dois microlitros. Segure a ponta da pipeta em um ângulo na borda da colônia e, cuidadosa e gradualmente, raspe toda a colônia da superfície.

Aspire imediatamente toda a colônia para a ponta da pipeta e transfira-a para um dos tubos de PCR preparados com EDTA. Depois de repetir o processo com outras quatro colônias, incube em temperatura ambiente por quatro a seis minutos. Use uma ponta de pipeta maior para pipetar cada suspensão celular para cima e para baixo suavemente para quebrar a colônia em aglomerados menores.

Evite criar uma suspensão de célula única. Em seguida, coloque a suspensão diretamente no poço alvo de uma placa recombinante de 24 poços revestida com vitronectina. Depois de repetir o processo para as colônias restantes, incube por três a seis dias.

Após quatro a seis dias, quando as colônias crescerem e se tornarem compactas, lave as folhas de células com 300 microlitros de EDTA 0,5 milimolar e aspire imediatamente. Em seguida, adicione mais 300 microlitros e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois de aspirar o EDTA, ajuste a capacidade de uma pipeta de um mililitro, monte na ponta de um mililitro de diâmetro largo e aspire o meio E8 do poço alvo de uma placa de seis poços revestida com vitronectina.

Esguiche um jato do meio em um poço da placa de origem para lavar a cultura iPSC. Em seguida, transfira a suspensão para o poço alvo e pipete para cima e para baixo várias vezes para quebrar as colônias em aglomerados de 20 a 40 células. Depois de revestir todas as células, certifique-se de que os aglomerados sejam distribuídos uniformemente, balançando e sacudindo suavemente a placa.

Em seguida, retorne a placa para a incubadora para adesão de touceiras e crescimento de colônias. O líquido amniótico e as células-tronco de membrana, que representam as células-fonte para reprogramação, exibem uma morfologia mesenquimal típica, alongada e de fase brilhante. As células adquirem propriedades epiteliais após sofrerem a transição mesenquimal para epitelial, o que leva à formação de colônias com células semelhantes a paralelepípedos.

Essas colônias proliferam e criam massas celulares irregulares de células MET. Nos estágios posteriores da reprogramação, surgem colônias de células totalmente reprogramadas, células discerníveis individualmente com bordas bem definidas. Essas células totalmente reprogramadas estão presentes ao lado de colônias MET que são mais numerosas.

Um clone maduro isolado totalmente reprogramado é mostrado aqui. Após a derivação e maturação do iPSC, eles podem ser submetidos a caracterização detalhada e direcionar a diferenciação em uma variedade de tipos de células. Não se esqueça de que trabalhar com tecidos humanos que não foram testados quanto à presença de patógenos pode ser extremamente perigoso, e precauções como equipamentos de proteção individual e trabalho no gabinete de biossegurança devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir a pluripotência em células-tronco fetais, quais reagentes e equipamentos usar e como cultivar rotineiramente células-tronco pluripotentes.