Name: Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a quantificar proteínas em nível de molécula única para análise de rotulagem homogênea. Este método revela heterogeneidades invisíveis em técnicas de medição em massa tradicionais.

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Os autores Obrigado Masae Ohno e Kazuya Nishimura para aconselhamento e assistência experimental. Este trabalho foi apoiado por PRESTO (JPMJPR15F7), Japão de ciência e tecnologia agência, Grants-in-aid para jovens cientistas (A) (24687022), pesquisa exploratória desafiador (26650055) e pesquisa científica em áreas inovadoras (23115005), sociedade de Japão para a promoção da ciência e por doações da Fundação de ciência de Takeda e Fundação Memorial Mochida para pesquisa farmacêutica e médica. S.L. reconhece o apoio do programa de RIKEN internacional programa associar (IPA).

1. preparação da pilha
<ol><li>Cultivar as células de HeLa em um prato de 10 cm a 37 ° C abaixo de 5% de CO2 em Dulbecco é modificado médio da águia contendo 10% de soro fetal bovino.</li>
	<li>Recolha pilhas exponencialmente crescentes, uma vez que eles chegaram a confluência de 70%, seguindo as instruções de ATCC17.<ol>
<li>Enxague as células com 5 mL de 1x salina tamponada fosfato (PBS) (pH 7,4). Remova a PBS.</li>
		<li>Adicione 1 mL de 0,1% de ácido de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Incubar a 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>Monitore a progressão da dissociação celular por microscopia.</li>
		<li>Uma vez que as células tornam-se redondo e são desanexadas do prato, adicione 4 mL de meio de crescimento e quebrar a aglomeração de células pipetando.</li>
		<li>Conte o número de células, usando um contador de célula.</li>
		<li>Centrifugar a 150 x g durante 10 minutos num tubo de centrífuga. Remover o meio e ressuspender as células com 5 mL de 1X PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Repita a etapa 1.2.6. Ressuspender as células em 1X PBS (pH 7,4) a uma concentração final de 106 células/mL, utilizando o número de contagem na etapa 1.2.5. Nota: A suspensão de eritrócitos pode ser aliquotadas e armazenado a-80 ° C durante vários meses. Repetir um ciclo de congelamento/descongelamento deve ser evitado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. celular Lise e rotulagem fluorescente
<ol><li>Fazer 10 mL de tampão de lise (borato de 0,1 M, 1% sulfato dodecyl de sódio (SDS) e 1% Tween 20). Ajuste o pH 12 usando 2 M de NaOH. Cuidado: NaOH concentrado é corrosivo. Use óculos e luvas adequadas ao preparar esta solução. Nota: Tampão de Lise pode ser armazenado por até uma semana à temperatura ambiente.</li>
	<li>Mix 100 μL de Lise buffer com 1 μL de 1m ditiotreitol (DTT) e 4 μL de 50% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CAPS).</li>
	<li>Misturar 1 μL da cultura de pilha (aproximadamente 1.000 células) com o misto lysing buffer da etapa 2.2. Homogeneizar a solução pipetando lentamente para evitar bolhas. Incube no escuro à temperatura ambiente por 5 min com agitação suave. Re-homogeneizar a solução pipetando lentamente.</li>
	<li>Adicione 1 μL de 2 μg/mL tintura de Cy3 NHS-éster. Homogeneizar a solução pipetando lentamente para evitar bolhas. Incube durante 5 min no escuro à temperatura ambiente com agitação suave. Nota: O pH elevado desta reserva provoca a neutralização dos resíduos de lisina em proteínas, levando a uma maior reactividade.</li>
	<li>Repeti a adição de 1 μL de 2 μg/mL tintura de Cy3 NHS-éster. Homogeneizar a solução pipetando lentamente para evitar bolhas. Incube durante 10 min no escuro à temperatura ambiente com agitação suave. Nota: Esta repetida adição de corante de NHS-éster pode aumentar a eficiência de rotulagem porque alguns do corante Cy3 NHS-éster é hidrolisado e desativado pelo pH elevado do buffer de reação.</li>
	<li>Ajustar o pH 7,2, adicionando 100 μL de 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES)-NaOH pH 7.2 para saciar a reação. Homogeneizar a solução pipetando lentamente para evitar bolhas.</li>
	<li>Adicionar 20 μL de 19 mg/mL-biotina (polietileno glicol (PEG))2-amina e 5 μL de 20 mg/mL 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Homogeneizar a solução pipetando lentamente para evitar bolhas. Incube durante 1 h no escuro à temperatura ambiente com agitação suave. Nota: Este passo biotinylation é necessário fixar as moléculas de proteína em uma lamela de microscópio em uma densidade fixa e com nenhuma polarização para espécies de proteína.</li>
	<li>Remover os reagentes de rotulagem não tenha reagidos e concentrar a amostra usando uma coluna de ultrafiltração com 10 kDa Cut-off, seguindo as instruções do fabricante. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. A amostra pode ser armazenada a-80 ° C durante várias semanas.</li>
</ol>3. recuperação e separação do proteoma
<ol><li>Adicione 4 x tampão de amostra SDS (200 mM Tris-HCl pH 6,8, SDS de 4%, 4% de glicerol e 0,4% de bromofenol). Nota: Para evitar danos de tintura, a amostra de proteína não deve ser aquecida, como feito em SDS-PAGE padrão e deve ser mantida em temperatura ambiente.</li>
	<li>Execute o padrão de SDS-PAGE para a amostra de proteína e uma escada molecular, usando o gel do acrilamido de 20%. Migrar a amostra no gel com uma tensão constante (160 V) até a migração frente sai só o gel.</li>
	<li>Imagem do gel para identificar a localização das bandas de proteínas (Figura 3).</li>
	<li>Corte as porções de gel incluindo frações proteicas de interesse usando uma lâmina afiada, baseada nas posições da banda. Fracionamento em picos de 16, 23, 55 e 120 kDa e em 19 – 25, 25-32, 32-42, 42-54, 54-69, 69-97, 97 – 136 e 136 – 226 kDa regiões são mostradas na Figura 3.</li>
	<li>Extrato de proteínas usando uma dialyzer por electroelution com um tamanho de poro de 6 – 8 kDa, seguindo as instruções do fabricante. Nota: A amostra coletada pode ser armazenada a-80 ° C durante várias semanas.</li>
</ol>4. preparação de lamela microscópio
<ol><li>Prepare-se para cada amostra 200 μL de tampão de avidina (pH 5 mM HEPES-NaOH 7.2, 10 avidin ng/mL e 2 mg/mL albumina de soro bovino (BSA)).</li>
	<li>Prepare as lamelas de 22 x 22 mm e 0,15 mm de espessura. Expor as lamelas para ar plasma usando um plasma líquido de limpeza para 1 min para limpar e ativar suas superfícies.</li>
	<li>Casaco de lamelas com avidina por rotação-revestimento 200 μL de tampão de avidina, usando um aplicador de rotação durante 5 segundos a 500 rpm, seguido de 30 segundos a 1.000 rpm. Incube as lamelas durante 15 minutos à temperatura ambiente para deixá-los secar.</li>
	<li>Prepare-se para a amostra de proteína lamelas.<ol>
<li>Dilua a amostra de proteína (de 3.5) 100 vezes em pH 5 mM HEPES-NaOH 7.2.</li>
		<li>Lugar de 100 μL de amostra diluída na superfície no centro da lamela avidina-revestido (da etapa 4.3).</li>
		<li>Incube no escuro durante 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o controlo positivo.<ol>
<li>Lugar de 100 μL de 10 ng/mL purificado fluorescente biotina em 5 mM HEPES-NaOH pH 7.2 no centro do avidin revestido lamela (da etapa 4.3).</li>
		<li>Incube no escuro durante 15 minutos à temperatura ambiente. Nota: Esta lamela de controlo positivo fornece a densidade de avidina pontos de ligação, que é usado para calcular o LO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o controle negativo.<ol>
<li>Rotação-casaco o plasma limpos lamela com 200 μL de 5mm BSA HEPES-NaOH e 2 mg/mL (sem avidina).</li>
		<li>Incube durante 15 minutos à temperatura ambiente para secar.</li>
		<li>Adicione 100 μL de 10 ng/mL purificado fluorescente biotina em pH 5 mM HEPES-NaOH 7.2.</li>
		<li>Incube no escuro durante 15 minutos à temperatura ambiente. Nota: Esta lamela de controlo negativo fornece a quantidade de ligação não-específica de biotina fluorescente para a lamela sem avidina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave cada lamela com 200 µ l de água destilada pipetando nas bordas da lamela para não tocar no meio da lamela com a ponta. Repeti esta lavagem três vezes. Nota: Depois de aspirar água na lamela, água deve ser imediatamente colocada na lamela para evitar sequem completamente.</li>
	<li>Expor o plasma de ar para o mesmo número de lamelas etapa 4.2.</li>
	<li>Coloca a lamela limpada na lamela ligados a amostra da etapa 4.7 para evitar a secagem.</li>
</ol>5. observação com microscopia de fluorescência única molécula
<ol><li>Arranque de um microscópio de fluorescência de campo largo-campo ou evanescente. Cuidado: Direto ou radiação laser dispersas pode causar olho ou danos de pele. Use óculos de protecção adequados e proteger o trajeto da luz do laser. Nota: Para a instalação do microscópio, refira por favor nosso anterior publicação16. Brevemente, um microscópio de fluorescência de campo largo-campo ou evanescente equipado com uma excitação de laser de alta potência 488 nm, uma lente objetiva de abertura numérica elevada e uma câmera de alta sensibilidade pode ser usado para esta medição. Além disso, para uma medição automatizada, um palco de amostra translação XY controlada por computador, obturadores mecânicos por excitações do laser e um sistema de auto-foco são recomendados para ser instalado.</li>
	<li>Definir a lamela no microscópio e encontrar o foco.</li>
	<li>Execute uma verificação de telha para obter pelo menos 100 imagens. Nota: A iluminação do laser deve ser controlada com obturadores mecânicos para ser exposto à amostra somente quando a gravação de imagens com a câmera, para minimizar o fotobranqueamento. Se houver muitas amostras, usando um programa de computador para controlar os microscópio dispositivos automáticos de medição é recomendado. Cada imagem inclui normalmente 100-500 pontos de molécula quando usando uma lente objetiva de 60 x.</li>
</ol>6. análise e extração de informações de imagem
<ol><li>Se a imagem tiver irregularidades devido o padrão de iluminação laser, realize processamento de imagem para corrigi-lo18.<ol>
<li>Adquira uma imagem de referência, medindo-se com uma amostra de lamela consistindo de corantes uniformemente difundido usando uma câmera definindo a mesma como na etapa 5.3.</li>
		<li>Adquira uma imagem deslocamento medindo com nenhuma excitação do laser, usando a mesma configuração de câmera.</li>
		<li>Subtrai a cada valor de pixel em cada imagem de amostra e a imagem de referência com o valor da imagem deslocada.</li>
		<li>Divida cada valor de pixel na imagem de amostra subtraídos pelo valor da imagem de referência subtraídos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolher imagens adquiridas corretamente e remova o fundo da imagem.<ol>
<li>Remova imagens contendo grandes agregados fluorescentes manualmente.</li>
		<li>Remova o fundo da imagem, aplicando o algoritmo de bola rolando-19 com um raio de bola de 50 pixels usando o ImageJ20.</li>
		<li>Aguçar imagens subtraindo imagens borradas, usando o ImageJ (aguçar a função de imagem).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Encontrar e analisar pontos da molécula em imagens.<ol>
<li>Identifica pontos de molécula com o limiar ienes do algoritmo21 usando o ImageJ.</li>
		<li>Filtre pontos com menos de dois pixels para excluir o escuro ruído da câmera e manchas mais de 20 pixels para excluir as agregações de proteínas usando o ImageJ (gerente de ROI).</li>
		<li>Conte o número de pontos em cada imagem. Usando imagens corrigidas (etapa 6.1.4), analisar a iluminação total intensidades dentro de pixels para cada local usando o ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule a ocupação de rotulagem (LO) usando a seguinte fórmula: LO = (número de contagens na amostra / número de contagens em controlo positivo) x 100</li>
	<li>Calcule o número médio de corantes fluorescentes, ligadas a uma molécula de proteína única (n̄corante).<ol>
<li>Analise um histograma das intensidades de cada ponto. Nota: O histograma geralmente tem vários picos, e cada pico representa um diferente número de moléculas de corante, ligado a uma proteína. O primeiro, segundo e terceiro pico no histograma corresponde às moléculas de 1, 2 e 3, respectivamente.</li>
		<li>Calcule a intensidade média de histograma. Também Calcule a intensidade do pico do primeiro pico aplicando um encaixe Gaussian.</li>
		<li>Calcule n̄corante dividindo a intensidade média com o pico de intensidade.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Background-free%2C+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li>
<li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain%3A+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li>
<li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li>
<li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On%2Foff+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li>
<li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li>
<li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li>
<li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li>
<li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li>
<li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li>
<li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li>
<li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li>
<li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIan+Freshney%2C+R+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2015).</li>
<li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li>
<li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li>
<li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li>
<li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22EuPA+Open+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li>
<li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li>
<li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. igh- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed%2C+Comprehensive%2C+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li>
</ol>

Os autores declaram o interesse financeiro concorrentes seguintes: RIKEN entrou com um pedido de patente sobre esses resultados com S.L. e Y.T. nomeado como co-inventores.

Este artigo descreve um protocolo para quantificar a homogeneidade de rotulagem de cada espécie de etiquetado proteína nas células após a separação com SDS-PAGE (etapa 3). O método de separação pode ser substituído por outros métodos, como a cromatografia líquida ou eletroforese capilar, que permitem a separação e fracionamento das proteínas celulares com alta resolução, exigindo equipamentos especiais23. O método de rotulagem utilizando NHS-éster no protocolo atual pode ser substituído por outros...

Análise de proteoma, que visa quantificar todo o conjunto de moléculas de proteínas expressado na célula, é uma abordagem valiosa em estudos biológicos e medicamentos atuais. Esta análise baseia-se geralmente na espectrometria de massa, que identifica a espécie de proteína baseado em espectros gerados através da ionização de proteína1,2,3. Um método alternativo para análise de proteoma é electroforese, incluindo a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), eletroforese capilar e eletroforese bidimensional (2D) gel. Este método baseia-se na rotulagem fluorescente específico de todas as moléculas de proteína nas células analisadas, seguidas através de separação eletroforética e detecção e quantificação de cada espécie de proteína. Para atingir a rotulagem obrigatório específico de proteína, uma estratégia é usar tinturas fluorescentes que podem ligar às proteínas através de interações eletrostáticas e hidrofóbicas, tais como o azul de Coomassie e Ruby-Sypro4,5,6 . Uma estratégia alternativa é usar a rotulagem covalente com corantes contendo éster de N-Hidroxisuccinimida (NHS) ou maleimide, que pode ligar covalentemente a proteínas através de resíduos comuns, tais como aminas primárias e tióis, respectivamente,7, 8.
Entretanto, a sensibilidade da deteção de fluorescência é ideal para a análise de proteínas de baixo-abundância e pequeno número de células. Imagens de fluorescência única molécula é um dos métodos mais sensíveis que permite a detecção de corantes fluorescentes individuais e as proteínas etiquetadas em vitro e in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Aplicação deste método de imagem para análise de proteoma baseada em eletroforese é esperada para permitir ensaios altamente sensíveis e quantitativos pela contagem individuais proteínas fluorescente-labeled. No entanto, isso ainda não está claro se etiquetando com corantes fluorescentes é bastante homogêneo em todas as moléculas de proteína, e como esta homogeneidade é afectada por espécies diferentes proteínas (Figura 1). Medições de solução simples em massa podem ser usadas para obter uma relação molar de corantes fluorescentes para proteínas chamadas 'eficiência de acoplamento'8 ou 'rotulagem eficiência', mas essa propriedade não fornece informações de homogeneidade a rotulagem entre moléculas de proteína.
Aqui, descrevemos o protocolo para um ensaio investigar a homogeneidade de rotulagem para todas as espécies de proteína no celular (Figura 2)16. As duas principais etapas deste teste são imagens e purificação de proteínas. Na primeira etapa, todas as proteínas nas células fluorescente são rotuladas e biotinilado, então extraído separadamente usando electroforese em gel, seguido por electroelution. Na segunda etapa, propriedades de fluorescência de moléculas de proteínas individuais nas amostras extraídas são avaliadas com base na imagem única molécula. Estes dados, parâmetros importantes para a análise de contagem, tais como a percentagem de proteínas rotulado com pelo menos um corante, o que chamamos de rotulagem de ocupação (LO)16, e o número médio de corantes fluorescentes ligadas a uma molécula de proteína única (n̄ corante), pode ser caracterizado. No protocolo, um processo otimizado para rotular o célula HeLa proteome com tintura de cianina 3 (Cy3) baseados em éster NHS é apresentado como um exemplo e pode ser modificado com outros procedimentos de rotulagem de acordo com os objectivos de pesquisa desejado.

<table><tbody><tr><td>lamínula de 22x22x0,15 mm</td><td>VWR</td><td>470019-004</td><td></td></tr><tr><td>488 nm Laser de argônio</td><td>Coherent</td><td>Innova 70C</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico de 488 nm</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emissão de 488 nm</td><td>Semrock</td><td>FF02-520/28</td><td></td></tr><tr><td>Filtro dicróico de 560 nm</td><td>Semrock</td><td>Di02-R561</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td> <td>de emissão de 560 nmSemrock</td><td>FF02-617/73</td><td></td></tr><tr><td>560 nm laser de fibra</td><td>MBP Communications</td><td>F-04306-2</td><td></td></tr><tr><td>60x lente de imersão em óleo</td><td>Olympus</td><td>PLAPON 60x</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Nacalai-tesque</td><td>03553-64</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-PEG-amina</td><td>Thermo Scientific</td><td>21346</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilated Alexa Fluor 488</td><td>Nanocs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borato</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9547</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Dojindo</td><td>C008-10</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 NHS-éster corante</td><td>GE Healthcare</td><td>PA13101</td><td></td></tr><tr><td>Dialisador&nbsp; - Tubo D, 6-8 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>71507-M</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>Nacalai-tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD câmera</td><td>Andor</td><td>IiXon 897</td><td></td></tr><tr><td>Epi microscópio de fluorescência</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Visualizador de gel</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina, estreptomicina e anfotericina mix</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Wako</td><td>NC0792960</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de purificação de tamanho 10K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Célula proteomes caracterizam frequentemente usando ensaios de electroforese, onde todas as espécies de proteínas nas células não-especificamente são rotuladas com um corante fluorescente e são descobertas por uma célula fotoeléctrica após sua separação. Imagens de fluorescência única molécula podem fornecer a deteção de proteínas ultra-sensível com a sua capacidade para visualização de moléculas fluorescentes individuais. No entanto, a aplicação deste método de imagem poderoso para ensaios de electroforese é dificultada pela falta de maneiras de caracterizar a homogeneidade de rotulagem fluorescente de cada espécie de proteína através da proteoma. Aqui, nós desenvolvemos um método para avaliar a homogeneidade de rotulagem através do proteome com base em um ensaio de imagens de fluorescência única molécula. Em nossa medição usando uma amostra de células HeLa, a proporção de proteínas rotulado com pelo menos uma tintura, que nós denominado 'ocupação de rotulagem' (LO), determinou-se a escala de 50% a 90%, suportando o elevado potencial da aplicação de imagem única molécula para análise de proteoma sensíveis e precisos.

A Figura 4 representa os dados de imagem raw para peso molecular diferentes frações de proteínas de célula HeLa lisada, bem como o controle positivo e negativo. Enquanto a amostra de proteína e o positivo controlam exibição 100 – 500 pontos por imagem, o controle negativo exibe nenhum ou poucos pontos, mostrando que o protocolo suficientemente inibe inespecificas de corantes para a superfície da lamela. Histogramas de intensidade local para as amostras da pro...

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a homogeneidade de rotulagem para cada espécie de proteína em uma amostra de proteína complexa a nível da molécula.

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Este método demonstra a calibração da quantidade de proteína quantificada em amostra líquida com processo de molécula única para contagem. Especificamente, pode ilustrar como as populações de proteínas podem ser rotuladas fluorescentemente em cada nível de molécula. Métodos anteriores realizaram medições em massa para analisar as proporções molares de moléculas fluorescentes e proteicas, mas não podem revelar como populações heterogêneas de proteínas são realmente rotuladas.Nossos métodos podem fazê-lo diretamente no nível de molécula única. Nosso método pode ser estendido para ensaios de concentração molecular ultrasensíveis e avançados, o que levará a métodos diagnósticos futuros, permitindo descobertas eficientes de moléculas patogênicas em espécimes. Nosso método pode ser aplicado à análise de espécies de proteínas únicas usando anticorpos fluorescentes, bem como análise de múltiplas espécies usando rótulos não específicos para todas as proteínas separadas por eletroforese ou cromatografia.O ponto mais crítico da técnica é a obtenção da reprodutibilidade de dados. Recomendo manter a mesma condição experimental o máximo possível ao medir várias amostras. A demonstração visual desta técnica fornecerá como tornar cada passo experimental estável e reprodutível.Também mostrará algum passo incomum nos protocolos de bioquímica, como o spin-coating e a lavagem de tampas de microscópio. Para iniciar este procedimento, prepare o buffer de 1%Tween-20 conforme descrito no protocolo de texto. Use hidróxido de sódio para ajustar o pH a 12.Misture 100 microliters de tampão de lise com um microliter de um DDT molar e quatro microliters de 50% CHAPS. Adicione um microliter da cultura celular preparada e homogeneize a solução com tubulação lenta para evitar bolhas. Incubar no escuro à temperatura ambiente por cinco minutos com agitação suave.Em seguida, rehomogenize a solução pipetting-lo para cima e para baixo lentamente. Adicione um micrograma de corante de éster Cy3 NHS e homogeneize a solução retardando a pipetação para evitar bolhas. Incubar no escuro à temperatura ambiente por 10 minutos com agitação suave.Repita este processo, adicionando a mesma quantidade de corante e incubando a amostra uma vez. Adicione 100 microlitadores de 0,8 hidróxido molar HEPES-sódio para ajustar o pH da solução para 7,2 e para saciar a reação. Pipeta lentamente para cima e para baixo para homogeneizar a solução.Em seguida, adicione 20 microliters de Biotin-2-amine e cinco microliters de EDC. Homogeneize a solução se escoando lentamente para cima e para baixo. Incubar no escuro à temperatura ambiente por uma hora com agitação suave.Depois disso, use uma coluna de ultrafiltração com um corte de 10 quiloDalton para remover quaisquer reagentes de rotulagem não redigidos e concentrar a amostra. Depois de realizar sds-PAGE padrão para a amostra de proteína e uma escada molecular, imagem do gel para identificar a localização das bandas de proteína. Use uma lâmina afiada para cortar as porções de gel que incluem frações de interesse proteicas com base nas localizações das bandas.Primeiro, defina deslizamentos de cobertura de 22 milímetros por 22 milímetros e têm 0,15 milímetros de espessura. Use um limpador de plasma para expor as tampas ao plasma de ar por um minuto para limpar e ativar suas superfícies. Em seguida, use um revestr de giro para girar as tampas com 200 microliters de tampão avadin por cinco segundos a 500RPM, seguido por 30 segundos a 1000RPM.Incubar as tampas à temperatura ambiente por 15 minutos para deixá-las secas. Para preparar as manchas para a amostra de proteína, use uma amostra de proteína que foi diluída. Coloque 100 microliters da amostra diluída no centro das tampas revestidas de avadin.Incubar no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos. Para preparar o controle positivo, coloque 100 microliters de biotina fluorescente purificada em cinco hidróxido de sódio HEPES-sódio micromolar no pH 7.2 no centro de uma mancha de cobertura revestida avadin. Incubar no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos.Para preparar o controle negativo, gire as tampas de plasma com 200 microlitres de cinco hidróxido de sódio HEPES com dois miligramas por mililitro de BSA sem avadin. Adicione 100 microliters à biotina fluorescente purificada em cinco hidróxido de sódio HEPES-sódio micromolar a pH 7.2. Incubar no escuro por 15 minutos em temperatura ambiente.Depois disso, enxágue cada tampa com 200 microliters de água destilada por tubulação nas bordas, certificando-se de não tocar no meio da tampa com a ponta da pipeta. Repita esta lavagem três vezes. Em seguida, exponha um número igual de novas tampas ao plasma de ar por um minuto.Coloque uma mancha de cobertura limpa em cima de cada mancha de cobertura ligada à amostra para evitar a secagem. Inicie um microscópio de fluorescência de campo amplo ou evanescente. Coloque uma mancha de cobertura no microscópio e encontre o foco.Em seguida, realize uma varredura de ladrilhos para obter pelo menos 100 imagens. Neste estudo, a homogeneidade de rotulagem de cada espécie de proteína rotulada nas células é quantificada após a separação com ADS-PAGE. Os dados de imagem bruta para diferentes frações de peso molecular de proteínas de lise celular HeLa, bem como os controles positivos e negativos, são vistos aqui.Enquanto tanto a amostra de proteína quanto o controle positivo apresentam entre 100 e 500 pontos por imagem, o controle negativo apresenta muito pouco ou nenhum. Isso mostra que o processo inibe suficientemente a ligação não específica de corantes à superfície do deslizamento de tampas. Os histogramas de intensidade spot para as amostras de proteína e o controle positivo apresentam múltiplos picos, que representam a ligação estocástica de corantes às aminas primárias em proteínas e estruturas tetramer avadina, respectivamente.Todos os pontos mostraram pisca-pisca e fotobleaching stepwise com excitação a laser contínua, destacando a observação no nível de molécula única. A ocupação da rotulagem, ou LO, é então calculada a partir da razão do número de pontos em cada amostra de proteína para a do controle positivo. A LO medida a partir da amostra de liseto celular HeLa varia de 50% para a menor fração de peso molecular, a 90% para a fração de peso molecular mais alto.O LO para toda a amostra de proteome sem separação é visto como 72%É fundamental usar reagentes recém-feitos e evitar qualquer poeira, especialmente durante a preparação das tampas. Após este procedimento, a análise de contagem de moléculas únicas em um determinado volume pode ser realizada para quantificar as concentrações de cada proteína. Por exemplo, pode ser realizada a análise de qualquer produto bruto, ou produtos de eletroforese gel e capilar.Esta técnica abre caminho para a utilização de imagens de fluorescência de moléculas únicas para medicina molecular, química orgânica e análise de omices. Ao fazer a ponte entre concentração e números. Hidróxido de sódio concentrado é corrosivo, e a proteção adequada deve ser usada ao manuseá-lo.Além disso, a radiação laser de alta potência pode causar danos oculares, de modo que óculos de proteção podem ser usados.

proteome-wide-quantification-labeling-homogeneity-at-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Avanços na espectrometria de massa permitiu a análise de alto rendimento de expressão da proteína e da modificação de uma série de tecidos. Combinada com fraccionamento subcelular e modelos de doença, a massa espectrometria quantitativa e bioinformática pode revelar novas propriedades nos sistemas biológicos. O método aqui descrito analisa cromatina proteínas associadas na definição de doença cardíaca e é prontamente aplicável a...

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