Fluxo de trabalho de "captura de superfície celular" para quantificação sem rótulo do proteoma da superfície celular

Este protocolo nos permite investigar antígenos presentes na superfície celular de vários tipos de células para encontrar antígenos específicos para esse tipo de célula ou tecido. A técnica que apresentamos aqui permite o enriquecimento de proteínas da membrana celular a partir de um lisado celular inteiro, em última análise, para análise por proteômica baseada em espectrometria de massa. Portanto, uma aplicação específica deste protocolo é aplicá-lo a células tumorais para procurar antígenos presentes na superfície dessas células cancerígenas e não células normais que possam servir como novos alvos para imunoterapias contra o câncer.

Uma coisa a observar sobre este protocolo é que pode ser importante otimizar sua entrada de amostra para o experimento de interesse. Portanto, pode levar várias iterações ou titulações para encontrar as condições ideais. Portanto, demonstrando o procedimento estará Akul Naik, um especialista júnior de nosso laboratório.

Para começar, remova o grânulo de células marcadas com biotina congeladas de 80 graus Celsius negativos e descongele-o no gelo. Adicione 500 microlitros de 2X Lysis Buffer ao pellet, misture bem e vortex vigorosamente por 30 segundos. Sonicar o lisado celular em gelo e centrifugar o lisado a 17.200 G por 10 minutos a 4 graus Celsius para pulverizar quaisquer detritos restantes.

Enquanto o lisado está centrifugando, adicione 100 microlitros de esferas de resina de NeutrAvidin Agarose a uma coluna de filtração conectada ao coletor de vácuo. Aplique um aspirador suave e lave as contas passando 3 mililitros de Wash Buffer 1 sobre elas. Remova a coluna de filtração do coletor de vácuo, tampe a parte inferior e adicione o lisado de células clarificado à coluna com os grânulos.

Tampe o topo da coluna e incube o lisado com os grânulos em um rotor de ponta a ponta por 120 minutos a 4 graus Celsius. Depois de completar a incubação do lisado, coloque a coluna de filtração de volta no coletor de vácuo e aplique um vácuo suave. Lave as contas passando cinco mililitros de tampão de lavagem 1 sobre elas.

Repita a etapa de lavagem com cinco mililitros de tampão de lavagem 2 e tampão de lavagem 3. Uma vez que o tampão de lavagem final tenha fluído inteiramente através dos grânulos, remova a coluna do coletor. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de lise às esferas e transfira-as para um tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas de 1,7 mililitro com uma pipeta.

Gire brevemente o tubo para assentar as contas e remova 50 microlitros da solução. Em seguida, coloque o tubo em um agitador de bloco de calor a 65 graus Celsius por 10 minutos a 1000 RPM agitando. Ressuspenda a tripsina seca no tubo de digestão do kit adicionando 210 microlitros da solução de ressuspensão e pipetando-a para cima e para baixo várias vezes para garantir que toda a tripsina seca seja ressuspensa.

No final da incubação do grânulo, remova-o do agitador do bloco de calor e adicione 50 microlitros da solução de tripsina ressuspensa aos grânulos. Incube o tubo a 37 graus Celsius, agitando a 500 RPM por pelo menos 90 minutos para digerir a proteína. Quando a digestão estiver completa, transfira a solução contendo os grânulos para uma coluna de centrifugação e insira a coluna em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas de 1,7 mililitro.

Gire o tubo para separar a solução peptídica digerida das contas. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução de parada para interromper a reação de digestão e acidificar a solução peptídica. Usando um adaptador de tubo, coloque uma coluna de dessalinização em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas de 1,7 mililitro.

Adicione toda a solução de peptídeo acidificado à coluna. Girar a coluna a 3.800 G durante 3 minutos, de modo a que a solução flua através da coluna. Descarte o fluxo, pois os peptídeos agora estão ligados à coluna.

Adicione 200 microlitros de solução Wash 1 à coluna, gire a 3.800 G por 3 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, descarte o fluxo. Repita a etapa de lavagem com 200 microlitros de solução Wash 2. Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas de 1,7 mililitro rotulado.

Adicione 100 microlitros de solução de eluição à coluna e gire a 3.800 G por 3 minutos em temperatura ambiente. Os peptídeos são agora eluídos da coluna para o tubo. Coloque a solução peptídica em uma centrífuga a vácuo e deixe secar durante a noite.

Coloque os peptídeos secos a menos 80 graus Celsius até que estejam prontos para quantificar e analisar no espectrômetro de massa. A análise do proteoma foi realizada para caracterizar as proteínas de superfície celular enriquecidas usando espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida. Uma concentração final de peptídeo de aproximadamente 630 nanogramas por microlitro foi obtida com base no ensaio de quantificação de peptídeos colorimétricos.

Os dados de espectrometria de massa analisados usando MaxQuant e a análise subsequente do conjunto de dados das proteínas da superfície celular produziram 601 proteínas de superfície na amostra, aproximadamente 27% de todas as proteínas identificadas. Um gráfico representando a distribuição da proteína identificada na pontuação de Andrômeda é mostrado aqui, e o gráfico de dispersão ilustra a correlação amostra a amostra. Os gráficos de caixa representavam a variação de corrida para corrida.

E o gráfico de distribuição amostral representou a qualidade dos dados das repetições. A coisa mais importante a ter em mente é onde os peptídeos estão em cada etapa. Inicialmente, eles estão em solução, depois, são ligados às contas até a digestão, então, eles são ligados à coluna de dessalinização até que sejam finalmente eluídos.

Seguindo este procedimento, existem várias maneiras de validar um punhado de proteínas identificadas, como citometria de fluxo direcionada e proteômica direcionada. Isso fornecerá informações mais detalhadas sobre os níveis de expressão dessas proteínas em toda a amostra.