Um modelo in vitro para estudar a agregação Tau usando transdução mediada por Lentivirus de neurônios humanos
23 de maio de 2019
Este protocolo detalha um procedimento em que as culturas neuronal humanas são transadas com construções lentivirais que codificam para o Tau humano do mutante. As culturas transadas exibem agregados Tau e patologias associadas.
Neste protocolo detalhamos um modelo in vitro de tauopatia humana. Este método preenche uma necessidade de materiais que podem ser úteis para estudos de rastreamento de medicamentos e mecanismos de doenças. A principal vantagem dessa técnica é que o paradigma da cultura celular permite uma avaliação mais rápida da toxicidade tau e potenciais terapêuticas tau em comparação com estudos em animais Para iniciar esse procedimento descongelar o revestimento da matriz da membrana do porão para placas de cultura a quatro graus Celsius.
Faça alíquotas de um mililitro e armazene-as a menos 20 ou menos 70 graus Celsius. Em seguida, reconstituir o fator básico de crescimento do fibroblasto em PBS estéril a uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Faça alíquotas de 10 microliter e armazene-as a 4 graus Celsius.
Em seguida, estabeleceu uma nova garrafa de 500 mililitros não abertas de DMEM-F12 com glutamina. Adicione 10 mililitros de B27, cinco mililitros de N2, e cinco mililitros de penicilina-estreptomicina para preparar a mídia neural de células-tronco. Coloque 50 mililitros da mídia NSC em um tubo cônico e adicione 10 microliters do bFGF preparado.
Armazene esta mídia NSC mais bFGF a quatro graus Celsius. Primeiro, remova uma alíquota de revestimento de matriz de membrana de porão congelado para placas de cultura celular do congelador e permite descongelar a quatro graus Celsius. Adicione 385 microliters da matriz de membrana do porão descongelada ao revestimento de cinco mililitros de mídia DMEM-F12 contendo penicilina-estreptomicina.
Se as células estiverem sendo descongeladas dos estoques de NSC congelados, pegue um frasco de células congeladas do congelador e aqueça-o em um banho de água aquecido a 37 graus Celsius movendo o frasco para frente e para trás na água. Depois disso, pulverize o frasco com 70% de etanol. Em seguida, sob uma capa de cultura celular, transfira as células para aproximadamente 10 mililitros de mídia DMEM-F12 contendo penicilina-estreptomicina.
Centrífuga à temperatura ambiente a 1.000 vezes g por cinco minutos. Em seguida, aspire a mídia e resuspende as células em mídia NSC. Diluir as células em mídia NSC para obter a densidade de semeadura apropriada para o vaso de cultura celular que está sendo usado.
Adicione células suficientes suspensas na mídia NSC para semear os pratos de cultura revestidos da matriz de membrana do porão. Cresça as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até que elas sejam 75 a 80% confluentes, certificando-se de mudar a mídia a cada dois dias. Para transduturar neurônios com lentivírus, use uma contagem de 340.000 unidades transdutíveis por célula.
Diluir as unidades transdutíveis nos meios de cultura celular à concentração necessária, e adicioná-las às células. Dois dias após a adição do lentivírus, lave as células uma vez com mídia fresca que não contenha bFGF. Continue a culminar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono na mídia sem bFGF.
Mantenha as células por cerca de oito semanas após a transdução, certificando-se de mudar a mídia de cultura celular a cada dois dias. Use um microscópio leve para visualizar rotineiramente as células e garantir a viabilidade. Após a transdução, remova os pratos de cultura da incubadora certificando-se de manter a tampa sobre eles para manter a cultura bem estéril.
Use um microscópio fluorescente capaz de imagens de células vivas para visualizar as células sob um objetivo de 10X com uma excitação de 514 nanômetros e um filtro de emissão de 527 nanômetros. Neste estudo, os neurônios transduzidos com lentivírus tau-RDLM-YFP são fluorescentemente marcados com YFP. Culturas transduzidas pelo RDLM são vistas para exibir agregados após a transdução.
Essas inclusões mancham positivo para thioflavina. A diferenciação neuronal é confirmada pela imunolabelação do marcador beta-tubulin III específico do neurônio nas culturas. É importante lembrar que anticorpos secundários com marca fluorescente devem ter um espectro de emissão de excitação que não se sobreponha ao de YFP.
Embora os agregados tau de fluorescência amarela sejam visíveis na ausência de coloração, a tiapenina também deve ser usada para imagens, a fim de confirmar que o sinal fluorescente é agregado tau e não detritos celulares. Após a geração de células tau superexpressivas, uma série de avaliações de saúde neuronal e agregação tau podem ser realizadas. Por exemplo, descobrimos que essas células apresentam degeneração axonal.
Além dos estudos de cultura celular, usamos este método para examinar a patogenicidade exosóica derivada tau.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo descreve um protocolo para estabelecer um modelo in vitro de tauopatia humana por meio da transdução de culturas neuronais com construtos lentivirais que codificam a proteína tau humana mutante. O modelo permite a avaliação rápida da toxicidade da tau e de terapêuticas potenciais, em comparação com estudos tradicionais em animais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Tauopatias
Antecedentes
- As tauopatias humanas são doenças neurodegenerativas caracterizadas pelo acúmulo da proteína tau.
- Os modelos tradicionais frequentemente envolvem longos períodos e nem sempre refletem com precisão a patologia humana.
- Este protocolo apresenta um paradigma de avaliação mais rápido e específico por meio de culturas celulares.
- Ele aborda as limitações dos modelos animais no estudo das interações da proteína tau.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo de cultura neuronal humana para estudar a patologia da proteína tau.
- Auxiliar na triagem de fármacos para doenças relacionadas à proteína tau.
- Facilitar a compreensão do papel da proteína tau na neurodegeneração.
Métodos Utilizados
- A plataforma utilizada é um sistema de cultura de células neuronais humanas.
- O modelo biológico consiste em neurônios humanos transduzidos com tau mutante utilizando construtos lentivirais.
- Nenhum fluxo de trabalho de multiômica é mencionado no texto.
- As células são mantidas por cerca de oito semanas após a transdução, com trocas regulares de meio.
- A microscopia de luz e fluorescente é empregada para visualizar a agregação de tau.
Resultados Principais
- As culturas transduzidas exibiram agregados de tau, confirmados pela coloração com tioflavina.
- A diferenciação neuronal foi validada por meio da imunomarcação da beta-tubulina III.
- As observações indicaram degeneração axonal entre as células que superexpressavam tau.
- O estudo destaca a viabilidade do uso deste modelo para avaliar a saúde neuronal relacionada à proteína tau.
Conclusões
- Este estudo demonstra uma abordagem in vitro confiável para investigar as tauopatias e avaliar a toxicidade da proteína tau.
- O modelo desenvolvido abre caminhos para testar potenciais terapêuticas direcionadas à proteína tau.
- Os conhecimentos obtidos podem aprimorar a compreensão dos mecanismos subjacentes à agregação da proteína tau e à neurodegeneração.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de neurônio humano in vitro preenche uma lacuna crítica na pesquisa de tauopatias, fornecendo um sistema relevante para humanos para avaliação rápida da agregação da proteína tau e neurotoxicidade. Ele permite a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas para terapêuticas direcionadas à tau, diminuindo a dependência de estudos animais demorados. O modelo oferece confiança preditiva na identificação de compostos líderes e no triagem pré-clínica para programas de doenças neurodegenerativas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa mutantes patogênicos da proteína tau em neurônios humanos para validar alvos terapêuticos e esclarecer mecanismos de agregação.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio de leituras quantitativas, como alterações no comprimento axonal e no volume lisossomal.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao modelar patologias e perfis de toxicidade da proteína tau específicos ao ser humano.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Produz agregados padronizados de tau marcados com fluorescência detectáveis por YFP e coloração com tioflavina para triagem de compostos.
- Resultados quantitativos: Permite a medição da carga de agregação e de fenótipos neurotóxicos como variáveis dependentes em ensaios de resposta à dose.
- Escalabilidade: A transdução lentiviral permite o preparo consistente e escalonável de culturas neuronais relevantes para a doença, adequadas para triagem de alto conteúdo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Utiliza neurônios humanos expressando mutantes patogênicos da proteína tau para modelar eventos iniciais da doença de Alzheimer e demais tauopatias relacionadas.
- Continuidade Tradutiva: Conecta descobertas e pesquisas pré-clínicas ao fornecer um sistema celular humano para estudos de mecanismo de ação.
- Decisões com Base no Risco: Permite a avaliação de compostos direcionados à proteína tau em um sistema que exibe agregados positivos para tioflavina e degeneração de neuritos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais e os testes de eficácia pré-clínica, apoiando ciclos iterativos de design, síntese e teste para moduladores da proteína tau.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mutantes da proteína tau e a elucidação de vias por meio de imagem em tempo real de agregação e marcadores de toxicidade em células vivas.
- Triagem: Fornece culturas prontas para ensaio com transdução padronizada e fenótipos de agregação para avaliação de bibliotecas de compostos.
- Análises: Oferece variáveis dependentes quantitativas, incluindo carga fluorescente de agregados, comprimento axonal e volume lisossomal, para comparação estatística.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao modelar a patologia humana da proteína tau em um sistema reducionista.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para testar múltiplos construtos de tau, inibidores ou abordagens de edição gênica em diferentes projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao modelar tauopatia humana com mutantes patogênicos e validar agregados por meio da positividade ao tiotflavina.
- Valor Operacional: Oferece um sistema economicamente viável e reprodutível, com meio definido, protocolos de transdução e cronograma de cultura de oito semanas.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de avanço ou interrupção do projeto ao fornecer dados precoces de neurotoxicidade e eficácia relevantes para humanos.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco de terapêuticas para tau com base em leituras de agregação e degeneração de neuritos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células neuronais, transdução com lentivírus e microscopia de fluorescência.
- Depende do acesso a células-tronco neurais humanas, vetores lentivirais e equipamentos de imagem com conjuntos de filtros apropriados.
- Necessita padronização do título de transdução (340.000 UT/célula) e das formulações de meio entre diferentes locais.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes mutantes da proteína tau ou construtos repórter além do tau-RDLM-YFP.
- Limitado pela duração de oito semanas da cultura e pela variabilidade potencial na eficiência de formação de agregados.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Preparation of Media and Reagents
1:41
Culturing Human Neural Stem Cells
3:12
Transduction and Maintenance of Neuronal Cultures
4:05
Live-cell Imaging
4:32
Results: Analysis of Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons
5:22
Conclusion
