Name: Um modelo in vitro para estudar a agregação Tau usando transdução mediada por Lentivirus de neurônios humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Aprenda a criar um modelo in vitro de tauopatia humana usando transdução lentiviral em neurônios. Este método permite avaliação rápida da toxicidade do tau e triagem de fármacos para doenças neurodegenerativas.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Peter Davies no Albert Einstein College of Medicine por fornecer anticorpos PHF-1 e CP13 e Dr. Marc Diamond na Universidade do Texas, no sudoeste, por fornecer os constructos Tau. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Associação de Alzheimer (NIRG-14-322164) para S.H.Y. e do Instituto de medicina regenerativa da Califórnia (TB1-01193) para P.R.

1. preparação de meios de comunicação e reagentes
<ol><li>Descongelar o revestimento da matriz da membrana do porão para placas da cultura em 4 ° c (não permita que a matriz da membrana do porão aqueça acima ou solidify). Fazer alíquotas de 1 mL e armazená-las a-20 ° c ou-70 ° c.</li>
	<li>Reconstituir o fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) em soro fisiológico tampão fosfato estéril (PBS) a 10 μg/mL e fazer 10 μL de alíquotas. Guarde-os a 4 ° c.</li>
	<li>Para um novo, não aberto, 500 mL de frasco de DMEM/F12 com glutamina, adicione B27 (10 mL), N2 (5 mL), e penicilina-estreptomicina (5 mL). Coloque 50 mL deste meio de células-tronco neurais (NSC) em um tubo cônico e adicione 10 μL de 10 μg/μL (2 μg/mL final) bFGF. Armazene a mídia NSC (+) bFGF a 4 ° c.</li>
	<li>Para fazer (-) bFGF mídia, use a mesma receita descrita na etapa 1,3, mas não adicionar bFGF. Esta mídia será usada para diferenciar as NSCs para os neurônios e para manter as culturas neuronais após a diferenciação.</li>
</ol>2. construções de Lentivirus
Nota: Antes de iniciar o trabalho com construções lentivirais, assegure-se de que o laboratório tenha sido aprovado para usar agentes de nível 2 (BSL-2) de biossegurança. Além disso, as capas de cultura BSL-2, o equipamento de proteção individual (EPI) e os métodos de descarte devem ser usados ao trabalhar com vetores lentivirais.
<ol><li>Obtenha construções de Tau empacotadas em Lentivirus a partir de uma fonte preferida (ver Sanders et al.10 para informações de construção).</li>
</ol>3. cultivando células-tronco neurais humanas
Nota: As NSCs são tipicamente semeadas em 100000 – 150000 células/cm2 e a maioria das NSCS comercialmente disponíveis são vendidas como 1 x 106 células/frasco. Este protocolo foi otimizado para pratos de cultura de células de 10 cm (embora outros tamanhos de pratos podem ser usados); Portanto, se os NSCs disponíveis comercialmente estiverem sendo usados, os NSCs podem precisar ser expandidos pela primeira vez sendo cultivados em pratos de seis poços, a fim de resultar em células suficientes para semear pratos de 10 cm. Este protocolo pode alternativamente ser adaptado para uma variedade de tamanhos do prato da cultura da pilha (mas não contem instruções para de NSCS porque estes protocolos estão disponíveis em outra parte11,12).
<ol><li>
Para a preparação de placas da cultura da pilha, remova uma alíquota do revestimento congelado da matriz da membrana do porão para placas da cultura da pilha e permita que descongele a 4 ° c (as alíquotas podem ser coloc em 4 ° c durante a noite o dia antes que as pilhas estejam ser semeadas). Adicionar 385 μL de revestimento matricial de membrana basal a 5 mL de Media DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina. Nota: 5 ml de mídia DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina é suficiente para revestir um único prato de 10 cm (1 ml desta solução de revestimento de matriz de membrana basal é suficiente para revestir um poço de um prato de seis poços). Alternativamente, se as células devem ser fixas e imunomanchadas, ou manchada para a tioflavina, células de cultura em coberturas de vidro em 24 pratos de cultura bem.<ol>
<li>Mantenha os meios de comunicação e a matriz de revestimento frio antes e ao adicioná-los aos pratos de cultura. Adicione o revestimento da matriz da membrana do porão aos pratos da cultura e coloc os pratos em uma incubadora (em 37 ° c) para 1 h. Para o revestimento óptimo, não incubar a matriz da membrana do porão por mais do que ou menos de 1 h. Após 1 h, aspirar o revestimento da matriz da membrana do porão dos pratos das culturas da pilha. Certifique-se que isso coincide com as NSCs estar pronto para ser banhado. Nota: Se as células não estiverem sendo descongeladas de estoques congelados, pule a etapa 3,2 e continue com a etapa 3,3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se as células estão sendo descongeladas de estoques congelados de NSC, tomar um frasco de células congeladas e aquecê-lo em um banho de água aquecida a 37 ° c, movendo o frasco para a frente e para trás na água. Uma vez descongelado, pulverize o frasco com 70% de etanol e coloque-o em uma capa de cultura celular. Transfira as células para ~ 10 mL de DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina Media e Centrifugue o tubo à temperatura ambiente em 1.000 x g por 5 min. aspirar a mídia e ressuscite as células em mídia NSC.</li>
	<li>Diluir as células na mídia NSC para obter a densidade de semeadura apropriada para a embarcação de cultura de células que está sendo usada. Nota: Por exemplo, se os NSCs estão sendo chapeados em uma placa de seis poços-um poço em um prato da cultura de seis poços tem uma área de superfície de 9 cm2— 900.000 a 1.350.000 pilhas são exigidas para semear. Assim, um frasco contendo 1 milhão células pode ser ressuscipended em 2 mL de mídia e adicionado a um único poço de um prato de seis poços.</li>
	<li>Adicionar células suficientes suspensas em mídia NSC para semear os pratos de cultura da membrana basal matriz-revestido (100.000 células/cm2) e mudar a mídia a cada outro dia (se estiver usando um estoque congelado, mudar a mídia no dia após o chapeamento e todos os dias depois disso). Cresça as células até que sejam 75% – 80% confluentes. Nota: As células provavelmente chegarão 75%-80% confluência logo após o chapeamento, mas isso pode demorar mais tempo se os estoques congelados são usados.</li>
	<li>Uma vez que os NSCs são 75% – 80% confluentes, começam a diferenciação neuronal removendo a mídia de NSC (+) bFGF e substituindo-o por mídia NSC (-) bFGF. Cultura as células nesta mídia (substituindo a mídia a cada outro dia) por pelo menos 4 semanas. Nota: As células continuarão a se dividir por alguns dias após a retirada da bFGF; Portanto, as células podem chegar a 90 – 100% de confluência. Após a cultura durante 4 semanas, as células terão atingido um destino neuronal e estará pronto para o tratamento de Lentivirus.</li>
</ol>4. transdução e manutenção de culturas neuronais
<ol><li>Para transduce neurônios com Lentivirus, use uma contagem de titer de 3,4 x 105 unidades transducible/célula (um 100% confluente 10 cm prato conterá ~ 10 milhões neurônios). Diluir as unidades transducible à concentração necessária em meios de cultura da pilha e adicioná-las às pilhas (use o volume normal de meios para o prato da cultura da pilha). Dois dias após ter adicionado o Lentivirus, lave as pilhas 1x com meios (-) bFGF frescos (sem lentivirus) e continue cultivando em meios de (-) bFGF como usual.</li>
	<li>Para o tratamento pós-lentiviral, alimente os neurônios transviados alterando os meios de cultura celular ([-] bFGF Media) todos os dias. Manter as células para ~ 8 semanas após a transdução. Visualize rotineiramente as células um microscópio de luz para garantir a viabilidade. Nota: A escassidade ou a ruptura dendrítica são sinais de que as células não são mais viáveis.</li>
</ol>5. imagem latente das pilhas
<ol><li>
Imagens de células ao vivo
	<ol>
<li>Após a transdução (4 dias após a adição de Lentivirus), observe sinais de YFP um microscópio fluorescente capaz da imagem latente da vivo-pilha. Tome os pratos da cultura da pilha fora da incubadora e certifique-se que os poços da cultura permanecem estéreis mantendo a tampa sobre os pratos da cultura. Visualize as células usando um objetivo de 10x com um comprimento de onda de excitação de ~ 514 nm e um filtro de emissão de ~ 527 nm. Nota: Os agregados são tipicamente visíveis em culturas de células transviadas 6 – 8 dias após a aplicação de Lentivirus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloração de células fixas (rotulagem de β-tubulina III e coloração de tioflavina)
	<ol>
<li>Para fixar as células em paraformaldeído (PFA), remova os meios de cultura de neurônios transados cultivados em coberturas de vidro. Lave as células 1x com PBS, retire a lavagem e adicione 300 – 500 μL (se estiver usando placas de 24 poços) de 4% de PFA (diluída em PBS) para as coberturas por 20 min à temperatura ambiente. Retire o PFA e lave os lamínulas 2x com PBS.</li>
		<li>Prepare uma solução de bloqueio consistindo de PBS, 3% de albumina sérica bovina (BSA) e 0,3% de Triton X-100. Adicionar 300 – 500 μL da solução aos poços e incubar os lamínulas durante 2 h a 4 ° c. Após 2 h, diluir anticorpos primários (a uma concentração de anticorpos de 1:500) na solução de bloqueio e adicionar 300 – 500 μL de solução de anticorpos primários a cada poço. Coloc a placa em uma plataforma de balanço ou girando (na baixa velocidade) durante a noite em 4 ° c.</li>
		<li>No dia seguinte, retire a solução de anticorpos primários e lave os lamínulas 3x durante 5 min cada um com PBS. Diluir anticorpos secundários em uma solução tampão de obstrução (em uma concentração de 1:1000) e adicionar a solução secundária do anticorpo a cada poço. Selecione o anticorpo secundário apropriado usando uma etiqueta fluorescente que não se sobreponha com o sinal de YFP (CY-3, por exemplo). Incubar as células à temperatura ambiente por 2 h em uma plataforma de balanço ou rotativa. Após 2 h, retire a solução de anticorpos secundários e lave os lamínulas 3x durante 10 min cada com PBS.</li>
		<li>Lave as lamelas em água dupla deionizada (DDW) durante 10 min. Retire o DDW e adicione 300 μL/poço de 0, 15% de tioflavina-S diluído em 50% de etanol por 10 min. Retire a solução de tioflavina e lave as lamelas 2x durante 4 min cada com 50% etanol, seguido por um 4 min Lave com 30% de etanol e duas lavagens por 5 min cada uma com 30% de etanol. Lave os lamínulas 1x com DDW antes da montagem. Nota: A coloração de tioflavina descrita na etapa 5.2.4 é opcional.</li>
		<li>Para montar as coberturas em lâminas de vidro, coloque uma única gota de suportes de montagem no lado "+" de uma lâmina de vidro. Remova todo o líquido do poço que contem o lamela de vidro e, usando o fórceps fino, remova com cuidado o lamela de vidro, mantendo a trilha de que lado tem as pilhas cultivadas.</li>
		<li>Pressione suavemente a borda da lamínula contra um Kimwipe para remover qualquer excesso de umidade. Ainda segurando o lamela com fórceps fino, toque a borda (com o lado da pilha que enfrenta para a gota de suportes de montagem) do lamela à mídia de montagem, e então, coloc delicadamente o lamela nos meios de montagem (colocando as pilhas cultivadas na montagem mídia e imprensando-os entre a lamínula e a corrediça de vidro). Deixe a mídia de montagem endurecer por 30 min antes da imagem. Os slides podem ser armazenados em-20 ° c para uso futuro.</li>
		<li>Imagem as pilhas usando um microscópio fluorescente e os espectros apropriados da excitação/emissão (YFP = ~ 514/527 nanômetro, CY-3 = ~ 555/568 nanômetro, e thioflavin S = ~ 390/426 nanômetro).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. métodos opcionais
<ol><li>A cada 2 dias, coletar mídias condicionadas das culturas e armazená-lo em-20 ° c para futuras análises de espécies Tau liberado por culturas.</li>
</ol>

<ol><li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+in+2015%3A+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li>
<li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li>
<li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li>
<li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li>
<li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765(2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li>
<li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li>
<li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li>
<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells%2C+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263(2007).</li>
<li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556(2017).</li>
<li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve a geração de um modelo in vitro de Taupatia humano que exiba agregados prata-mancha-positivos e emaranhados neurofibrilary thioflavin-positivos (NFTS). Além disso, as pilhas transfuídas exibem patologias Tau-induzidas tais como defeitos morfológicos, synaptogenesis reduzido, e um volume lysosomal aumentado. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece um modelo acessível e rentável de tauopatia neuronal, que pode ser usado para estudos de triagem de drogas, bem como para a análise da tox...

A agregação patológica da proteína Tau microtubule-associada é uma característica definidora de muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a AD, a demência frontotemporal (FTD), a doença de pick, e a paralisia supranuclear progressiva (PSP)1. Em um estado não-doente, a Tau liga-se e estabiliza os filamentos de microtúse em axônios neuronais2. No entanto, a hiperfosforilação associada à doença da Tau promove a agregação de Tau, a dissociação dos microtúbulos e a toxicidade neuronal3. Os efeitos tóxicos da Tau agregada podem envolver a ativação aberrante de4 e receptores glutamatérgicos colinérgicos5 resultando na desregulação do cálcio intracelular e, eventualmente, morte celular. Em modelos animais, a redução da Tau cerebral melhora a patologia em camundongos AD6 e em modelos de mouse de lesão cerebral traumática leve repetitiva7.
A evidência da montagem demonstra que a estrutura e a afinidade obrigatória da Tau rato-derivada são distintas da Tau Human-derivada e que o Tau do rato é inadequado para modelar Tauopatias humanos8. Entretanto, os modelos Taupatia da pilha humana não são extensamente disponíveis comercialmente. O objetivo geral deste trabalho é descrever um modelo in vitro de agregação Tau em que os neurônios humanos são transviados com vetores derivados de lentivirais contendo construções de Tau humanas mutantes9. Tau agregado causando lentivirais constrói codifica para o domínio de repetição Tau abrigando P301L e V337M mutações fundidas a um repórter YFP (Tau-rdlm-YFP) enquanto o controle constrói código para o Wild-Type (WT) Tau repetir domínio fundido a um repórter YFP (Tau-WT-YFP). As culturas neuronal transectoadas usando este método expressam aproximadamente nove vezes mais Tau do que culturas nontransemadas. Embora a quantidade de expressão de Tau superexpressa seja aproximadamente igual entre as células Tau-RDLM-YFP-e Tau-WT-YFP-transvadas, apenas os neurônios transvados com agregados de exibição de Tau-RDLM-YFP. As culturas transvadas com Tau-RDLM-YFP mancham positivamente para a tioflavina e apresentam reduções no comprimento axonal e na densidade sináptica. Portanto, este modelo celular pode ser uma ferramenta útil para estudar a agregação de Tau in vitro.

<table><tbody><tr><td>Placas de cultura de 10 cm</td><td>Thermofisher</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 15 mL Biopioneer</td><td></td><td>CNT-15</td><td></td></tr><tr><td>16% de paraformaldeído</td><td>Thermofisher</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 24 poços</td><td>Thermofisher</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 50 mL Biopioneer</td><td></td><td>CNT-50</td><td></td></tr><tr><td>70% de etanol em frasco</td> <td>de sprayVárias fontes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>FGF Basic Biopioneer</td><td></td><td>HRP-0011</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células</td><td>Várias fontes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Várias fontes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Meios de cultura DMEM-F12 com glutamina</td><td>Thermofisher</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (concentração de 50% ou superior)</td><td>Várias fontes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos secundários marcados com fluorescência</td><td>Várias fontes, dependentes de experimentos</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Várias fontes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Thermofisher</td><td>1254581</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>Thermofisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Células-tronco neurais humanas</td><td>Várias fontes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Vetores lentivirais</td><td>Várias fontes</td><td>ordem</td><td></td>personalizada</tr><tr><td>Mídia de montagem</td><td>Thermofisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento</td> <td>N2Thermofisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos primários</td><td>Várias fontes, dependente do experimento</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma oscilante ou rotativa</td><td>Várias fontes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Capuz</td> <td>de cultura de células estéreisVárias fontes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina S</td><td>Sigma</td><td>T1892-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td> Várias <td>fontes</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo in vitro para estudar a agregação tau usando transdução mediada por lentivirus de neurônios humanos

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

A agregação aberrante da proteína Tau é patogenicamente envolvida em um número de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD). Embora os modelos de rato de Taupatia forneceram um recurso valioso para investigar os mecanismos neurotóxicos da Tau agregada, está tornando-se cada vez mais aparente que, devido às diferenças do entre espécies na neurofisiologia, o cérebro do rato é inadequado para modelar a condição humana. Os avanços nos métodos de cultura celular tornaram as culturas neuronais humanas acessíveis para uso experimental in vitro e ajudaram no desenvolvimento de neuroterapêutica. No entanto, apesar da adaptação de culturas de células neuronais humanas, in vitro modelos de tauopatia humana ainda não estão amplamente disponíveis. Este protocolo descreve um modelo celular da agregação da Tau em que os neurônios humanos são transfundidos com os vetores lentiviral-derivados esse código para Tau patogenicamente mutado fundido a um repórter amarelo da proteína fluorescente (YFP). Culturas transdoadas produzem agregados Tau que mancham positivamente para a tioflavina e exibem marcadores de neurotoxicidade, tais como diminuição do comprimento axonal e aumento do volume lisossomal. Este procedimento pode ser um modelo útil e rentável para estudar tauopathies humanas.

Os neurônios de Tau-RDLM-YFP-transdução foram marcados fluorescentamente com o YFP, e as culturas RDLM-dueadas apresentaram agregados após a transdução. Essas inclusões coradas positivas para a tioflavina (Figura 1). Como a Figura 1 demonstra, este protocolo produz culturas neuronais que exibem agregados de Tau tioflavina-positivos. Para experimentos iniciais, recomenda-se que a diferenciação neuronal seja confirmada Immunolabeling o marcador Neuron-específico β...

Este protocolo detalha um procedimento em que as culturas neuronal humanas são transadas com construções lentivirais que codificam para o Tau humano do mutante. As culturas transadas exibem agregados Tau e patologias associadas.

Um modelo in vitro para estudar a agregação Tau usando transdução mediada por Lentivirus de neurônios humanos

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

Neste protocolo detalhamos um modelo in vitro de tauopatia humana. Este método preenche uma necessidade de materiais que podem ser úteis para estudos de rastreamento de medicamentos e mecanismos de doenças. A principal vantagem dessa técnica é que o paradigma da cultura celular permite uma avaliação mais rápida da toxicidade tau e potenciais terapêuticas tau em comparação com estudos em animais Para iniciar esse procedimento descongelar o revestimento da matriz da membrana do porão para placas de cultura a quatro graus Celsius.Faça alíquotas de um mililitro e armazene-as a menos 20 ou menos 70 graus Celsius. Em seguida, reconstituir o fator básico de crescimento do fibroblasto em PBS estéril a uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Faça alíquotas de 10 microliter e armazene-as a 4 graus Celsius.Em seguida, estabeleceu uma nova garrafa de 500 mililitros não abertas de DMEM-F12 com glutamina. Adicione 10 mililitros de B27, cinco mililitros de N2, e cinco mililitros de penicilina-estreptomicina para preparar a mídia neural de células-tronco. Coloque 50 mililitros da mídia NSC em um tubo cônico e adicione 10 microliters do bFGF preparado.Armazene esta mídia NSC mais bFGF a quatro graus Celsius. Primeiro, remova uma alíquota de revestimento de matriz de membrana de porão congelado para placas de cultura celular do congelador e permite descongelar a quatro graus Celsius. Adicione 385 microliters da matriz de membrana do porão descongelada ao revestimento de cinco mililitros de mídia DMEM-F12 contendo penicilina-estreptomicina.Se as células estiverem sendo descongeladas dos estoques de NSC congelados, pegue um frasco de células congeladas do congelador e aqueça-o em um banho de água aquecido a 37 graus Celsius movendo o frasco para frente e para trás na água. Depois disso, pulverize o frasco com 70% de etanol. Em seguida, sob uma capa de cultura celular, transfira as células para aproximadamente 10 mililitros de mídia DMEM-F12 contendo penicilina-estreptomicina.Centrífuga à temperatura ambiente a 1.000 vezes g por cinco minutos. Em seguida, aspire a mídia e resuspende as células em mídia NSC. Diluir as células em mídia NSC para obter a densidade de semeadura apropriada para o vaso de cultura celular que está sendo usado.Adicione células suficientes suspensas na mídia NSC para semear os pratos de cultura revestidos da matriz de membrana do porão. Cresça as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até que elas sejam 75 a 80% confluentes, certificando-se de mudar a mídia a cada dois dias. Para transduturar neurônios com lentivírus, use uma contagem de 340.000 unidades transdutíveis por célula.Diluir as unidades transdutíveis nos meios de cultura celular à concentração necessária, e adicioná-las às células. Dois dias após a adição do lentivírus, lave as células uma vez com mídia fresca que não contenha bFGF. Continue a culminar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono na mídia sem bFGF.Mantenha as células por cerca de oito semanas após a transdução, certificando-se de mudar a mídia de cultura celular a cada dois dias. Use um microscópio leve para visualizar rotineiramente as células e garantir a viabilidade. Após a transdução, remova os pratos de cultura da incubadora certificando-se de manter a tampa sobre eles para manter a cultura bem estéril.Use um microscópio fluorescente capaz de imagens de células vivas para visualizar as células sob um objetivo de 10X com uma excitação de 514 nanômetros e um filtro de emissão de 527 nanômetros. Neste estudo, os neurônios transduzidos com lentivírus tau-RDLM-YFP são fluorescentemente marcados com YFP. Culturas transduzidas pelo RDLM são vistas para exibir agregados após a transdução.Essas inclusões mancham positivo para thioflavina. A diferenciação neuronal é confirmada pela imunolabelação do marcador beta-tubulin III específico do neurônio nas culturas. É importante lembrar que anticorpos secundários com marca fluorescente devem ter um espectro de emissão de excitação que não se sobreponha ao de YFP.Embora os agregados tau de fluorescência amarela sejam visíveis na ausência de coloração, a tiapenina também deve ser usada para imagens, a fim de confirmar que o sinal fluorescente é agregado tau e não detritos celulares. Após a geração de células tau superexpressivas, uma série de avaliações de saúde neuronal e agregação tau podem ser realizadas. Por exemplo, descobrimos que essas células apresentam degeneração axonal.Além dos estudos de cultura celular, usamos este método para examinar a patogenicidade exosóica derivada tau.

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Este vídeo mostra um ensaio baseado em células quantificando a captação de Tau pela microglia murina usando agregados de Tau marcados com fluorescência sensíveis ao pH, analisados por meio de classificação de células ativadas por fluorescência para uma avaliação quantitativa.

Um ensaio baseado em células para avaliar a captação da proteína tau pela microglia

Este vídeo demonstra o processo de transdução de células neuronais humanas com um lentivírus que codifica uma proteína tau humana mutante marcada com proteína fluorescente amarela (YFP) para estudar a agregação de proteínas. Ele descreve as etapas desde a entrada viral até a expressão da tau mutante, culminando na formação de agregados de tau citoplasmática visíveis nos neurônios.

Transdução mediada por lentivírus de neurônios humanos para análise de agregação de proteínas Tau

Proteínas tau não modificados e hiperfosforiladas foram utilizados em dois ensaios in vitro de agregação para revelar a cinética de agregação rápida dependente de hiperfosforilaï¿½o. Estes ensaios pavimentar o caminho para futuras telas para os compostos que podem modular a propensão de tau hyperphosphorylated para formar fibrilas que fundamentam a progressão da doença de Alzheimer.

In Vitro Agregação ensaios utilizando hiperfosforilada Tau Protein

A transferência de célula para célula de agregados proteicos, ou sementes proteopáticas, pode estar subjacente à progressão da patologia em doenças neurodegenerativas. Aqui, é descrito um novo ensaio de citometria de fluxo FRET que permite a detecção específica e sensível da atividade de semeadura de amostras recombinantes ou biológicas.

Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

O objetivo do presente protocolo é fornecer um sistema celular que Replica a formação do alfa-synuclein agrega na vivo. Inclusões intracelulares alfa-synuclein são semeados nos neurônios primários pela internalização e propagação de exógeno administrado agregados nativo associado microssomas alfa-synuclein, isolados de ratos transgênicos doentes alfa-synuclein.

Administração exógena de agregados de microssomas associados alfa-synuclein para os neurônios primários como um modelo de célula poderosos de formação de fibrilas

O ensaio de agregação de tau descrito neste manuscrito imita as características antecipadas de na vivo tau enrolamento e agregação.

In Vitro Ensaio para estudar a agregação da proteína Tau e rastreio de drogas

Aqui nós descrevemos um baseada em célula de ensaio para avaliar quantitativamente a absorção de tau por microglia com o objectivo de criar uma ferramenta experimental para melhor caracterizar os mecanismos de ação dos anticorpos anti-tau.

Baseada em célula de ensaio para estudar mediada por anticorpos Tau afastamento por Microglia

Tau é uma proteína neuronal presente tanto no citoplasma, onde liga microtúbulos, e no núcleo, onde exerce funções não convencionais, incluindo a modulação dos genes relacionados à doença de Alzheimer. Aqui, descrevemos um método para investigar a função do tau nuclear, excluindo quaisquer interferências provenientes de Tau citoplasmamic.

Modulação da localização subcelular tau como uma ferramenta para investigar a expressão de genes relacionados à doença

Um modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína é necessário para estudar e entender a patogênese da doença de Parkinson. Descrevemos um método para monitorar a citotoxicidade e a formação de agregados de α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado.

Um método para estudar a toxicidade e agregação da α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado

Aqui, demonstramos como combinar a transfecção de neurônios primários de roedores do hipocampo com imagens confocais de células vivas para analisar os efeitos patológicos induzidos por proteínas no transporte axonal e identificar vias mecanicistas que medeiam esses efeitos.

Usando imagens de células vivas para medir os efeitos de proteínas patológicas no transporte axonal em neurônios primários do hipocampo

As ataxias spinocerebelares de poliglutamina são causadas por expansões CAG que produzem proteínas propensas à agregação. Este protocolo descreve a produção de vetores, entrega estereotáxica e análise de inclusões e perda de marcadores neuronais, fornecendo uma plataforma controlada para investigar mecanismos e avaliar terapias direcionadas para doenças neurodegenerativas.

Patologia Estriatal Induzida por Lentiviral como Modelo Pré-clínico de Ataxias Espinocerebelosas de Poliglutamina

Aprenda a criar um modelo in vitro de tauopatia humana usando transdução lentiviral em neurônios. Este método permite avaliação rápida da toxicidade do tau e triagem de fármacos para doenças neurodegenerativas.

Um modelo in vitro para estudar a agregação Tau usando transdução mediada por Lentivirus de neurônios humanos

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