Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em neurônios usando lentivírus projetados

Trate as células-tronco pluripotentes humanas aderidas com lentivírus modificados em um reagente de transfecção.

O vírus carrega genes de resistência a antibióticos e do fator de transcrição neurogênico, controlado pelos elementos responsivos e reguladores da tetraciclina.

O reagente de transfecção carregado positivamente aumenta a fusão viral e sua liberação de conteúdo.

O RNA viral transcreve-se reversamente em DNA e se integra ao DNA de células-tronco, permitindo a expressão de elementos reguladores que produzem proteínas ativadoras.

Adicione um meio basal com derivado de tetraciclina, que forma um complexo com as proteínas ativadoras.

Este complexo se liga ao elemento responsivo à tetraciclina, promovendo a expressão gênica e produzindo os fatores de transcrição neurogênicos que induzem a diferenciação de células-tronco em neurônios.

Adicione um meio basal com um antibiótico para eliminar as células não transfectadas.

Trate as células com uma solução de descolamento contendo enzimas proteolíticas que degradam a matriz extracelular ou ECM e liberam as células.

Remova as enzimas e recoloque as células em poços revestidos com ECM com um meio de maturação, promovendo a maturação neuronal.

Dois dias antes da indução da diferenciação, desprenda as células ES adicionando 1 mililitro de solução de descolamento celular e incubando em temperatura ambiente por 10 minutos. Transfira as células para um tubo. Em seguida, lave o poço com 2 mililitros de mídia e adicione ao mesmo tubo. Centrifugue as células a 300 vezes g durante 5 minutos. Em seguida, ressuspenda o pellet em meio e coloque as células em placas de seis poços revestidas com matriz na densidade de assentamento de 1 vezes 10 elevado à quinta célula por poço.

No dia seguinte, adicione lentivírus expressando Ngn2 mais PuroR e transativador de tetraciclina junto com polibreno em meio de manutenção de células ES frescas. No dia zero, adicione 2 microgramas por mililitro de doxiciclina em meio DMEM/F12 suplementado com N2 e sem morfogênios. No primeiro dia, adicione puromicina em DMEM / F12 fresco mais N2 e doxiciclina até a concentração final de 1 micrograma por mililitro.

Selecione as células transduzidas em puromicina por pelo menos 24 horas. No segundo dia, separe os neurônios diferenciadores com solução de descolamento celular e coloque-os novamente em placas de 24 poços revestidas com solução de matriz. Mantenha-os em meio NBA/B27 sem doxiciclina. Cultura de neurônios induzidos puros nas placas revestidas com soluções baseadas em matriz extracelular.