Name: In vivo reprogramação direta de células gliais residentes em interneurônios por injeção intracerebral de vetores virais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Aprenda a reprogramação in vivo de células gliais residentes em interneurônios parvalbumina-positivos usando vetores virais AAV em modelos murinos. Este método demonstra conversão celular direta no cérebro com aplicações em distúrbios psiquiátricos.

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A Marcella Birtele foi financiada pelo programa Horizonte 2020 da União Europeia (2020-MSCA-ITN-2015) no âmbito das redes de formação inovadoras Marie Skłodowska-Curie e da Convenção de subvenção n. º 676408. Daniella Rylander Ottosson foi financiada pelo Conselho de pesquisa Sueco (2017-01234).

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<li>Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+dopaminergic+neurons+of+nigral+and+ventral+tegmental+area+subtypes+in+grafts+of+fetal+ventral+mesencephalon+based+on+cell+morphology%2C+protein+expression%2C+and+efferent+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections.</a> Journal of Neuroscience. 25 (27), 6467-6477 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A reprogramação direta in vivo pode ser alcançada usando vetores AAV FLEX em estirpes de rato expressando CRE. É importante notar que as diferenças entre as cepas de mouse em relação à eficácia de reprogramação têm sido observadas. Para a reprogramação in vivo no striatum, a linha do mouse NG2-CRE provou ser a mais eficiente quando comparada com outras cepas. Antes de começar a usar uma nova estirpe animal, é importante verificar as diretrizes do provedor de mouse sobre a expressão CRE ao longo do tempo, como a idade dos animais muitas vezes impacta a especificidade desta expressão protéica. Em nossos estudos, os animais com mais de 12 semanas de idade não foram utilizados para a reprogramação in vivo, pois havia um risco para a expressão de CRE em células que não NG2 glia. A presença constante e a monitoração de animais do controle injetados somente com a construção de Synapsin-FLEX-GFP são aconselhadas. Isto permite a monitorização dos animais para células GFP-positivas que não devem estar presentes se não forem utilizados genes de reprogramação (ALN).
Para identificar os neurônios recém-reprogramados, um método de identificação neurônio-específico como o descrito neste protocolo é de extrema importância. Isto permite uma identificação e uma distinção apropriadas dos neurônios reprogramados das pilhas circunvizinhas endógenas que é da relevância particular quando reprogramação em uma região homotópicas.
Também é importante direcionar a estrutura correta para a injeção viral. Conseqüentemente, a cirurgia Stereotaxic para a injeção viral é importante e precisa de ser aproximado com exatidão, especial ao alvejar estruturas menores do cérebro.
Temos mostrado anteriormente11 que não é confiável para prever o resultado da reprogramação in vivo com base em experimentos de reprogramação in vitro usando os mesmos fatores de reprogramação. Por conseguinte, todos os factores de interesse necessitam de ser testados in vivo. Em nossas mãos, muitas combinações de fatores diferentes dão o mesmo subtipo de neurônios (ou seja, interneurônios11 in vivo), apesar do fato de que esses genes têm sido implicados no desenvolvimento de outros neurônios.
A braçadeira de remendo da inteiro-pilha para neurônios reprogramados é uma técnica delicada e o processamento do tecido é importante para um bom resultado. A perfusão com solução de Krebs gelada melhora a qualidade do tecido. Além disso, os neurônios corrigidos precisam ser tratados com cuidado. Mesmo se a maturação e a identidade fenotípica de neurônios reprogramados podem ser um tanto avaliados usando a braçadeira de remendo da inteiro-pilha, estas pilhas não são inteiramente comparáveis a suas contrapartes endógenas. Outros tipos de análise, como sequenciamento do genoma (por exemplo, sequenciamento de RNA) devem ser usados para confirmar ainda mais a identidade da célula reprogramada.
A técnica descrita aqui é poderia ser considerada para o desenvolvimento de terapias futuras onde a recolocação neuronal é precisada no cérebro. Embora a reprogramação in vivo ainda esteja em seus estágios iniciais e a tradução em humanos ainda não esteja prevista, essa técnica pode fornecer um método para avaliar a função gênica exógena no cérebro e estudar a maturação celular in vivo.

O objetivo geral deste método é converter eficientemente a glia residente cerebral in vivo em neurônios funcionais e subtipo-específicos, como interneurônios expressando parvalbumina. Isto fornece uma etapa para a frente para o desenvolvimento de uma terapia alternativa da recolocação da pilha para doenças de cérebro sem a necessidade para uma fonte de pilha exógena. Ele também cria uma ferramenta para estudar o destino da célula switches in situ.
O cérebro tem apenas uma capacidade limitada para gerar novos neurônios. Conseqüentemente, em doenças neurológicas, há uma necessidade de fontes de pilha exógenas para o reparo do cérebro. Para isso, diferentes fontes de células têm sido submetidas a intensa pesquisa ao longo dos anos, incluindo células do tecido primário, células derivadas da célula-tronco e células reprogramadas1,2,3. A reprogramação direta de células cerebrais residentes em neurônios é uma abordagem recente que poderia fornecer um método atraente para o reparo cerebral, pois usa as próprias células do paciente para gerar novos neurônios dentro do cérebro. Até à data, vários relatórios mostraram in vivo reprogramação através da entrega viral do vetor no cérebro4,5,6,78,9 em diferentes regiões do cérebro, como o córtex, a medula espinhal, o estriado e o midbrain5,10,11, bem como no cérebro intacto e lesionado5,8,11,12. Ambos os neurônios inibitórios e excitatórios foram obtidos4,8, mas o fenótipo preciso ou funcionalidade dessas células ainda não foi analisado em detalhes.
Neste protocolo, nós descrevemos uma reprogramação mais eficiente e uma identificação Cell-specific de neurônios in vivo reprogramados. Nós fornecemos um protocolo para a avaliação funcional da maturação neuronal e da caracterização do phenotype baseada na funcionalidade e em traços immunohistochemical.
Nós usamos um vetor CRE-inducible AAV e um repórter de GFP para identificar os neurônios in vivo reprogramados. Essa escolha de vetores virais tem a vantagem de infectar as células de divisão e não-divisoras do cérebro, aumentando o número de células direcionadas, como alternativa ao uso do retrovírus7,8. Um repórter de FLEX (GFP), orientado por synapsin, específico do neurônio, permitiu-nos detectar especificamente os neurônios recém-gerados. Estudos prévios utilizaram promotores específicos do subtipo para a reprogramação in vivo7,9, que também permitem a expressão de reprogramar genes e repórteres em tipos específicos de células. Entretanto, esse método exige a identificação mais adicional de neurônios reprogramados pela análise pós-morte da coexpressão do repórter e dos marcadores neuronal. O uso de um repórter Neuron-específico, tal como esse descrito nisto, permite uma identificação direta. Isto fornece uma prova direta de uma conversão bem sucedida e permite uma identificação viva da pilha que seja exigida para a electrofisiologia da remendo-braçadeira.

<table><tbody><tr><td>< REAGENTES > FORTE PARA CLONAGEM AAV5 E PREPARAÇÃO ></td><td></td><td></td><td></td> VETOR VILAR< / strong</tr> <tr><td>pAAV-CA-FLEX</td><td>AddGene</td><td>38042</td><td></td></tr><tr><td>Ascl1</td><td>AddGene</td><td>67291</td><td>NM_008553,4</td></tr><tr><td>Lmx1a</td><td>AddGene</td><td>33013</td><td>NM_0033652,5</td></tr><tr><td>Nurr1</td><td>AddGene</td><td>35000</td><td>NM_013613,2</td></tr><tr><td>GFP-syn</td><td>AddGene</td><td>30456</td><td></td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) sequência 1</td><td></td><td></td><td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agagctctaga</td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) sequências 2</td><td></td><td></td><td>tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td></tr><tr><td>pDP5</td><td>Fábrica de plasmídeos</td><td>PF435</td><td></td></tr><tr><td>Fábrica de plasmídeos</td><td>pDP6</td><td>PF436</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FBS (soro fetal bovino)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>14190094</tr><tr><td>células HEK293</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85120602-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Frascos</td><td>BD Falcon</td><td>10078780</td><td>175 cm2</td></tr><tr><td>Tris H-CL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td> Para tampão TE use 10 mM, pH 8,0; para tampão de lise use 50mM, pH 8,5; para tampão IE use 20 mM, pH 8,0; para tampão de eluição use 20 mM, pH 8,0 </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>EDTA: Invitrogen</td><td>EDTA: AM9260G</td><td> Para uso de buffer TE 1 mM EDTA </td></tr><tr>Água <td></td><td></td><td>ultrapura</td><td> veja Sistema de água ultrapura </td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C5080</td><td>2.5 M</td></tr><tr><td>Dulbecco&agudo; s solução salina tamponada com fosfato (DPBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td> PARA HBS use 140 mM; para tampão de lise use 150 mM; para tampão IE use 15 mM; para tampão de eluição use 250 </td></tr><tr><td>mM MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td> Para tampão de lise: 1 mM </td></tr><tr><td>Tubos de vedação de ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Quick-Seal&reg; &nbsp; Tubo de</td><td></td>Polipropileno</tr><tr><td>OptiPrep&trade; &nbsp; Gradiente de densidade Médio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 10 mL-18G agulha</td><td>BD</td><td>305064</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro de laboratório</td><td>VWR</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de troca aniônica</td><td>PALL MSTG25Q6 de laboratório</td><td></td><td> Unidade Acrodisc com membrana Mustang Q </td></tr><tr><td>Unidade de filtro centrífugo</td><td>Dispositivo Merck</td><td>Z740210-24EA</td><td> Amicon Ultra-4 </td></tr><tr><td>Kits de isolamento de DNA de plasmídeo livre de endotoxinas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A33073</td><td></td></tr><tr><td>Na2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td> Tubo Falcon <td>de 15 mL</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352196</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352070</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro</td><td>Novatech</td><td>30209-1232</td><td> CGGCCTCAGFGAGCGA </td></tr><tr><td>Primer direto para sequência</td><td></td><td></td> de repetição terminal invertida (ITR) <td> GGAACCCCTAGTGATGGAGTT </td></tr><tr><td>Primer reverso para sequência</td><td></td><td></td> de repetição terminal invertida (ITR) <td> CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG </td></tr><tr><td>5&agudo; FAM / 3&agudo; Sonda BHQ1</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtro de 0,22 mm</td><td>Filtro Merck</td><td>SLGV004SL</td><td>Millex-GV</td></tr><tr><td>EQUIPMENT AAV5 PREPARAÇÃO DO VETOR VIRAL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezer -20 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezer -80 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geladeira +4 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV sala</td><td></td><td></td><td></td>viral</tr><tr><td>Sistema de água ultrapura</td><td>Merck</td><td>Milli-Q&reg; IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>VWR</td><td>444-0004</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>2540 EL</td><td></td></tr><tr><td>Reação em cadeia da polimerase (PCR)</td><td>BioRad</td><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>PCR quantitativo (qPCR)</td><td>Roche</td><td>LightCycler&reg; 480 Sistema</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST16</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>ANIMAL MODEL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG2-Cre camundongos</td><td>Jackson</td><td>NG2-CrexB6129, estoque #008533</td><td></td></tr><tr><td>REAGENTES PARA INJEÇÃO DE FATORES DE REPROGRAMAÇÃO NO CÉREBRO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td>70%</td></tr> <tr><td>Etanol</td><td>Solveco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolfurane</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td> Diluir a 1% solução com água morna. </td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Viroderm</td><td>7511&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Apoteket AB</td><td>P0500000</td><td> i.p. para procedimento terminal na dose de 60 mg/ml. </td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Merck</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Retrobeads</td><td>Lumafluor</td><td>R170</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>EQUIPAMENTO PARA INJEÇÃO DE FATORES DE REPROGRAMAÇÃO NO CÉREBRO</td><td></td><td></td><td> da RSG Solingen. </td></tr><tr><td>Tesouras</td><td>VWR</td><td>233-1552</td><td>da Biochem.</td></tr><tr><td>Pinça</td><td>VWR</td><td>232-0007</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td>VWR</td><td>232-0120</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para bisturi</td><td>VWR</td><td>RSGA106.621</td><td>Número 20.</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>VWR</td><td>RSGA106.200</td><td></td></tr><tr><td>Estrutura estereotáxica</td><td>Stoelting Europe</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Barras auriculares de rato</td><td>Stoelting Europe</td><td>51648</td><td>5 ul</td></tr><tr><td>Seringa com agulha amovível</td><td>Hamilton Company</td><td>65</td><td> 0,75 diâmetro interior e 1,5 diâmetro exterior. </td></tr><tr><td>Glass capilaries</td><td>Stoelting</td><td>50811</td><td></td></tr><tr><td>Extrator capilar de vidro</td><td>Sutter company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Broca odontológica</td><td>Agnthos AB</td><td>1464</td><td></td></tr><tr><td>Barbeador</td><td>Agnthos AB</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano Câmara e bomba</td><td>Agnthos AB</td><td>8323101</td><td>Seringas de 2 mL</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>Z118400-30EA</td><td>25G</td></tr><tr><td>Agulhas</td><td>Merck</td><td>Z192414&nbsp; Adaptador</td> de rato e rato neonatal Aldrich <td></td></tr><tr><td>para estrutura estereotáxica</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Braintree scientific, inc</td><td>53800M</td><td> De Covidien 2187. </td></tr><tr><td>Gaze de algodão</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-902</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de borracha</td><td>Elfa Distrelec</td><td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-366-473</td><td></td></tr><tr><td>REAGENTES PARA GRAVAÇÕES DE PATCH CLAMP DE CÉLULAS INTEIRAS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td> ver Sistema de Água Ultrapura </td></tr><tr>Água <td>Ultrapura</td><td></td><td></td><td>Prepare 1 ou 2M.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>K-D-gluconato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH-EGTA (Etilene glicol-bis-N-ácido tetrético)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889&nbsp; Ácido Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KOH- Hepes (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Mg2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>Merck</td><td>P1675&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Merck</td><td>C239 Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</td>Pipeta de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vidro borossilicato</td><td>Sutter Company</td><td>B150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Extrator capilar de vidro</td><td>Sutter company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>Clampfit software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td><td></td><td></td><td> Use a uma concentração de 4%.&nbsp; CUIDADO:&nbsp; O PFA é um fixador potente. Evite a ingestão e o contato com a pele. </td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td> Uso na concentração de 0,1%. </td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>10254640</td><td> Burro.Use na concentração de 1: 400. </td></tr><tr><td>Soro</td><td>Merck Millipore</td><td>S30-100ML</td><td> Reconstitua o pó em água Milli-Q a 1 mg/mL. Alíquota e loja a -20&deg; C,&nbsp; sensível à luz. Use na concentração de 1: 500. </td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2&prime;-fenilindol dicloridrato (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td> 1: 600 em KPBS-T. </td></tr><tr><td>estreptavidina- Cy3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>434315</td><td>1:5000, coelho.</td></tr><tr><td>Anti-GAD65/67</td><td>Abcam</td><td></td><td>1:2000, camundongo.</td></tr><tr><td>Anti-PV</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td>1:200, cabra.</td></tr><tr><td>Anti-Chat</td><td>Merk</td><td>AB143</td><td>1:5000, coelho.</td></tr><tr><td>Anti-NPY</td><td>Immunostar</td><td>22940</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td>1:1000, frango.</td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Solução de montagem</td><td>Merck</td><td>10981</td><td> Meio de montagem de álcool polivinílico com DABCO&reg;, antidesbotamento </td></tr><tr><td>OCT</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Água</td><td></td><td></td><td></td>destilada</tr><tr><td>Solução anticongelante</td><td>Tissue Pro Technology</td><td>AFS05-1000N, 1000 mL / ea.</td><td></td></tr><tr><td>< FORTE>EQUIPAMENTO PARA IMUNO-HISTOQUÍMICA< / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência invertida</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>de</td><td>varredura a laser Leica TCS SP8.</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo reprogramação direta de células gliais residentes em interneurônios por injeção intracerebral de vetores virais

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Convertendo glia residente no cérebro em neurônios funcionais e subtipo-específicos in vivo fornece um passo em frente para o desenvolvimento de terapias alternativas de reposição celular, criando também ferramentas para estudar o destino da célula in situ. Até à data, foi possível obter neurônios via in vivo reprogramação, mas o fenótipo preciso desses neurônios ou como eles amadurecem não foi analisado em detalhes. Neste protocolo, nós descrevemos uma conversão mais eficiente e uma identificação Cell-specific dos neurônios in vivo reprogramados, usando um sistema viral AAV-baseado do vetor. Também fornecemos um protocolo para avaliação funcional da maturação neuronal das células reprogramadas. Injetando os vetores da aleta-excisão (Flex), contendo os genes reprogramação e do repórter synapsin-conduzidos aos tipos específicos da pilha no cérebro que servem como o alvo para a reprogramação da pilha. Esta técnica permite a fácil identificação de neurônios recém-reprogramados. Os resultados mostram que os neurônios reprogramados obtidos funcionalmente amadurecem ao longo do tempo, recebem contatos sinápticos e mostram Propriedades eletrofisiológicas de diferentes tipos de interneurônios. Usando os fatores de transcrição Ascl1, Lmx1a e Nurr1, a maioria das células reprogramadas tem propriedades de fast-spiking, parvalbumin-contendo interneurônios.

A injeção de vetores de AAV é usada para reprogramar com sucesso pilhas NG2 do glia do residente nos neurônios no estriado do rato de NG2-CRE (Figura 1a). Para direcionar especificamente NG2 glia, os vetores FLEX com genes de reprogramação/repórter, são inseridos em uma direção antisense e ladeados por dois pares de sites antiparalelos, heterotípicos loxP (Figura 1b). Cada um dos três genes de reprogramação (Ascl1, Lmx1a e Nurr1) é colocado o controle do promotor CBA onipresente em vetores individuais. A fim certificar-se que a expressão de GFP é restrita aos neurônios reprogramados que originam de uma pilha CRE-expressando, GFP está coloc o controle do promotor do sinapsina neurônio-específico, (também em um vetor do Flex).
O uso da combinação de reprogramação e de construções de repórter permite a geração de neurônios GFP-positivos no estriado do rato (Figura 1C, C '). O uso do constructo repórter sem a presença de genes de reprogramação não produz neurônios GFP-positivos (Figura 1D).
Os neurônios reprogramados que são biocitin-preenchidos são visíveis após a imuno-coloração post-mortem (Figura 2a). Se a conversão for bem-sucedida, deve haver extensa morfologia neuronal. As gravações eletrofisiológicas de neurônios reprogramados demonstram presença de conexões funcionais pós-sinápticas com medidas espontâneas de atividade (Figura 2b, C). Isso pode ser bloqueado com um bloqueador de gabaérgica ou glutamatérgico ionotrópico (Picrotoxina ou CNQX), sugerindo entrada sináptica excitatória e inibidora para os neurônios reprogramados. A ocorrência de atividade espontânea aumenta com o tempo pós-injeção viral (Figura 2D), indicando uma maturação gradual.
Os potenciais de ação atuais-induzidos estão atuais em neurônios funcionais. Os potenciais de ação aumentam em número ao longo do tempo após a conversão (Figura 2e). Isto indica ainda a maturação na função neuronal. Em um Neuron imaturo, a corrente induz qualquer um ou muito poucos potenciais de ação (Figura 2F).
Os padrões de queima de um neurônio é o tipo de célula específico, pois depende de fatores como a morfologia das células e a expressão do canal15. Os padrões gravados nos neurônios reprogramados in vivo podem ser distinguidos em grupos e comparados com os subtipos neuronais endógenos, por exemplo, interneurônios de cravamento rápido (célula tipo B, Figura 3B) ou outros tipos de células (Figura 3a, C, D ). As diferenças eletrofisiológicas observadas podem ser confirmadas pela presença de marcadores de subtipo específicos e coexpressão com GFP (Figura 3E-H). Ao todo, esses dados indicam que os neurônios reprogramados presentes no estriado apresentam propriedades de diferentes tipos de interneurônios, como Parvalbumina, ChAt e NPY, expressando interneurônios, bem como a identidade do neurônio médio estriatal (DARPP32 +) ( Figura 3E -H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"> Figura 1: reprogramação in vivo de NG2 glia residente em neurônios. (A) representação esquemática da reprogramação in vivo mediada pelo vírus AAV de NG2 glia estriatal. (B) representação esquemática dos CONSTRUCTOS Flex AAV5 utilizados na reprogramação in vivo, em que a expressão gênica é regulada pela expressão CRE nas células visadas. (C e c ') os neurônios reprogramados in vivo, resultantes da injeção de SYN-GFP + ALN no striatum. (D) ausência de neurônios reprogramados quando nenhum fator de reprogramação é adicionado ao coquetel viral, e somente a construção de repórter é injetada in vivo. Barras de escala = 100 mm (C), 25 mm (C '), 25 mm (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"> Figura 2: os neurônios reprogramados in vivo são funcionais e mostram a maturação ao longo do tempo. (A) Neuron reprogramado biocytin-enchido, mostra a morfologia neuronal madura, incluindo espinhas dendríticas. Traços mostra (B) atividade inibitória (gabaérgica) que é bloqueada com Picrotoxina, um antagonista do receptor GABAa e (C) atividade excitatórios que é bloqueada com CNQX, um antagonista do receptor de AMPA. (D) o número de neurônios com atividade pós-sináptica aumenta ao longo do tempo. (E) os neurônios remendado mostram o acendimento repetitivo já em 5 semanas após a injeção (w.p.i.) e continuam a mostrar que em 8 e 12 w.p.i. (F) o potencial de ação atual-induzido e a atividade pós-sináptica de um neurônio imaturo, mostrando poucos sináptica eventos e poucos potenciais de ação em comparação com B e D. barra de escala = 25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"> Figura 3: os neurônios reprogramados in vivo apresentam propriedades imuno-histoquímicas e eletrofisiológicas de interneurônios estriatal. (A-D) Os padrões de disparo dos neurônios reprogramados in vivo podem ser de tipos distintos: (a) o tipo a é semelhante ao neurônio spiny médio ENDÓGENO (DARPP32 +); (B) semelhantes aos interneurônios de cravagem rápida (PV +); (C) semelhante a neurônios de cravagem de baixo limiar com caída proeminente (NPY +); (D) neurônios disparando com grande pós-hiperpolarização (chat +). (E-H) Imagens confocais mostrando colocalização de GFP e os marcadores de interneurônio PV (e), ChAT (F), NPY (G) e marcador de neurônio de projeção DARPP32 (H). Todas as barras de escala = 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo tem como objetivo gerar interneurônios diretamente reprogramados in vivo, usando um sistema viral baseado em AAV no cérebro e um repórter GFP orientado por synapsin FLEX, que permite a identificação celular e análise mais aprofundada in vivo.

In vivo reprogramação direta de células gliais residentes em interneurônios por injeção intracerebral de vetores virais

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Este protocolo mostra que é possível gerar novos neurônios diretamente no cérebro a partir de glia residente e que essas células reprogramadas amadurecem em neurônios específicos do subtipo. A principal vantagem é o vírus AAV dependente de cre que permite o direcionamento específico do NG2-glia e do repórter GFP que rotula os neurônios reprogramados para análise. Gerar novos neurônios no cérebro pode levar ao desenvolvimento futuro de terapias de substituição celular no cérebro.Em nosso protocolo, geramos os interneurônios parvalbumin-positivos que têm implicações para transtornos psiquiátricos. A reprogramação in vivo pode ser aplicada a outras áreas cerebrais e circuitos, dependendo do fenótipo neuronal e da condição neurológica que você deseja atingir. O procedimento será Jenny Johansson:a técnica, Maria Pereira: ex-doutoranda, e Marcella Birtele: doutoranda em nosso laboratório.Para produzir vetor viral AAV5, as células hek293T com meio de cultura padrão em cinco frascos T175. Quando as células atingirem 50 a 70% de confluência, prepare a seguinte mistura para transvecção. Em um tubo de centrífuga de 50 mililitros, adicione quantidades molares iguais de plasmídeo vetor e plasmídeo de ajudante da série pDG.Adicione o buffer Tris-EDTA a um volume final de 144 microliters e adicione água ultrauso para resultar em um volume total de 1296 microliters e misturar. Em seguida, adicione 144 microliters de 2,5 cloreto de cálcio molar e misture. Depois disso, adicione 1,92 mililitros de HBS à solução de DNA e vórtice imediatamente.Incubar em temperatura ambiente por exatamente 60 segundos. Posteriormente, transfira a solução para 28 mililitros de cultura celular fresca e misture. Substitua o meio nos frascos pelo mix de transvecção médio contendo.Espere três dias, e transfira a mídia para o lixo. Adicione cinco mililitros de tampão de colheita a cada frasco, em seguida, adicione outros quatro mililitros de DPBS a cada frasco para enxaguar as células restantes e pool com a solução celular. Centrifugar as células colhidas a 1.000 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, remova o supernasce e dissolva a pelota em 15 mililitros de tampão de lise. Congele o tubo de centrífuga de 50 mililitros em gelo seco por 15 minutos e armazene em um congelador de menos 20 graus Celsius. Antes do uso, descongele a célula colhida em um banho de água a 37 graus Celsius.Neste procedimento, realize a purificação de AAV por ultracentrifugação de gradiente iodixanol e use tubos de teto ultracentrifuuge com centrifugação a 350,000 x g durante uma hora e 45 minutos à temperatura ambiente. Para extrair a fase contendo AAV, insira uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 18 a cerca de dois milímetros abaixo da borda da fase de 40 a 60% com o bisel voltado para cima e retire. Certifique-se de parar antes de chegar à faixa proteica depois que cinco a seis mililitros do vetor viral foram extraídos.Em seguida, purfique e concentre o gradiente iodixanol diluído através de um filtro de troca de ânion, empurrando-o através de uma taxa não mais rápida do que uma gota por segundo. Posteriormente, empurre três mililitros de tampão IE lentamente através do filtro para lavá-lo. Em seguida, elute a mistura em uma unidade de filtro centrífuga com um a dois mililitros de tampão de eluição.Adicione DPBS ao dispositivo a um volume final de quatro mililitros. Centrifugar a 2.000 x g em temperatura ambiente até que menos de 0,5 mililitros de DPBS seja deixado no filtro. Depois, remova o líquido da parte inferior do tubo, rechee com quatro mililitros de DPBS e centrífuga novamente.Repita esta etapa mais duas vezes, certifique-se de que o volume de vetor concentrado no filtro seja de cerca de 200 microliters após a última centrifugação. Remova o vetor concentrado de 200 microliter usando uma pipeta e empurre-o através de um filtro de 0,22 micrômetro para esterilizar. Em seguida, alíquota de 200 microliters em um frasco de vidro com inserção intertravada.Para injetar fatores de reprogramação, coloque um mouse anestesiado no quadro estereotaxista. Administre analgesia apropriada no início da cirurgia, em seguida, traga a ponta do capilar de vidro da agulha de injeção logo acima de bregma. Certifique-se de que a ponta capilar está perfeitamente reta em ambos os planos A-P e M-L.Redefinir os valores M-L e A-P para 0,0 no contador de coordenadas digitais. Para ter certeza de que a cabeça do animal está em uma posição perfeitamente plana, use o contador de coordenadas digital para medir o valor da coordenada D-V quando o braço A-P estiver em mais 2.0 e menos 2.0, bem como quando o braço M-L estiver em mais 2,0 e menos 2.0. Ajuste a altura da barra de dente e as barras de ouvido em conformidade.Depois, levante ligeiramente a seringa e faça um furo usando uma broca dentária nas coordenadas de injeção. Comece a perfurar no local, trabalhando de forma circular e suave. Em seguida, coloque um pedaço de gaze de algodão sobre a incisão aberta e lave a seringa com solução salina.Após a descarga, elave uma bolha de ar e, em seguida, um microliter de solução contendo o vetor viral. Certifique-se de que a solução viral pode ser facilmente visualizada abaixo da bolha de ar. Em seguida, abaixe a seringa, progredindo lentamente até a profundidade desejada, e certifique-se de que a trajetória está livre de fragmentos ósseos.Posteriormente, injete um microliter da solução viral a uma taxa de 0,4 microliters por minuto. Quando a injeção estiver pronta, deixe dois minutos para difusão antes da retirada da seringa. Após a difusão, retraia lentamente a seringa até que a ponta do capilar seja completamente retirada do cérebro, em seguida, sutura cuidadosamente a incisão e remova o animal do quadro estereotaxic.Monitore o animal em uma estação pós-operatória até que a consciência seja recuperada. Os animais são mantidos por até 12 semanas após a injeção do vírus para permitir que a glia residente se reprograme em neurônios maduros. Para preparar fatias cerebrais para eletrofisiologia usando um vibratome, se sectionie o cérebro da parte mais rostral até o nível estriatal em alta velocidade.Em seguida, se sectionia o estriato coronally a 275 micrômetros a 0,1 milímetros por segundo. Após cada seção, remova cuidadosamente o lado striatal não injetado e transfira o lado injetado em um frasco com uma rede inferior e tobosse de sentido CREB oxigenado no banho de água à temperatura ambiente. Mantenha o frasco em temperatura ambiente até que todas as seções sejam cortadas.Depois, aumente lentamente a temperatura do banho de água para 37 graus Celsius e deixe-o por 30 minutos, depois desligue o aquecedor e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Depois de transferir uma seção de tecido para uma câmara de gravação para eletrofisiologia, monte a pipeta de vidro no eletrodo de gravação e abaixe-a para a solução. Verifique duas vezes a resistência do eletrodo.Em seguida, aproxime-se lentamente da célula reprogramada com a pipeta, mantendo uma leve pressão positiva no eletrodo para evitar ligar a ponta, e verifique se a célula é GFP positiva antes de corrigir. Quando a célula estiver remendada, mantenha a célula no grampo de corrente de menos 60 a menos 70 milivolts, e injete correntes de 500 milissegundos de menos 20 a mais 90 picoamperes com incrementos de 10 picoampere para induzir potenciais de ação. Isso indica uma maturação neuronal e reprogramação bem sucedida.Posteriormente, mude para o grampo de tensão e meça o sódio interior e as correntes de potássio retificadoras atrasadas em etapas despolarizantes de 10 milivolts. Aqui está um neurônio reprogramado cheio de biocitada que mostra morfologia neuronal madura e as espinhas dendríticas registradas. Aqui, gravações eletrofisiológicas dos neurônios reprogramados mostram a presença de conexões funcionais postináspticas com medidas de atividade espontânea.Traços mostram a atividade inibitória que está bloqueada com picrotoxina, um antagonista do receptor GABAA e a atividade excitatória que é bloqueada com CNQX, um antagonista do receptor AMPA. Os neurônios corrigidos já mostram atividade pós-sináptica em cinco semanas após a injeção, e continuam com oito e 12 semanas após a injeção. O número de neurônios com potenciais de ação induzidos atuais também aumenta com o tempo.Uma análise mais detalhada revelou vários padrões distintos de disparo onde a maioria das células mostram atividade de espetamento rápido semelhante aos interneurônios parvalbumin. A análise imunohistoquímica em 12 semanas mostrou ainda a co-expressão do repórter GFP e do parvalbumin. Após este procedimento, você pode examinar a expressão genética com a técnica de busca de patches ou avaliar a conectividade sináptica tridimensional com rastreamento monossináptico e iDISCO.Agora que é possível reprogramar a glia residente em interneurons expressos de parvalbumin, começamos a investigar se estes são autênticos e podem ser usados como uma ferramenta terapêutica. Lembre-se de seguir os protocolos e diretrizes estabelecidos ao manusear animais e usar o vírus AAV.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui apresentamos a injeção intracraniana de vetores de AAV para a rotulagem fluorescentes de neurônios e células gliais no córtex visual.

Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

Este vídeo demonstra um protocolo para avaliar a maturação e reprogramação de células gliais em neurônios em uma fatia de estriado de camundongo transfectada. O experimento mede o potencial da membrana em repouso e a resposta às injeções de corrente usando marcadores fluorescentes específicos de neurônios e técnicas eletrofisiológicas. Picos de voltagem durante essas medições indicam maturação e reprogramação neuronal bem-sucedidas.

Registros eletrofisiológicos de neurônios reprogramados em uma fatia de cérebro de camundongo

Fonte: Pereira, M. et. al., Reprogramação direta in vivo de células gliais residentes em interneurônios por injeção intracerebral de vetores virais. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a injeção estereotáxica de um vírus adeno-associado no córtex cerebral de um camundongo transgênico para fornecer reprogramação neuronal dependente de Cre e genes repórteres fluorescentes em células gliais.

Injeção estereotáxica de vetores virais para reprogramação de células gliais em modelo de camundongo

Segmentação células cerebrais residente linhagem-reprogramação direta oferece novas perspectivas de reparação do cérebro. Aqui nós descrevemos um protocolo de como preparar culturas enriquecido para pericitos cerebrais residente do córtex cerebral humano adulto e convertê-las em neurônios induzidos pela expressão mediada por retrovírus de fatores de transcrição Sox2 e Ascl1.

Lineage-reprogramação de células pericyte derivados do Adulto Cérebro Humano em neurônios induzidos

Aqui demonstramos uma técnica para transdução neuronal generalizada por injeção intraventricular de vírus adeno-associado no cérebro de camundongo neonatal.  Este método fornece uma maneira rápida e fácil de obter a expressão vitalícia de transgenes entregues por vírus.

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

Com base na engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais, seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e avaliação morfométrica pareada de derivados de "teste" e "controle", este método permite a modelagem precisa do controle genético in vivo de neokortikalny morfologia do neurônio de forma simples e acessível.

Transplante intraventricular de precursores neuronais projetados para estudos de Neuroarquitetura in vivo

Aqui nós apresentamos um protocolo, projetado usar ferramentas chemogenetic para manipular a atividade de progenitores corticais do interneurônios transplantados no córtice de ratos pós-natal adiantados.

Transplantação dos progenitors corticais Quimiogenetically projetados do interneuron em cérebros Postnatal adiantados do rato

Descrevemos um protocolo para reprogramar fibroblastos derivados da pele humana em células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs), e sua subsequente diferenciação em Astrocitos induzidos (iAs). Este método leva a uma geração rápida e reprodutível de iNPCs e iAs em grandes quantidades.

Modelagem in vitro para doenças neurológicas usando conversão direta de fibroblastos para células progenitoras neuronais e diferenciação em astrócitos

Descrevemos o transplante intraparenquimal de células progenitoras neurais transduzidas com um vetor de repórter duplo expressando proteína fluorescente verde-luciferase (GFP) no cérebro do camundongo. Após o transplante, o sinal de luciferase é repetidamente medido usando bioluminescência in vivo e células enxertadas expressas por GFP identificadas em seções cerebrais usando microscopia de fluorescência.

Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro do camundongo

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para gerar culturas altamente enriquecidas de astrócitos derivados de diferentes regiões do sistema nervoso central de camundongos pós-natais e sua conversão direta em neurônios funcionais pela expressão forçada de fatores de transcrição.

Isolamento e Reprogramação Neuronal Direta de Astrócitos de Camundongos

Aprenda a reprogramação in vivo de células gliais residentes em interneurônios parvalbumina-positivos usando vetores virais AAV em modelos murinos. Este método demonstra conversão celular direta no cérebro com aplicações em distúrbios psiquiátricos.

In vivo reprogramação direta de células gliais residentes em interneurônios por injeção intracerebral de vetores virais

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