Name: Capturando a molécula pequena comunicação entre os tecidos e células usando a imagem latente de espectrometria de massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprenda a mapear a comunicação por pequenas moléculas entre células e tecidos usando espectrometria de massa por imagem sem marcação. Este método revela alvos terapêuticos em metástase de câncer de ovário.

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O financiamento foi fornecido pelo consórcio biomédica Chicago, com o apoio dos fundos Searle em Chicago comunidade Trust (C-076) (LMS); Universidade de Illinois em Chicago inicialização fundos (LMS); Grant 543296 da Aliança de fundo de pesquisa de câncer de ovário (MD); e UG3 ES029073 (J.E.B) e pelo centro nacional para avançar translacional Ciências, Instituto Nacional de saúde, através da concessão de UL1TR002003 (JEB & LMS).

Todos os procedimentos de animais estavam em conformidade com a institutos nacionais de saúde orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório e aprovaram pelo Comitê de uso institucional do Animal e cuidados (IACUC) na Universidade de Illinois em Chicago.
1. preparação dos reagentes
<ol><li>Manter células de epitélio ovidutária murino (MOE) a 37° C com 5% CO2 em uma incubadora umidificada no alfa mídia meio essencial mínimo (αMEM), suplementada com 10% de soro fetal bovino selênio (FBS), 2 mM L-glutamina, insulina 10 mg/mL, transferrina, (ITS) , ng/mL 1.8 fator de crescimento epidérmico (EGF), 100 U/mL penicilina-estreptomicina, gentamicina 1 mg/mL e 18.2 ng/mL estradiol-17 β. Passe as células a cada 3-4 dias, garantindo que existem células suficientes no mesmo dia os ratos vão ser sacrificados.</li>
	<li>Prepare a agarose 2% misturando-se 1 g de agarose de baixo ponto de fusão com 50 mL de água destilada. Autoclave o agarose, deixar arrefecer, e então alíquota (1 mL) em 2 mL de tubos (ver Tabela de materiais) antes de agarose solidifica. Agarose pode ser armazenado a-20 º C por tempo indeterminado.</li>
	<li>Prepare pelo menos 2 mL de médio (DMEM) meios de comunicação modificado águia de 1 x Dulbecco.</li>
	<li>Para a matriz para MALDI-TOF MS, prepare-se 10 mL de 5 mg/mL ácido alfa-ciano-4-hyroxycinnamic de 1:1 (CHCA): ácido benzoico (DHB) (ver Tabela de materiais) em 90:10 ACN:H2O + 0,1% o ácido trifluoroacético (TFA). Proceda à sonicação solução até matriz é dissolvido.</li>
</ol>2. mouse colônia e remoção do ovário
<ol><li>Manter casais reprodutores de camundongos CD-1 usando procedimentos padrão de habitação. Perto do dia do parto, verificar os ratos todos os dias para que a idade dos filhotes é conhecida.</li>
	<li>Eutanásia em filhotes com 16 – 18 dias de idade por inalação de CO2 por diretrizes do NIH. Entregar o CO2 (100%) em um fluxo taxa de 10%-20% volume por minuto de câmara e continuar durante dois minutos depois de respiração parou. Confirme a eutanásia por deslocamento cervical.</li>
	<li>Desinfecte todos os equipamentos cirúrgicos submergindo em etanol a 70%. Aquecer L-15 meios de comunicação a Leibovitz com 1 x penicilina-estreptomicina 37 ° c.</li>
	<li>Molhe a superfície abdominal com etanol a 70% para desinfetar a área e minimizar a contaminação com cabelo. Alcance a pele que cobre a parede abdominal usando romba fórceps e uso tesoura cirúrgica tornar-se uma grande forma de V corte através da pele e a parede abdominal, expondo os órgãos internos.</li>
	<li>Mova os órgãos internos para o lado usando fórceps. Individualmente agarrar cada corno uterino com uma pinça fina e levante ligeiramente.</li>
	<li>Localize o ovário, que será no final do corno uterino, imediatamente abaixo do rim. Use uma tesoura cirúrgica para dissecar o ovário livre de tecido conjuntivo. Em seguida, corte a trompa ovário ao meio.</li>
	<li>Mover o ovário, oviduto e aproximadamente uma metade de cada corno uterino para mídia de L-15 do Leibovitz previamente aquecido.</li>
	<li>Sob um microscópio dissecar cuidadosamente mover cada ovário de bursa circundante, libertando-o do oviduto, bursa e qualquer tecido adiposo. Mover-se para um novo prato de mídia do L-15 do Leibovitz cada ovário.</li>
	<li>Corte cada ovário ao meio axialmente. Manter as peças no ovário (agora chamadas de explantes) mantidas a 37 ° C até chapeamento de agarose.</li>
</ol>3. criação e incubando o Slide ITO-tratada para Cocultures
<ol><li>
Cocultures indivisos
	<ol>
<li>Dissolver o agarose a 70 ° C, em um prato quente.</li>
		<li>Coloque o divisor 8 poços em cima tinoxide o índio (ITO)-slide tratada (figura 1A). O fundo de borracha na linha divisória auxilia na adesão ao slide, mas certifique-se de aplicar uma pressão descendente suave contínua durante chapeamento de agarose para garantir que nenhum escape ou mistura entre poços.</li>
		<li>Recolher pilhas em um tubo cônico de 15 mL, centrifugador (5 min a 800 rpm) e ressuspender a 50 mil células por 150 µ l em 1 x DMEM de mídia. Se uma densidade de célula diferente é ideal, certifique-se que nesta etapa a suspensão celular é 2x a densidade final desejada (por exemplo, para uma concentração final de 50.000 células em 300 µ l, densidade celular neste passo é 50.000 células em 150 µ l).</li>
		<li>Antes do chapeamento cultura celular, adicionar explante ovário ao centro do poço (figura 1B).</li>
		<li>Adicione agarose para cada cultura de células em tubos individuais 2ml antes do chapeamento. Para cada poço, combine 200 µ l de suspensão de células e 200 µ l de agarose liquefeito em um tubo de 2 mL. Por exemplo, para quatro poços, combine 800 µ l de suspensão de células e 800 µ l de agarose 2%. Uma mistura ficarão sobre, mas fazendo um pouco mais do que necessário evita bolhas de ar durante a pipetagem.<ol>
<li>Adicione agarose para culturas de células individuais, imediatamente antes do chapeamento essa cultura de célula. A agarose será legal em menos de um minuto, então esteja preparado para placa rapidamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Imediatamente adicione 300 µ l da mistura de célula/agarose a cada poço (Figura 1). A Figura 1 mostra três condições de célula e a condição de uma mídia, que cada um chapeado com e sem um ovário.</li>
		<li>Incube o slide em 37 ° C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cocultures divididas.
	<ol>
<li>Corte os divisores de plástico fino, liso (Figura 2A). Nota: Esta experiência usa os lados de uma bacia de mídia descartável estéril, porque eles são lisos e finos. Cortá-los só larga o suficiente para se encaixar confortavelmente a hipotenusa do poço (~ 13 mm).</li>
		<li>Dissolver o agarose a 70 ° C, em um prato quente.</li>
		<li>Coloque o divisor 8-bem em cima do slide ITO-tratada (Figura 2B). O fundo de borracha na linha divisória auxilia na adesão ao slide, mas certifique-se de aplicar uma pressão descendente suave contínua durante chapeamento de agarose para garantir que nenhum escape ou mistura entre poços.</li>
		<li>Recolher pilhas em um tubo cônico de 15 mL, centrifugador (5 min a 800 rpm) e ressuspender a 50 mil células por 150 µ l em 1 x DMEM de mídia. Se uma densidade de célula diferente é ideal, certifique-se que, neste passo, a suspensão de células é 2 x a densidade final desejado (por exemplo, para uma concentração final de 50.000 células em 300 µ l, densidade celular neste passo é 50.000 células em 150 µ l).</li>
		<li>Inserir divisores de plástico na diagonal em poços (Figura 2).</li>
		<li>Adicione agarose à cada suspensão de células um uma hora antes do chapeamento. Para cada poço, combinam-se 100 µ l de suspensão de células e 100 µ l de agarose liquefeito em um tubo de 2 mL. Por exemplo, para quatro poços, combine 400 µ l de cultura celular e 400 µ l de agarose 2%. Uma mistura de célula/agarose ficarão sobre mas fazendo um pouco mais do que necessário evita bolhas de ar durante a pipetagem.<ol>
<li>Adicione agarose para culturas de células individuais, imediatamente antes do chapeamento essa cultura de célula. A agarose será legal em menos de um minuto, então esteja preparado para placa rapidamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>De um lado da linha divisória, placa 150 µ l de mistura de célula/agarose. Permitir que a agarose esfriar e solidificar (cerca de um minuto) e em seguida retire o divisor (Figura 2D).</li>
		<li>Coloque o ovário explante no centro da metade vazia do poço. Mistura de mídia/agarose lugar 150 µ l sobre a parte superior do ovário e apenas no lado correto do poço (Figura 2E).</li>
		<li>Incube o slide em 37 ° C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Slide de secagem e preparação para MALDI-TOF-MS
<ol><li>Depois de quatro dias (ou qualquer ponto do tempo preferido), retire o divisor de câmara os plugues de agarose e o slide (Figura 1). Suavemente retire os lados do agarose da câmara com uma espátula plana e puxe suavemente a câmara para cima, tomando cuidado para não mover qualquer plugue de agarose. Se movem, suavemente, substituí-los para que eles não estão tocando um ao outro.</li>
	<li>Coloque o slide em um forno de 37 ° C por aproximadamente 4h, girar 90° cada h. Nota: A rotação do slide é importante para garantir a distribuição de calor mesmo por toda a amostra.</li>
	<li>Depois de seco, retire a lâmina do forno (Figura 1E).</li>
	<li>Aplique a solução de matriz usando o pulverizador (Figura 1F), com os seguintes parâmetros: temperatura = 30 ° C, vazão = 0,2 mL/min, o número de passes = 8, direção = CC e distância do bocal = 40 mm. Nota: Em vez de um pulverizador de matriz, um aerógrafo artístico pode ser usado para aplicar líquido matriz. A mesma solução de matriz pode ser usada para pulverizar, mas aproximadamente duas vezes mais solução é necessária. Com o slide pinçado para que pendura-se verticalmente, pulverizar o slide de um ângulo de 90° de aproximadamente um pé de distância (adaptado de Hoffmann15) até a matriz de camada é visível.</li>
	<li>Adicione 1 µ l de calibrant (fósforo vermelho para alvos < 500 promotora, uma mistura de peptídeo (ver Tabela de materiais) para alvos < Da 5.000) para claro local no slide. Fósforo vermelho não requer nenhuma mistura com matrix, mas a mistura de peptídeo requer mistura 1:1 com matriz para ionização de auxílio. Espere por calibrant secar.</li>
	<li>Desenhar um X usando um marcador permanente em cada canto do slide e levar uma imagem óptica usando um scanner ou uma câmera em 1.200 dpi.</li>
</ol>5. imagem latente de aquisição de dados de espectrometria de massa
<ol><li>Abra uma nova sequência sobre o software de análise de dados IMS (ver Tabela de materiais). Defina a largura de varredura para resolução espacial desejada, pelo menos 50 µm.</li>
	<li>Carregar a imagem ótica do slide para o software de análise e definidos três ensinam pontos usando as interseções nos x ' s desenhados em cada canto.</li>
	<li>Designar as regiões de interesse para a imagem latente do software de aquisição e nomeá-los de acordo.</li>
	<li>Calibrar o aparelho usando o software de aquisição de dados (consulte a Tabela de materiais) dentro de erro de 5 ppm.</li>
	<li>Salve o método otimizado e começar a correr. Este experimento otimizado os seguintes parâmetros: polaridade = positivo, Detector = Reflectron, tamanho de Laser = 2, poder do Laser = 50%, ganho de detector de modo Reflector = x 3.</li>
</ol>6. processamento de dados IMS
<ol><li>Importar arquivo de .mis no software estatístico (ver Tabela de materiais) para análise de significância.</li>
</ol>

<ol><li>Paine, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Reproductive+System+Non-Negative+Matrix+Factorization+Mass+Spectrometry+Imaging+of+an+Early-Stage+Ovarian+Cancer+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model.</a> PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).</li>
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<li>Choi, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTERT+Mediates+Norepinephrine-Induced+Slug+Expression+and+Ovarian+Cancer+Aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness.</a> Oncogene. 34 (26), 3402(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

Há um crescente corpo de evidências que implique o papel da noradrenalina em HGSOC12,17,18, e esta técnica contribuiu com informações mais mecanicistas. Pelo menos oito condições biológicas presentes no mesmo slide, o método pode conta para controles biológicos tais como gene e especificidade da célula, bem como controles de mídia em um único IMS executar. Enquanto o método foi otimizado avaliar trocadas pequenas moléculas em um...

Imagem de espectrometria de massa (IMS) foi otimizado para caracterizar a distribuição espacial das características moleculares em três aplicações: fatias de tecido, esferoides e colónias microbianas1,2,3. Fatias de tecido podem ser usadas para avaliar a localização de metabólitos no contexto de condições biológicas em um host, ou alvo ou segmentados em um intervalo específico de massa. No entanto, diferenças entre características moleculares são as mais significativas e óbvio quando um tecido saudável é comparado a uma condição de doente, por exemplo, um tumor. Esta abordagem IMS é particularmente adaptada para detecção de biomarcadores da doença, no entanto, adquirir amostras de tecido em fases distintas na progressão da doença (tais como notas de tumor) opõe-se à identificação dos sinais que pode ser importante para a iniciação do doença. O intercâmbio de informações através do espaço é uma característica onipresente de muitos sistemas biológicos, e fatias de tecido não podem capturar este relé químico dinâmico. Uma técnica que é capaz de visualizar a difusão e a troca química é IMS das colónias microbianas cultivadas em placas de ágar; pequenas moléculas são capazes de difundir através de e através do ágar-ágar e podem ser capturadas através do laser assistida por matriz (MALDI-TOF) de dessorção/ionização espectrometria de massa4. Esta configuração de crescimento pode ser usada para identificar moléculas trocadas entre entidades biológicas distintas (colônias) e também pode determinar a direção de produção do metabólito. A plataforma originalmente projetada para o crescimento da colônia microbiana foi adaptada para explorar o metabolismo primário de tecido explantes cultivados com células de mamíferos, e IMS foi utilizado para avaliar a dinâmica troca de química em um sistema de mamíferos in vitro.
Nos últimos anos, tornou-se claro que o câncer de ovário serosa de alto grau (HGSOC) muitas vezes se origina no epitélio da trompa de Falópio (FTE) e então metastatiza para o ovário durante cedo doença desenvolvimento5,6, 7 , 8. a razão que FTE oncogenicidade células se espalhou para o ovário, onde grandes tumores eventualmente formam e metastatizam ainda mais, é atualmente incerto. A pesquisa anterior centrou-se sobre o papel das proteínas ovarianos primária metástases para o ovário; no entanto, recentemente demonstrou que a transição de um saudável para um tecido oncogenicidade resulta em enormes perturbações do metabolismo celular e altera a produção de pequenas moléculas9,10,11. Portanto, formulamos a hipótese que pequenas moléculas trocadas entre o ETI e o ovário podem ser parcialmente responsáveis por metástase de primário de HGSOC.
Usando nosso procedimento IMS recém-desenvolvido, determinamos que coculture de FTE oncogenicidade e tecido ovariano induz a produção de norepinefrina do ovário. No entanto, outros tipos de célula ou células FTE normais não provocam este efeito. Um extraordinário benefício desse método é que a produção molecular e troca de sinais que representam moléculas reais podem ser visualizados, assim, mesmo em um coculture é possível determinar a fonte do sinal. Esta é uma vantagem com a análise de amostras homogeneizadas, onde todas as informações espaciais são perdidas. Em nosso sistema de modelo, conseguimos atribuir claramente a produção de noradrenalina para o ovário. A noradrenalina tem sido associada à metástase e chemoresistance de câncer de ovário, e nossa detecção desta molécula validou que o novo método IMS pode descobrir moléculas biologicamente relevantes12,13, 14. esta validação permite-nos propor que esta nova aplicação do IMS pode ser particularmente útil para a investigação de grupos que estão tentando identificar moléculas pequenas em ambientes coculture e entender os primeiros eventos que influenciam a transformação de células e metástase. O objectivo geral deste método é elucidar a identidade e a distribuição espacial de pequenas moléculas durante o intercâmbio entre os tecidos e órgãos, representados por em vitro culturas de células 3D ou tecido ex vivo .

<table><tbody><tr><td>Tubos Falcon de 15 mL</td><td>Denville</td><td>C1017-O</td><td>Para coletar células</td></tr><tr><td>Câmara de 8 poços (câmara Millipore EZ-slide)</td><td>Millipore</td><td>PEZGS0816</td><td>Reaproveitado da câmara Millipore Millicell EZ-slide slide</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998-4L</td><td>Solvente para matriz pulverizada</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (&alpha; MEM)</td> <td>Fisher</td><td>10-022-CV</td><td>Meios de cultura celular</td></tr><tr><td>Autoflex velocidade MALDI-TOF LRF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Para análise de dados IMS</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Para coletar células e remover sobrenadante</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201344</td><td>Matrix pulverizado em lâmina seca</td></tr><tr><td>DHB Matrix</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201346</td><td>Matrix pulverizado em lâmina seca</td></tr><tr><td>Bisturis descartáveis</td><td>Fisher</td><td>22-079-707</td><td>Para remoção dos ovários</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Fisher</td><td>13-804-6</td><td>Para remoção dos ovários</td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Mídia misturada com</td></tr><tr><td>fator de crescimento epidérmico</td> de agarose <td>Peprotech Inc.</td><td>100-15 Suplemento de</td><td>mídia de cultura celular</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-282</td><td>Para alíquotas de agarose</td></tr><tr><td>Estradiol-17&beta;</td><td>Simga-Aldrich</td><td>E2758</td><td>Suplemento de mídia de cultura de células</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Denville</td><td>fb5001</td><td>Suplemento de mídia de cultura de células</td></tr><tr><td>FlexControl 3.4</td> Software <td>de aquisição de dados</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td> IMS</tr><tr><td>FlexImaging 4.1</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>Software de análise de dados IMS</td></tr><tr><td>Fórceps (fino) Fórceps</td><td></td> <td>22-327379</td><td>Para remoção do ovários</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Cellgro</td><td>30-005-CR</td><td>Suplemento de meios de cultura celular</td></tr><tr><td>Insulina, Transferrina, Selênio (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11074547001</td><td>Suplemento de meios de cultura celular</td></tr><tr><td>Lâmina revestida com ITO</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>Plataforma para incubação de co-cultura</td></tr><tr><td>Meio L-15 Gibco</td><td></td><td>11415064</td><td>Meio usado durante o tecido dissecação</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Suplemento de meios de cultura celular</td></tr><tr><td>Agarose de baixo ponto de fusão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Misturado com meios para revestimento</td></tr><tr><td>Bacia de meios</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>Usado para cortar divisórias de plástico para câmaras divididas</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Suplemento</td></tr> <tr><td>de meios de cultura celularPadrão de calibração de peptídeos</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8206195</td><td>Calibrante para faixa de massa média</td></tr><tr><td>Phophorus red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343-242-5G</td><td>Calibrante para faixa de baixa massa</td></tr><tr><td>SCiLS Lab 2015</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>Análise estatística de dados IMS</td></tr><tr><td>Fórceps cirúrgico (rombudo)</td> <td>Fisher</td><td>08-875-8B</td><td>Para remoção dos ovários</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Tecnologias</td><td>A116-50</td><td>Adicionado à solução matricial</td></tr><tr><td>TM Pulverizador</td><td>HTX Technologies</td><td></td><td>Para aplicação de matriz</td></tr></tbody></table>

capturando a molécula pequena comunicação entre os tecidos e células usando a imagem latente de espectrometria de massa

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Espectrometria de massa (IMS) de imagem rotineiramente aplicou-se a três tipos de amostras: cortes histologicos, esferoides e colónias microbianas. Estes tipos de amostra foram analisados usando laser assistida por matriz dessorção/ionização tempo-de-voo espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS) para visualizar a distribuição de proteínas, lípidos e metabolitos em toda a amostra biológica de interesse. Nós desenvolvemos um método de preparação de amostra romance que combina os pontos fortes das três aplicações anteriores para abordar uma abordagem underexplored para identificar a comunicação química em câncer, por semeadura de culturas de células de mamíferos em agarose em coculture com tecidos saudáveis, seguidos por dessecação da amostra. Células e tecidos de mamíferos são cocultured nas proximidades, permitindo a comunicação química via difusão entre os tecidos e células. Em pontos específicos de tempo, a amostra com base em agarose é seco da mesma maneira como colónias microbianas preparado para análise IMS. Nosso método foi desenvolvido para modelar a comunicação entre o câncer de ovário serosa da classe elevada, derivado de Falópio como ele interage com o ovário durante a metástase. Otimização da preparação amostra resultou na identificação de norepinefrina como um componente químico chave no microambiente do ovário. Esse método recentemente desenvolvido pode ser aplicado a outros sistemas biológicos que exigem uma compreensão da comunicação química entre células adjacentes ou tecidos.

Um slide de ITO otimamente secado resultará em uma amostra dessecada plana com mínima para sem rugas através da superfície do agarose e pedaços de agarose que mantêm uma separação espacial no slide (Figura 3). A figura 3A mostra ideal de secagem, enquanto a Figura 3B mostra as rugas que devem ser evitadas. Essa otimização requer cuidadoso monitoramento do slide no forno, como vezes exatas podem varia...

Um novo método de preparação da amostra foi desenvolvido para acomodar coculture célula e tecido para detectar a troca de pequena molécula usando espectrometria de massa de imagens.

Capturando a molécula pequena comunicação entre os tecidos e células usando a imagem latente de espectrometria de massa

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Nosso protocolo pode mapear a comunicação química de pequenas moléculas entre células e tecidos, e nós especificamente aplicamos isso para explorar pequenas moléculas na metatese do câncer de ovário. A principal vantagem de nossa técnica é a capacidade de medir pequenas moléculas de forma livre de rótulos, mantendo a integridade espacial das células e tecidos em 2D. Esta técnica nos permitiu interrogar a contribuição de pequenas moléculas em metástases de câncer de ovário de forma não alvo.Isso poderia revelar novos alvos terapêuticos e caminhos que foram anteriormente negligenciados. Essa metodologia poderia facilmente ser estendida a outros cânceres que podem ser cultivados em agarose e qualquer outra doença em que um componente espacial possa ser importante para o fenótipo celular resultante. Garantir que todas as células e componentes estejam à mão e paciência com o processo de secagem é essencial para este protocolo.Um passo de profano apressado pode muitas vezes levar a dados de espectrometria de massa de má qualidade. A demonstração visual deste método é útil na compreensão de nossas etapas de preparação e dessecação da amostra, pois elas se desviam muito de experimentos típicos de espectrometria de massa de imagem que usam tecidos ou micróbios no ágar. Para começar, liquefazer a agarose a 70 graus Celsius em uma placa quente.Coloque o divisor de oito poços em cima do slide tratado pelo ITO. Através do tratamento padrão de trippsina, colete células MOE em um tubo cônico de 15 mililitros, centrífuga, e adicione uma vez mídia DMEM para resuspend para obter uma concentração de 50.000 células por 150 microliters, o que é duas vezes a densidade final desejada. Para coculturas não divididas, use fórceps para adicionar explante ovariana ao centro dos quatro poços.Pouco antes do revestimento, combine 200 microliters de suspensão celular e 200 microliters de agarose liquefeita em tubos individuais de dois mililitros. Evite bolhas de ar durante a pipetação. Imediatamente, adicione 300 microliters da mistura celular-agarose a cada poço, e aplique pressão suave contínua para baixo no divisor para garantir que não haja vazamento ou mistura entre poços.Certifique-se de que não há bolhas de ar e o ovário permanece no centro do poço. Se a agarose pipeted perturbou o ovário, use suavemente a ponta da pipeta para centralizá-la antes que a agarose esfrie. Em seguida, incubar o slide a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada.Para coculturas divididas, corte divisores de plástico fino e liso. Os lados de uma bacia de mídia estéril e descartável são usados. Corte-os apenas largo o suficiente para caber snugly na hipotenusa do poço.Coloque o divisor de oito poços em cima do slide tratado pelo ITO e insira divisores plásticos na diagonal em poços. Prepare culturas celulares como feito anteriormente, e combine 100 microliters de suspensão celular e 100 microliters de agarose liquefeita em um tubo de dois mililitros. Imediatamente, a placa 150 microliters de mistura celular-agarose em um lado do divisor, mantendo a pressão para baixo sobre o divisor.Deixe agarose esfriar e solidificar por aproximadamente um minuto e, em seguida, remova o divisor. Use fórceps para colocar o ovário no centro da metade vazia do poço. Adicione 150 microliters de mistura celular-agarose sobre o topo do ovário.Incubar o slide a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada. Depois de quatro dias, remova o divisor de câmara dos plugues de agarose. Com uma espátula plana, retire os lados da agarose da câmara, e puxe suavemente a câmara para cima.Se algum plugue de garose for movido, reposicione-os suavemente para que não se toquem. Coloque o slide em um forno Celsius de 37 graus por aproximadamente quatro horas, e gire 90 graus a cada hora para garantir uma distribuição de calor uniforme em toda a amostra. O slide deve estar completamente seco.Caso contrário, pode levar a uma explosão da amostra no ambiente de alto vácuo do espectrômetro de massa MALDI-TOF. Secar o slide e monitorar o progresso é o passo mais crítico para alcançar alta resolução espacial e espectros de massa de qualidade. Se ocorrerem descamas ou rugas excessivas, não recomendamos a coleta dos dados de espectrometria de massa.Com os parâmetros definidos sobre o pulverizador de matriz, aplique solução de matriz ao slide. Para usar o Vermelho Fósforo como calibrante, adicione um microliter de Phosphorus Red a um ponto claro no slide. Para usar a mistura de peptídeo como calibrante, misture-a com matriz no Parafilm em uma proporção de um para um para ajudar a ionização, e local 0,5 a um microliter no slide.Aguarde que o calibrante seque antes da aquisição de dados de espectrometria de massa por imagem. Desenhe um X usando um marcador permanente em cada canto do slide e tire uma imagem óptica usando uma câmera ou um scanner a 1200 dpi. Neste experimento, o monitoramento cuidadoso do escorregador no forno é essencial para garantir um slide oto seco ideal, o que resulta em uma amostra dessecada plana com rugas mínimas a nenhuma na superfície da ágarose.Esta figura mostra as rugas que devem ser evitadas. Rugas podem afetar ligeiramente a altura e, portanto, a precisão de massa dos sinais de espectrometria de massa de imagem. Pequenas rugas não afetarão a qualidade dos dados.Um tecido localizado de forma ideal deve estar o mais próximo possível do centro. O tecido utilizado deve estar no centro do poço se não estiver dividido ou no centro do meio triângulo se for dividido para que a aquisição de dados do IMS não esteja contaminada com efeitos de borda. Tecido mal posicionado, quando visualizado, pode resultar em falsos sinais de massa dos efeitos da borda.A imagem de slides secos é usada para ensinar o espectrômetro de massa MALDI-TOF quais regiões para imagem. Pequenas regiões ao redor do tecido ovariano foram selecionadas para IMS a 50 micrômetros. Uma imagem representativa de um sinal m-over-z é mostrada para coculturas não divididas, bem como para a configuração dividida da câmara.O mais importante a ser lembrado é que os dados resultantes são tão bons quanto a preparação da amostra. Preste atenção especial ao processo de secagem. O aspecto mais emocionante é validar as pequenas moléculas descobertas dessa forma usando outros experimentos, como ensaios de invasão ou ensaios de colonização, para informar sobre a concentração efetiva e traduzir para a biologia humana.Esperamos que isso abra a porta para descobrir novos caminhos de potenciais alvos terapêuticos para o câncer de ovário, entendendo melhor os processos na metatese primária do câncer de ovário.

capturing-small-molecule-communication-between-tissues-cells-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

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Aqui, apresentamos protocolos para realizar imagens de espectrometria de massa ambiente (MSI) de tecidos e análise de MS de célula única viva (SCMS) in-situ usando a sonda única, que é um dispositivo multifuncional miniaturizado para análise de MS.

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Preparação de amostras para estudos metabolômicos de espectrometria de massa de célula única: lavagem, têmpera, secagem e armazenamento de células combinadas

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Aprenda a mapear a comunicação por pequenas moléculas entre células e tecidos usando espectrometria de massa por imagem sem marcação. Este método revela alvos terapêuticos em metástase de câncer de ovário.

Capturando a molécula pequena comunicação entre os tecidos e células usando a imagem latente de espectrometria de massa

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