Hibridação in situ da fluorescência quantitativa (peixes) e immunofluorescence (se) de produtos específicos do gene em pilhas KSHV-infectadas

O protocolo é útil para obter uma visão quantitativa sobre a regulação temporal de produtos genéticos virais, no contexto das células hospedeiras, especialmente em relação aos vírus herpes. Esta técnica pode ajudar a abordar questões de pesquisa relacionadas tanto ao hospedeiro quanto às proteínas e proteínas virais. Além disso, essa técnica é compatível com ensaios bioquímicos simultâneos.

Para aderir as células a oito lâminas de câmara, aplique 200 microliters de uma suspensão celular inerente a cada câmara de um estéril, oito lâminas de câmara e permitir o crescimento de sementes por 12-24 horas, a 37 graus Celsius, e 5% de dióxido de carbono. No final da incubação, aspire as células supernaciantes e não-sectadas, e fixar imediatamente as células com formaldeído pré-refrigerado de 4% em PBS no gelo, por 30 minutos. No final da fixação, lave as células com lavagens de três, cinco minutos em 200 microliters de 4 graus Celsius PBS por lavagem.

Após a última lavagem, permeabilize as células fixas com 200 microliters de 0,5% Triton-X pré-refrigerado em PBS por poço, por 10 minutos no gelo. No final da permeabilização, remova cuidadosamente as câmaras sem quebrar o slide e enxágue as células com PBS pré-refrigerado. Bloqueie as células enxaguadas com 4%BSA pré-refrigerado em PBS por 30 minutos a quatro graus Celsius, seguido de incubação com anticorpo primário policlonal apropriado de interesse em 0,1%BSA em PBS por uma hora, a quatro graus Celsius.

No final da incubação, lave as células três vezes com PBS fresco e incuba as células com um anticorpo secundário apropriado conjugado com um fluorofórico compatível com o anticorpo de detecção de PEIXEs por uma hora, a quatro graus Celsius. Após três lavagens de PBS como demonstrado, fixe as amostras novamente em 4% de formaldeído em PBS por 10-15 minutos antes de uma segunda permeablização como demonstrado. Em seguida, cubra o slide com papel alumínio para preservar o sinal fluorescente e evitar fotobleaching.

E lave as células com citrato de sódio salino 2x, antes de aplicar 45 microliters de solução de hibridização. Depois de uma hora a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada, adicione água destilada aos oligonucleotídeos antissamo-americanos de interesse para levar o volume de desinaturação a 10 microlitadores. Desnaturar os oligonucleotídeos a 95 graus Celsius por cinco minutos, antes de adicionar 35 microliters de solução de hibridização fresca por slide.

Em seguida, incubar as amostras de 10-24 horas na câmara umidificada a 37 graus Celsius, protegidas com papel alumínio. No dia seguinte, lave as células com dois, 10 minutos. 2X lavagem de citrato de sódio salino a temperatura ambiente, seguido de uma lavagem em 1X de citrato de sódio salino por 10 minutos, a 25 graus Celsius.

Após a última lavagem, fixar as células com pré-refrigerado 4% de formaldeído em PBS, por 10-15 minutos no gelo, seguido por três lavagens com PBS fresco. Em seguida, permeabilize as amostras como demonstrado, seguido de incubação com anti-dioxigenina FTC e pré-refrigerado 0,1%BSA na PBS, por uma hora a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave os slides três vezes em PBX fresco, e fixe as amostras com paraformaldeído pré-refrigerado de 4% em PBS, por 10-15 minutos a quatro graus Celsius.

Após três lavagens na PBS, rotule os núcleos com 0,4 microgramas por mililitro de DAPI e pré-refrigerados 0,5% Triton-X em PBS por 15 minutos no gelo, seguido por três lavagens finais em PBS. Monte lâminas com contas fluorescentes, como experimentalmente relevantes e em meio de montagem apropriado. Depois de remover o meio de montagem em excesso com lenços estéreis, sele uma mancha de tampa em cada slide com várias camadas de esmalte transparente e use um microscópio fluorescente para confirmar a execução bem sucedida do experimento.

As imagens podem então ser tiradas em um microscópio confocal para coletar imagens das amostras dentro de uma hora a uma semana de montagem, a uma ampliação de 630 vezes. Esses resultados representativos de PEIXEs e imunofluorescência são semiquantitativos e oferecem uma visão sobre a localização do oligonucleotídeo, em vez de comparações entre as intensidades das diferentes manchas fluorescentes, porque esses experimentos não incluíram uma conta fluorescente na preparação do slide. Nesses experimentos, as áreas citoplasmáticas e nucleares e suas proporções foram diferentes para células infectadas latentes e líticas de KSHV.

Conforme ilustrado nesta figura, a área é controlada na razão nucleocintísmica. Quando a replicação do DNA de KSHV é inibida na fase lítica, a proteína lítica inicial da transcrição de oligonucleotídeos KSHV muda para uma localização predominantemente citoplasmática. KSHV poliadenylated RNA, no entanto, localiza-se para locais nucleares específicos, apesar da inibição da replicação do DNA viral.

Ao remover as câmaras dos slides, tome cuidado para que haja muito pouco resíduo adesivo na ferramenta, e use etanol para permeablar as células e enfraquecer o adesivo. Ensaios bioquímicos como QPCR, mancha ocidental e sequenciamento de alto rendimento, podem ser realizados em conjunto para aumentar os dados quantitativos coletados dos micrografos.